Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.
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Methodenartikel
Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die retinale pigmentierte Epithelschicht (RPE) liegt unmittelbar hinter den Photorezeptoren und beherbergt ein komplexes Stoffwechselsystem, das mehrere entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Photorezeptoren spielt. Daher sind die RPE-Struktur und -Funktion unerlässlich, um ein normales Sehvermögen aufrechtzuerhalten. Dieses Manuskript stellt ein etabliertes Protokoll für die primäre RPE-Zellisolierung von Mäusen vor. Die RPE-Isolierung ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RPE-Pathologie in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die RPE-Isolierung helfen, primäre Maus-RPE-Zellen zu vergleichen, die aus Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie Medikamente zu testen, die die Entwicklung von Therapien für Sehstörungen beschleunigen können. Das Manuskript stellt ein schrittweises RPE-Isolationsprotokoll vor; Der gesamte Vorgang von der Enukleation bis zur Aussaat dauert ca. 4 Stunden. Das Medium sollte 5-7 Tage nach der Aussaat nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungestört wachsen können. Diesem Prozess folgt die Charakterisierung von Morphologie, Pigmentierung und spezifischen Markern in den Zellen mittels Immunfluoreszenz. Zellen können maximal drei- oder viermal durchlaufen werden.
Einleitung
Retinale pigmentierte Epithelzellen (RPE) befinden sich zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut und bilden eine einfache Monoschicht von quaderförmigen Zellen, die hinter den Photorezeptorzellen (PR) liegen1. Das RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Umgebung für PR-Zellen, hauptsächlich durch die Verringerung der übermäßigen Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der daraus resultierenden oxidativen Schäden1. RPE-Zellen überwachen viele Funktionen, wie die Umwandlung und Speicherung von Retinoide, die Absorption von Streulicht, den Flüssigkeits- und Ionentranspor....
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Protokoll
Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien des IACUC-Tierprotokolls Nr. 21063 der Universität Oakland und den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie das komplette RPE-Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) mit 25% fetalem Rinderserum (FBS), 1,5% Penicillin / Streptomycin und 0,02% Gentamicin ergänzen.
- Bereiten Sie Enzym A vor, indem Sie 741 μL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 127 μL Kollagenase-Stammlösung und 132 μL Hyaluronidase-Stammlösun....
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Ergebnisse
Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion/-bildung isolierter RPE-Zellen
Die isolierten Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit, Morphologie und Pigmentierung zu überprüfen. Bilder von P0 und P1 (Abbildung 1A,B) und Bilder von P0 und P4 wurden aufgenommen (Abbildung 1C,D), um die Veränderungen in den Zellen zu zeigen; Form, Größe und Pigmentierung, als die Passagen zur viert.......
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Diskussion
Das aktuelle Protokoll ist ein berichtetes, modifiziertes und vereinfachtes detailliertes Verfahren zur RPE-Isolierung von Mausaugen. Das Protokoll umfasst Enukleation, Dissektion, Sammlung, Seeding, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden.
Es gibt einige Einschränkungen und kritische Schritte, die für eine erfolgreiche RPE-Isolierung erfüllt werden müssen, z. B. das Alter der Mäuse, die Anzahl der sezierten Augen, die Größe der Gewebekulturplatte oder -s.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären, die für den Inhalt dieses Artikels relevant sind.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) Fonds R01 EY029751-04
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Becher : 100 ml | KIMAX | 14000 | |
| Kollagenase aus Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | Für arbeitende Enzyme, A |
| Einweg-Messpipetten: 3,2 ml steril | 13-711-20 | ||
| DMEM / F12 | & nbsp; gibco | 11330 | Medien zur Züchtung von RPE-Zellen |
| Fötales Rinderserum (FBS) | gibco | 26140079 | Für vollständige RPE-Zellkulturmedien |
| Gentamicin-Reagenzlösung | gibco | 15750-060 | Für vollständige RPE-Zellkulturmedien |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | Für funktionierende Enzyme (A& B) |
| Heracell VISO 160i CO2-Inkubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase aus Rinderhoden | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | Für das Arbeitsenzym A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Spritze mit aufgesetzter Nadel 21 G x 1 1/2 Zoll, steril, Einmalgebrauch, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Monoklonaler Maus-Anti-RPE65-Antikörper | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | Für IF-Färbungen |
| Pen Strup | gibco | 15140-122 | Für komplette RPE-Zellkulturmedien |
| Positive Action Pinzette, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Schere Iris Standard Gerade 11,5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Zentrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Mikroskop | Zeiss | n/a | |
| Chirurgische Klinge, #11, | Bard-Parker | 371211 Suspensionskulturschale | |
| 60 mm x 15 mm | Corning | 430589 | |
| Gewebekulturschale: 100x20 mm Corning | 353003 | ||
| Tornado-Röhrchen: 15 mL | Midsci | C15B | |
| Tornado-Röhrchen: 50 mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0,25% | gibco | 2186962 | Für die Arbeit mit Enzym B |
| Pinzette 5MS, 8,2 cm, gerade, 0,09 x 0,05 mm Spitzen | Dumont | 501764 | |
| Pinzette Positive Action Style 5, biologisch, Dumostar, poliertes Finish, 110 mm OAL | Elektronenmikroskopie Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Unterlagepolster, mittel : 23" x 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Federschere - 2,5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Referenzen
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
