Method Article

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&RUN bestimmt werden kann.

Abstract

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Die Bestimmung der Bindungsorte eines Proteins an Chromatin ist für das Verständnis seiner Funktion und potenzieller regulatorischer Ziele unerlässlich. Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist seit über 30 Jahren der Goldstandard für die Bestimmung der Proteinlokalisation und wird durch die Verwendung eines Antikörpers definiert, um das interessierende Protein aus beschalltem oder enzymatisch verdautem Chromatin herauszuziehen. In jüngster Zeit sind Antikörper-Tethering-Techniken aufgrund ihrer erhöhten Empfindlichkeit zur Beurteilung der Proteinlokalisation auf Chromatin populär geworden. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) ist das genomweite Derivat der Chromatin-Immunspaltung (ChIC) und verwendet rekombinantes Protein A, das an Mikrokokken-Nuklease (pA-MNase) gebunden ist, um die IgG-konstante Region des Antikörpers zu identifizieren, die auf ein Protein von Interesse abzielt, wodurch eine ortsspezifische Spaltung der DNA ermöglicht wird, die das interessierende Protein flankiert. CUT & RUN kann verwendet werden, um Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und andere Chromatin-bindende Proteine wie Nukleosomen-Umbaufaktoren zu profilieren. Wichtig ist, dass CUT&RUN verwendet werden kann, um die Lokalisation von entweder neuromatischen oder heterochromatisch assoziierten Proteinen und Histonmodifikationen zu beurteilen. Aus diesen Gründen ist CUT&RUN eine leistungsfähige Methode, um die Bindungsprofile einer Vielzahl von Proteinen zu bestimmen. Vor kurzem wurde CUT&RUN für die Profilierung von Transkriptionsfaktoren in niedrigen Zellpopulationen und Einzelzellen optimiert und das optimierte Protokoll wurde als Ultra-Low Input CUT&RUN (uliCUT&RUN) bezeichnet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellfaktorprofilierung mit uliCUT&RUN in einem manuellen 96-Well-Format vorgestellt.

Introduction

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Viele Kernproteine funktionieren, indem sie mit Chromatin interagieren, um DNA-vorlagenbasierte Aktivitäten zu fördern oder zu verhindern. Um die Funktion dieser Chromatin-interagierenden Proteine zu bestimmen, ist es wichtig, die genomischen Stellen zu identifizieren, an denen diese Proteine gebunden sind. Seit seiner Entwicklung im Jahr 1985 ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) der Goldstandard, um zu identifizieren, wo ein Protein an Chromatin 1,2 bindet. Die traditionelle ChIP-Technik hat den folgenden grundlegenden Arbeitsablauf: Zellen werden geerntet und vernetzt (in der Regel mit Formaldehyd), Chromatin geschoren wird (normalerweise mit harten Ultraschallmethoden, die eine Vernetzung erfordern), das interessierende Protein wird mit einem Antikörper, der auf das Protein abzielt (oder das Protein markiert), gefolgt von einem sekundären Antikörper (gekoppelt an Agarose oder magnetische Perlen) immunpräzipitiert, die Vernetzung wird umgekehrt, Protein und RNA werden verdaut, um DNA zu reinigen, und diese ChIP-angereicherte DNA wird als Vorlage für die Analyse verwendet (unter Verwendung der radioaktiv markierten Sonden1,2, qPCR 3, Microarrays 5,6 oder Sequenzierung4). Mit dem Aufkommen von Microarrays und massiv paralleler Tiefensequenzierung wurden ChIP-Chip 5,6 und ChIP-seq4 in jüngerer Zeit entwickelt und ermöglichen eine genomweite Identifizierung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Die Vernetzung von ChIP ist seit seiner Einführung eine leistungsstarke und zuverlässige Technik mit großen Fortschritten in der Auflösung durch ChIP-exo 7 und ChIP-nexus8. Parallel zur Entwicklung von ChIP-seq wurden native (nicht vernetzende) Protokolle für ChIP (N-ChIP) etabliert, die den Nukleaseaufschluss (oft unter Verwendung von Mikrokokkennuklease oder MNase) verwenden, um das Chromatin zu fragmentieren, im Gegensatz zur Beschallung, die in traditionellen Vernetzungs-ChIP-Techniken durchgeführt wird9. Ein großer Nachteil sowohl bei der Vernetzung von ChIP- als auch bei N-ChIP-Technologien war jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen aufgrund der geringen DNA-Ausbeute nach der experimentellen Manipulation. Daher wurden in den letzten Jahren viele Anstrengungen unternommen, um die ChIP-Technologien für einen geringen Zelleintrag zu optimieren. Diese Bemühungen haben zur Entwicklung vieler leistungsstarker ChIP-basierter Technologien geführt, die sich in ihrer Anwendbarkeit und ihren Eingabeanforderungen unterscheiden 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Es fehlen jedoch einzellige ChIP-seq-basierte Technologien, insbesondere für Nicht-Histon-Proteine.

Im Jahr 2004 wurde eine alternative Technologie entwickelt, um die Proteinbelegung von Chromatin zu bestimmen, die als Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) und Chromatin Immunocleavage (ChIC)19 bezeichnet wird. Diese Single-Locus-Techniken verwenden eine Fusion von MNase entweder zum interessierenden Protein (ChEC) oder zu Protein A (ChIC) zum direkten Schneiden von DNA neben dem interessierenden Protein. In den letzten Jahren wurden sowohl ChEC als auch ChIC für die genomweite Proteinprofilierung auf Chromatin (ChEC-seq bzw. CUT&RUN) optimiert.20,21. Während ChEC-seq eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung der Faktorlokalisierung ist, erfordert es die Entwicklung von MNase-Fusionsproteinen für jedes Ziel, während ChIC und seine genomweite Variation, CUT & RUN, auf einem Antikörper beruhen, der auf das interessierende Protein gerichtet ist (wie bei ChIP) und rekombinanter Protein-A-MNase, wobei das Protein A die IgG-konstante Region des Antikörpers erkennen kann. Als Alternative wurde eine Fusionsprotein-A/Protein-G-MNase (pA/G-MNase) entwickelt, die ein breiteres Spektrum von Antikörperkonstantenregionen erkennen kann22. CUT&RUN hat sich schnell zu einer beliebten Alternative zu ChIP-seq entwickelt, um die Proteinlokalisation auf dem gesamten Chromatin-Genom zu bestimmen.

Ultra-Low-Input CUT&RUN (uliCUT&RUN), eine Variante von CUT&RUN, die die Verwendung von Low- und Single-Cell-Inputs ermöglicht, wurde2019 23 beschrieben. Hier wird die Methodik für eine manuelle Einzelzellenanwendung im 96-Well-Format beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass seit der Entwicklung von uliCUT&RUN zwei Alternativen für die Histonprofilierung, CUT&Tag und iACT-seq, entwickelt wurden, die eine robuste und hochparallele Profilierung von Histonproteinenermöglichen 24,25. Darüber hinaus wurde scCUT&Tag für die Profilierung mehrerer Faktoren in einer einzelnen Zelle (multiCUT&Tag) und für die Anwendung auf Nicht-Histon-Proteineoptimiert 26. Zusammen bietet CUT&RUN eine attraktive Alternative zu Low-Input-ChIP-seq, bei der uliCUT&RUN in jedem molekularbiologischen Labor durchgeführt werden kann, das Zugang zu einem Zellsortierer und Standardausrüstung hat.

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Protocol

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Ethikerklärung: Alle Studien wurden vom Institutional Biosafety Office of Research Protections an der University of Pittsburgh genehmigt.

1. Bereiten Sie magnetische Perlen vor

HINWEIS: Vor der Zellsortierung durchführen und bis zum Gebrauch auf Eis halten.

  1. Pipette 30 μL ConA-konjugierte paramagnetische Mikrokugeln Perlenschlammmischung pro Reaktion zu einem frischen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen und 850 μL Bindungspuffer hinzufügen, vorsichtig zum Mischen pipettieren.
    HINWEIS: ConA-konjugierte paramagnetische Mikrosphären sind lektinbeschichtete magnetische Perlen, die eine Lipidmembranbindung ermöglichen.
  2. Legen Sie das Rohr auf ein Magnetgestell und lassen Sie die Perlen für 1-2 min magnetisieren. Sobald sich der Überstand geklärt hat, entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  3. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magnetgestell und waschen Sie die Perlen, indem Sie ihn in 1 ml Bindungspuffer wieder aufhängen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3.
  5. Magnetisieren Sie die Perlen für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand, um ihn zu entsorgen.
  6. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 30 μL Bindungspuffer pro Reaktion.
  7. Halten Sie die gewaschene Perlenmischung auf Eis, bis die Zellen sortiert sind.

2. Zellen ernten

HINWEIS: Dieser Schritt ist für adhärente Zellen geschrieben und für murine embryonale E14-Stammzellen optimiert. Die Kultivierung und Ernte der Zellen hängt vom Zelltyp ab.

  1. Entfernen Sie die Zellen aus dem 37 °C Inkubator und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop, um die Qualität zu gewährleisten.
  2. Saugen Sie das Medium von der Zellplatte ab und spülen Sie es mit 5 ml 1x PBS ab.
  3. Aspirieren Sie PBS von der Platte und ernten Sie die Zellen (mit traditionellen Zellerntemethoden, die sich je nach Zelltyp unterscheiden). Erhalten Sie eine einzellige Suspension, indem Sie bei Bedarf vorsichtig mit einer serologischen Pipette gegen die Kulturschale auf und ab pipettieren.
  4. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 ml konisches Rohr und drehen Sie es bei 200 x g für 5 Minuten nach unten.
  5. Absaugen Sie das Medium ab, um es zu entsorgen und das Zellpellet mit 5 ml PBS + 1% FBS zu waschen.
  6. Drehen Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min herunter, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml PBS + 1% FBS.
  7. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 1 ml von 1 x 10 6 Zellen in eine frische 1,5 ml Mikrofugenröhre.
  8. Fügen Sie 5 μL 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) hinzu, invertieren Sie das Röhrchen gut, um es zu mischen, und wenden Sie dann die Probe auf den Zellsortierer an, um lebende Einzelzellen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu sortieren.
    HINWEIS: 7-AAD-Farbstoff ist aus lebenden Zellen ausgeschlossen und kann daher in der Lebendzellsortierung verwendet werden.

3. Zellsortierung und Lyse

  1. Bereiten Sie vor der Zellsortierung eine Zellsortierer-kompatible 96-Well-Platte mit 100 μL Kernextraktionspuffer (NE) in jedem Bohrloch vor.
  2. Sortieren Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers in 96-Well-Platten.
  3. Drehen Sie schnell die Platte (600 x g für 30 s), um sicherzustellen, dass sich die Zellen im Puffer innerhalb der Vertiefungen befinden.
    HINWEIS: Es lohnt sich, in einem Vorversuch zu testen, ob die verwendeten Zellen zuverlässig auf den Grund der Vertiefungen gebracht werden.
  4. Halten Sie die Proben 15 min auf Eis.
  5. Die Proben bei 600 x g für 5 min bei 4 °C nach unten drehen und vorsichtig pipettieren, um den Überstand zu entfernen (wobei 5 μL zurückbleiben).
  6. Resuspendieren Sie jede Probe in 55 μL NE-Puffer und fügen Sie 30 μL der vorgewaschenen ConA-konjugierten paramagnetischen Mikrosphären (aus Schritt 1.7; im Bindungspuffer) zu jeder Reaktion hinzu.
  7. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.

4. Vorblockierung von Proben, um einen frühen Aufschluss durch MNase zu verhindern

  1. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie die Perlen mindestens 5 Minuten binden und entfernen Sie dann den Überstand.
  2. Fügen Sie 100 μL Blockierpuffer zu den kerngebundenen Perlen hinzu und mischen Sie sie mit sanftem Pipettieren.
  3. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.

5. Zugabe von primären Antikörpern

  1. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten aufräumen, und entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  2. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 100 μL Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren.
  3. Legen Sie die Platte wieder auf das 96-Well-Magnetrack, lassen Sie den Überstand aufräumen, entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand.
  4. Resuspendieren Sie die Perlen in 25 μL Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren.
  5. Machen Sie einen primären Antikörper-Master-Mix: 25 μL Waschpuffer + 0,5 μL Antikörper pro Reaktion.
  6. Während Sie die kerngebundenen Kügelchen vorsichtig wirbeln, fügen Sie 25 μL der primären Antikörper-Mastermischung zu jeder Probe hinzu, die mit einem Antikörper behandelt wird, der auf das interessierende Protein abzielt (typischerweise 1:100 endgültige Verdünnung). Fügen Sie 25 μL Waschpuffer ohne Antikörper hinzu, wenn Sie eine Kontrolle durchführen.
  7. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Legen Sie die Proben auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten freiwerden, und entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  9. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und waschen Sie die Perlen mit 100 μL Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch Pipettieren.

6. Zugabe von pA-MNase oder pA/G-MNase

HINWEIS: Protein A hat eine hohe Affinität für IgG-Moleküle bestimmter Spezies wie Kaninchen, ist aber nicht für IgGs von anderen Spezies wie Mäusen oder Ratten geeignet. Alternativ kann Protein A/G-MNase verwendet werden. Dieser Hybrid bindet Kaninchen-, Maus- und Ratten-IgGs und vermeidet die Notwendigkeit sekundärer Antikörper, wenn primäre Antikörper von Mäusen oder Ratten verwendet werden.

  1. Legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten freiwerden, und entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  2. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie jede Probe in 25 μL Waschpuffer.
  3. Machen Sie eine pA-MNase-Mastermischung (25 μL Waschpuffer + optimierte Menge an pA-MNase pro Reaktion).
  4. Während Sie vorsichtig wirbeln, fügen Sie jeder Probe, einschließlich der Kontrollproben, 25 μL des pA-MNase-Mastermixes hinzu.
    HINWEIS: Die Konzentration der pA-MNase variiert je nach Zubereitung, wenn sie hausgemacht ist, und sollte vor der Anwendung bei jeder unabhängigen Reinigung getestet werden. Für die pA/G-MNase sollten 2,5 μL der 20-fachen Ware verwendet werden.
  5. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten aufräumen, und entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  7. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und waschen Sie die Perlen mit 100 μL Wash Buffer, wobei Sie durch leichtes Pipettieren wieder aufhängen.

7. Gerichtete DNA-Verdauung

  1. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetgestell, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten freiwerden, und entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn.
  2. Entfernen Sie die Proben aus dem magnetischen Rack und suspendieren Sie die Perlen in 50 μL Wash Buffer durch sanftes Pipettieren.
  3. Die Proben in einem Eis/Wasser-Gemisch 5 min auf 0 °C ausgleichen.
  4. Entfernen Sie die Proben aus dem 0 °C Eis-/Wasserbad und fügen Sie 1 μL 100 mM CaCl2 mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie gut (3-5 mal) mit sanftem Pipettieren mit einer mehrkanaligen Pipette mit größerem Volumen und bringen Sie die Proben dann auf 0 ° C zurück.
    HINWEIS: Hier ist es wichtig, gut zu mischen. CaCl2 wird hinzugefügt, um die MNase-Verdauung von DNA zu aktivieren, die das interessierende Protein flankiert.
  5. Starten Sie einen 10-Minuten-Timer, sobald die Platte wieder im Eis- / Wasserbad ist.
  6. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 μL 2XRSTOP+ Puffer in jede Vertiefung pipettieren, in der gleichen Reihenfolge, in der derCaCl2 hinzugefügt wurde.
    HINWEIS: Machen Sie 2XRSTOP+ Puffer, bevor die 10-minütige Verdauung vorbei ist, um eine Überverdauung zu verhindern.

8. Probenfraktionierung

  1. Inkubieren Sie die Proben für 20 min bei 37 °C.
  2. Drehen Sie die Platte bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.
  3. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack, lassen Sie den Überstand für mindestens 5 Minuten freiwerden, und übertragen Sie Überstände auf eine frische 96-Well-Platte. Verwerfen Sie die Perlen.

9. DNA-Extraktion

  1. 1 μL 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,83 μL 20 mg/ml Proteinase K zu jeder Probe geben.
    ACHTUNG: SDS-Pulver ist schädlich, wenn es inhaliert wird. Benutzer sollten in gut belüfteten Räumen eine Schutzbrille, Handschuhe und ein Atemschutzgerät der Klasse N95 tragen und vorsichtig damit umgehen.
  2. Mischen Sie die Proben durch sanftes Pipettieren.
  3. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei 70 °C.
  4. Stellen Sie die Platte auf Raumtemperatur zurück und fügen Sie 46,6 μL 5 M NaCl und 90 μL 50% PEG 4000 hinzu. Durch leichtes Pipettieren vermischen.
  5. 33 μL Polystyrol-Magnetit-Perlen zu jeder Probe geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, Polystyrol-Magnetit-Perlen auf Raumtemperatur (~ 30 min) zu bringen und vor der Verwendung gut zu mischen.
  6. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack und lassen Sie den Überstand für ~ 5 Minuten aufräumen, und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  7. 2x mit 150 μL 80% Ethanol abspülen, ohne die Perlen zu stören.
    ACHTUNG: Ethanol ist leicht entzündlich und verursacht Haut-, Augen- und Lungenreizungen. Führen Sie diesen Schritt mit geeigneter Laborkleidung und in einer belüfteten Kapuze durch.
  8. Drehen Sie die Platte kurz bei 1000 x g für 30 s. Legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetrack und entfernen Sie alle verbleibenden EtOH, ohne die Perlen zu stören.
  9. Trocknen Sie die Proben für ~ 2-5 min an der Luft.
    HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht länger als 5 min. Wenn Sie fleißig über das Entfernen des EtOH sind, sind 2-3 Minuten Trocknung ausreichend.
  10. Resuspendieren Sie die Perlen mit 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
  11. Legen Sie die Platte auf ein Magnetgestell und lassen Sie die Perlen für 5 Minuten binden.
  12. Übertragen Sie 36,5 μL des Überstands auf eine frische Thermocycler-kompatible 96-Well-Platte. Verwerfen Sie die Perlen.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier gestoppt werden, indem Proben bei -20 °C gespeichert werden, oder es kann mit dem Bibliotheksaufbau fortgesetzt werden (Schritte 10-15).

10. Endreparatur, Phosphorylierung, Adenylierung

HINWEIS: Die Reagenzien werden wie in der Materialtabelle referenziert bezogen. Das folgende Protokoll folgt einer ähnlichen Methode wie das kommerzielle Kit wie das NEBNext Ultra DNA II-Kit.

  1. Verdünnen Sie 5 U/μL T4-DNA-Polymerase 1:20 in 1x T4-DNA-Ligasepuffer.
  2. Bereiten Sie einen Endreparatur-/3'A-Mastermix vor: 2 μL 10x T4-DNA-Ligasepuffer, 2,5 μL 10 mM dNTPs, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL 4000 PEG, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL verdünnte T4-DNA-Polymerase, 0,5 μL 5U/μL Taq-DNA-Polymerase mit einem Gesamtvolumen von 13,5 μL pro Reaktion.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, 40% PEG 4000 vor dem Pipettieren auf Raumtemperatur zu bringen.
  3. 13,5 μL Endreparatur/3'A Mastermix zu 36,5 μL DNA hinzufügen.
  4. Mischen Sie die Reaktion durch schnellen Wirbel und dann einen schnellen Spin (500 x g für 10 s).
  5. Inkubieren unter folgenden Reaktionsbedingungen in einem vorgekühlten Thermocycler mit beheiztem Deckel für Temperaturen >20 °C. Verwenden Sie die Reaktionsbedingungen: 12 °C für 15 min, 37 °C für 15 min, 72 °C für 20 min, halten bei 4 °C.

11. Adapterligatur

HINWEIS: Halten Sie die Proben auf Eis, während Sie die folgende Reaktion durchführen. Lassen Sie den Ligasepuffer vor dem Pipettieren auf Raumtemperatur kommen. Der Adapter (siehe Materialtabelle) wird in einer Lösung von 10 mM Tris-HCl mit 10 mM NaCl (pH 7,5) verdünnt. Aufgrund der geringen Ausbeute sollte die mit CUT&RUN angereicherte DNA nicht vorquantifiziert werden. Erzeugen Sie stattdessen 25-fache Verdünnungen des Adapters unter Verwendung einer endgültigen Arbeitsadapterkonzentration von 0,6 μM.

  1. Machen Sie eine Ligationsmastermischung: 55 μL Ligasepuffer (2x), 5 μL T4-DNA-Ligase und 5 μL verdünnter Adapter mit einem Gesamtvolumen von 65 μL pro Reaktion.
  2. 65 μL der Master-Ligationsmischung zu 50 μL DNA aus Schritt 10.5 hinzufügen.
  3. Mischen Sie durch schnelles Vortexen, gefolgt von schnellem Spinnen (500 x g für 10 s).
  4. Bei 20 °C in einem Thermocycler (ohne beheizten Deckel) 15 min inkubieren.
    HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem folgenden Schritt fort.

12. BENUTZERVERDAUUNG

  1. Fügen Sie 3 μL USER-Enzym zu jeder Probe, jedem Wirbel und jedem Spin hinzu (500 x g für 10 s).
  2. Inkubieren Sie im Thermocycler bei 37 °C für 15 min (beheizter Deckel auf 50 °C eingestellt).

13. Reinigung von Polystyrol-Magnetit-Perlen nach Ligationsreaktion

HINWEIS: Lassen Sie Polystyrol-Magnetit-Perlen bei Raumtemperatur (~ 30 min) ausgleichen. Vortex, um die Perlenlösung vor der Verwendung zu homogenisieren. Führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur aus.

  1. Fügen Sie 39 μL (0,33x) Polystyrol-Magnetit-Perlenlösung zu jeder Vertiefung hinzu, die adapterligierte DNA enthält.
  2. Gründlich durch Pipettieren mischen und dann die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren, damit sich die DNA an die Perlen binden kann.
  3. Legen Sie die Proben auf ein 96-Well-Magnetrack und inkubieren Sie für 5 Minuten, bis der Überstand klar ist.
  4. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  5. Spülen Sie die Perlen mit 200 μL 80% EtOH ab, ohne die Perlen zu stören.
  6. Inkubieren Sie für 30 s auf einem 96-Well-Magnetrack, damit die Lösung frei werden kann.
  7. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 13.5-13.7 für insgesamt zwei Wäschen.
  9. Drehen Sie die Platte kurz bei 500 x g für 10 s, legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetrack und entfernen Sie den verbleibenden EtOH, ohne die Perlen zu stören.
  10. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und trocknen Sie die Proben 2 Minuten lang an der Luft.
    HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu viel.
  11. Entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen Rack und suspendieren Sie die Perlen in 28,5 μL von 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    ACHTUNG: Salzsäure ist sehr korrosiv. Benutzer sollten es vorsichtig in einer chemischen Abzugskapuze mit Schutzbrille, Handschuhen und einem Laborkittel behandeln.
  12. Suspendieren Sie die Perlen gründlich durch Pipettieren und achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen.
  13. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  14. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie die Lösung für 5 Minuten freiwerden.
  15. Übertragen Sie 27,5 μL Überstand auf eine neue PCR-Platte und entsorgen Sie die Perlen.

14. Bibliotheksanreicherung

HINWEIS: Primer werden mit der gleichen Lösung wie der Adapter verdünnt. Verwenden Sie für diesen Bibliotheksaufbau eine endgültige Arbeitsprimerkonzentration von 0,6 μM.

  1. Zu jeder Probe werden 5 μL verdünnter indizierter Primer (siehe Materialtabelle) gegeben.
    HINWEIS: Jede Probe benötigt einen anderen Index, um nach der Sequenzierung identifiziert zu werden.
  2. Bereiten Sie einen PCR-Master-Mix vor: 10 μL 5x High-Fidelity-PCR-Puffer, 1,5 μL 10 mM dNTPs, 5 μL verdünnter Universal-Primer, 1 μL 1 HE-Hotstart-High-Fidelity-Polymerase mit einem Gesamtmastermixvolumen von 17,5 μL pro Probe.
  3. 17,5 μL pf PCR-Mix zu 32,5 μL gereinigter adapterligierter DNA hinzufügen (5 μL indizierter Primer sind in diesem Volumen enthalten).
  4. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren.
  5. Inkubieren Sie in einem Thermocycler unter folgenden Reaktionsbedingungen mit einer maximalen Anlaufgeschwindigkeit von 3 °C/s: 98 °C für 45 s, 98 °C für 45 s, 60 °C für 10 s, wiederholen Sie den zweiten und dritten Schritt 21 Mal, 72 °C für 1 min, halten Sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Die Proben können bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung oder -20 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt werden.

15. Reinigung von Polystyrol-Magnetit-Perlen

  1. Jeder Probe werden 60 μL (1,2x) Polystyrol-Magnetit-Perlen hinzugefügt.
  2. Suspendieren Sie die Perlen durch Pipettieren und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur.
  3. Legen Sie die Platte für 5 Minuten auf ein Magnetgestell, bis die Lösung klar ist.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Perlen mit 200 μL 80% EtOH ab, ohne die Perlen zu stören.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt für insgesamt zwei 80% EtOH-Wäschen.
  6. Drehen Sie die Platte bei 500 x g für 10 s, legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetgestell und lassen Sie die Perlen für 5 Minuten binden.
  7. Pipette, um überschüssiges EtOH zu entfernen, ohne die Perlen zu stören, und lassen Sie die Perlen 2 Minuten lang an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu viel.
  8. Suspendieren Sie die Perlen in 21 μL nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  9. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack und lassen Sie die Lösung für 5 Minuten freiwerden.
  10. Übertragen Sie 20 μL des Überstands auf eine neue Platte.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier gestoppt werden, indem die Probe bei -20 °C gelagert wird.
  11. Quantifizieren Sie Bibliothekskonzentrationen mit einem Fluorometer (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines 1x HS-Reagenzes.
  12. Wenn die Konzentration es zulässt, lassen Sie 30 ng Probe auf 1,5% Agarosegel mit einer niedermolekularen Leiter zur Visualisierung laufen. Alternativ können Sie auf einem Fragment Analyzer oder einem verwandten Instrument visualisieren.
  13. Sequenzbibliotheken auf einer Illumina-Plattform, um ~ 50.000-100.000 eindeutig zugeordnete Lesevorgänge zu erhalten.

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Results

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Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellproteinprofilierung auf Chromatin unter Verwendung eines manuellen 96-Well-Formats uliCUT & RUN vorgestellt. Während die Ergebnisse basierend auf dem Profiling des Proteins (aufgrund der Proteinhäufigkeit und der Antikörperqualität), dem Zelltyp und anderen beitragenden Faktoren variieren, werden die erwarteten Ergebnisse für diese Technik hier diskutiert. Die Zellqualität (Zellaussehen und Prozentsatz der lebensfähigen Zellen) und die Einzelzellsortierung sollt...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN ist ein effektives Protokoll zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Es hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen Protokollen, einschließlich: 1) hohes Signal-Rausch-Verhältnis, 2) schnelles Protokoll und 3) niedrige Sequenzierungsleseabdeckung erforderlich, was zu Kosteneinsparungen führt. Die Verwendung von Protein A- oder Protein A/G-MNase ermöglicht die Anwendung von CUT&RUN mit jedem verfügbaren Antikörper; Daher hat es das Potenzial, viele Proteine schnell und einfach zu profilieren. Die Anpa...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit diesem Projekt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Mitgliedern des Hainer Lab für die Lektüre und Kommentare zu einer früheren Version dieses Manuskripts. Dieses Projekt verwendete den NextSeq500, der am Health Sciences Sequencing Core der University of Pittsburgh am UPMC Children's Hospital of Pittsburgh für die Sequenzierung verfügbar ist, mit besonderem Dank an seinen Direktor, William MacDonald. Diese Forschung wurde zum Teil vom University of Pittsburgh Center for Research Computing durch die bereitgestellten Computerressourcen unterstützt. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant Nummer R35GM133732 (zu S.J.H.) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL durchsichtige Mikrofuge-RöhrchenThermoFisher Scientific90410
1,5 mL Röhrchen MagnetgestellThermoFisher Scientific12321D
1,5 mL Röhrchen-kompatible KaltzentrifugeEppendorf5404000537
10 cm sterile GewebekulturplattenThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA-Ligase-PufferNeu England BiolabsB0202S
15 mL konische RöhrchenVWR89039-656
1X TE PufferThermoFisher Scientific12090015
200 & Mikro; L PCR-RöhrchenEppendorf951010022
2X Quick Ligase PufferNew England BiolabsM2200Ligase Buffer
5X KAPA HiFi PufferRoche79588890015X High Fidelity PCR Puffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96-Well MagnetgestellThermoFisher Scientific12027 oder 12331D
96-Well-PlatteVWR82006-636
AMPure XP-KügelchenBeckman CoulterA63881Polystyrol-Magnetit-Kügelchen; Aufgrund der möglichen Variabilität zwischen den AMPure XP-Bead-Chargen wird empfohlen, Ihre AMPure-Bead-Lösung zu kalibrieren. Siehe Hersteller" s Anweisungen
Antikörper gegen Protein von Interessevariiert
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A-KügelchenPolysciences86057-10ConA-konjugierte paramagnetische Mikrosphären
BSA
Calciumchlorid (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
ZellsortiererBD FACSAria II ZellsortiererErfordert eine Schulung
Zellspezifische Medien für die ZellkulturVariiert
ChloroformThermoFisher ScientificC298-500Chloroform ist hautreizend und schädlich beim Verschlucken; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille
Computer mit 64-Bit-Prozessor und Zugang zu einem Super-Computing-ClusterFür computergestützte Analysen von resultierenden Sequenzierungsdatensätzen
DNA-Spin-SäulenEpoch Life Sciences1920-250
dNTP-SetNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
Elektrophorese-Gerätevariieren
EthanolFisher Scientific22032601100% vol/vol Ethanol ist leicht entflammbar; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel, und Schutzbrille
Ethylendiamintetraessigsäure  (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GlycerinFisher ScientificBP229-1
GlykogenVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Heterologe S. cerevisiae DNA Spike-inhausgemachtHergestellt aus vernetzter, MNase-verdauter und Agarosegel-extrahierter genomischer DNA, die von Protein/RNA gereinigt und auf 10 ng/ml verdünnt wurde. Wir empfehlen genomische Hefe-DNA, aber bei Bedarf können auch andere Organismen verwendet werden.
Salzsäure  (HCl)FisherScientific A144-212Salzsäure ist sehr korrosiv; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille
Iskübelvariiert
Illumina Sequenzierplattform (z. B. NextSeq500)Illumina
Inkubator mit Temperatur- und AtmosphärenregelungThermoFisher Scientific51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase mit 5X KAPA HiFi PufferRoche7958889001Hotstart High Fidelity Polymerase
Laminar Flow HoodBakery CompanySG404
Manganchlorid (MnCl2)Sigma Aldrich244589
MikropipettensetRainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
NEB AdapterNew England BiolabsE6612AVIALAdapter NEB
Universal PrimerNew England BiolabsE6611AVIALUniversal Primer
NEBNext Multiplex Oligos für Illumina KitNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LIndexierte Primer
Antikörper mit NegativkontrolleAntikörper-Online-ABIN101961
Nukleasefreies WasserNew England BiolabsB1500S
PCR-ThermocyclerEppendorf2231000666
Qiagen129046
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI)ThermoFisher Scientific15593049 Phenol ist schädlich beim Verschlucken oder bei Hautkontakt; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille
Phsophat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
PipettenhilfeDrummond Scientific# 4-000-100
Polyethylenglykol (PEG) 4000VWRA16151
Kaliumchlorid (KCl)Sigma AldrichP3911
Kaliumhydroxid (KOH)Fisher ScientificP250-1VORSICHT KOH ist ein Augen-/Hautreizmittel als fester und ätzender Stoff in Lösung. Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, einem Laborkittel und einer Schutzbrille
Protease-InhibitorenThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, gereinigt aus pK19pA-MNAddgene86973
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ33230
Qubit Assay-RöhrchenThermoFisher ScientificQ32856
Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ33238
Quick Ligase mit 2X Quick Ligase PufferNew England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
Natriumacetat  (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Natriumchlorid (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Natriumdodecylsulfat (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS ist giftig, wenn es eingeatmet wird; in gut belüfteten Räumen vorsichtig mit Handschuhen, Augenschutz und einer Atemschutzmaske der Güteklasse N95 behandeln, wenn
Natriumhydroxid (NaOH)Fisher ScientificS318-1umgehenNaOH ist ein Augen-/Hautreizmittel als Feststoff und ätzend in Lösung. Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille
SpermidinSigma AldrichS2626
Standard Inverses LichtmikroskopLeica11526213
Standard-Labor-Agarose-GelmaterialienVariiert
Standard-Labormaterialien wie serologische Pipetten und PipettenspitzenVariiert
T4-DNA-LigaseNeu England BiolabsM0202S
T4 DNA PolymeraseNew England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Tabletop VortexerFisher Scientific2215414
Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0273S
ThermomixerEppendorf5384000020Alternativ, kann ein Wasserbad verwenden
Tris-BasisFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 ist gefährlich; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie
mit TrypsinFisher ScientificMT25052
RöhrenrotatorVWR10136084
USER EnzymNew England BiolabsM5505S
Phase-Lock-Röhrchen mit umgehen

References

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