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Methodenartikel

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

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DOI:

10.3791/63546

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12. Mai 2022

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1Wits Research Institute for Malaria, School of Pathology, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2Centre for Emerging Zoonotic and Parasitic Diseases, National Institute for Communicable Diseases, National Health Laboratory Service

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Zusammenfassung

Malaria ist nach wie vor eine der verheerendsten Krankheiten weltweit und bis heute ist die afrikanische Region für 94% aller Fälle weltweit verantwortlich. Diese parasitäre Krankheit erfordert einen Protozoenparasiten, einen Anopheles-Mückenvektor und einen Wirbeltierwirt. Die Gattung Anopheles umfasst mehr als 500 Arten, von denen 60 als Vektoren des Parasiten bekannt sind. Die Gattung Plasmodium parasite besteht aus 250 Arten, von denen 48 an der Übertragung von Krankheiten beteiligt sind. Darüber hinaus hat der Parasit Plasmodium falciparum in den letzten Jahren zu schätzungsweise 99,7% der Malariafälle in Afrika südlich der Sahara beigetragen.

Gametozyten sind Teil des sexuellen Stadiums des Parasiten und werden von der weiblichen Mücke aufgenommen, wenn sie sich von einem infizierten menschlichen Wirt ernährt. Die weitere Entwicklung des Parasiten innerhalb der Mücke wird durch günstige Umweltbedingungen im Mittelbauch der Mücke verstärkt. Hier findet die Verschmelzung der weiblichen und männlichen Gameten statt, und die beweglichen Ookinetes entstehen. Die Ookinetes dringen in das Mitteldarmepithel der Mücke ein, und reife Ookinetes bilden Oozysten, die wiederum bewegliche Sporozoite produzieren. Diese Sporozoiten wandern zu den Speicheldrüsen der Mücke und werden injiziert, wenn eine Mücke eine Blutmahlzeit einnimmt.

Für die Wirkstoffforschung wurden Moskitos künstlich mit Gametozyten-infiziertem Blut im Standard-Membranfütterungstest (SMFA) infiziert. Um eine Infektion innerhalb der Mücke zu erkennen und/oder die Wirksamkeit von Malariamitteln zu beurteilen, wurden die Mitteleingeweide der weiblichen Moskitos nach der Infektion entfernt und mit Mercurochrom angefärbt. Diese Methode wurde verwendet, um die visuelle Erkennung von Oozysten unter dem Mikroskop für die genaue Bestimmung der Oozystenprävalenz und -intensität zu verbessern.

Einleitung

Malaria, bekannt als eine der zerstörerischsten Krankheiten weltweit, stellt immer noch eine große Bedrohung für mehrere Länder dar - insbesondere für diejenigen in der afrikanischen Region - und trägt zu etwa 95% der Fälle weltweit bei1. Diese Krankheit wird durch einen Protozoenparasiten verursacht und zusammen mit seinem Anopheles-Mückenvektor können diese Täter dem menschlichen Wirt großen Schaden zufügen2. Genauer gesagt ist die Falciparum-Art der Gattung Plasmodium parasite für schätzungsweise 99% der Malariafälle in Afrika südlich der Saharaverantwortlich 1. Darüber hinaus könnten mehrere wichtige Anopheles-Mückenvektoren (einschließlich An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. und An. funestus Giles) für mehr als 95% der weltweiten Parasitenübertragung verantwortlich gemacht werden 3,4,5,6,7,8 . Damit die ideale Parasiten-Vektor-Gesellschaft hergestellt werden kann, sollte der Moskitovektor anfällig für den Parasiten sein und in der Lage sein, ihn zu übertragen9. Darüber hinaus sollten sowohl der Vektor als auch der Parasit physische Barrieren überwinden, um die perfekte infektiöse Kombination zu bilden - der Moskitovektor sollte in der Lage sein, die Parasitenentwicklung aufrechtzuerhalten, und der Parasit sollte die Fähigkeit haben, die Abwehrmechanismen des Wirts zu überwinden10,11.

Gametozyten, das Sexualstadium des Parasiten P. falciparum, spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbindung der Vektor- und Parasitenpartner12. Die sexuelle Entwicklung findet in vivo statt, und die Gametozytogenese beschreibt den Prozess der Differenzierung reifer Gametozyten in bewegliche männliche Mikrogameten und weibliche Makrogameten13. Ein weiterer Prozess, der innerhalb der Mücke stattfindet, ist die Exflagellation - der Prozess, bei dem sich der männliche Gametozyt in Gameten verwandelt und aus den roten Blutkörperchen austritt, die während einer Blutmahlzeit aufgenommen werden11. Es wird ferner vorgeschlagen, dass der Exflagellationsprozess durch eine günstige Veränderung der Umgebung des Mückenmitteldarms verstärkt wird14. Nach der Exflagellation wird durch die Verschmelzung der männlichen und weiblichen Gameten eine Zygote gebildet13. Aus der Zygote entsteht eine bewegliche Ookinete und bewegt sich von der Blutmahlzeit zum Epithel des Mückenmitteldarms13. Hier reift die Ookinete heran und es bildet sich eine Oozyste, die wiederum bewegliche Sporozoiten13,15 produziert. Die Sporozoiten wandern dann zu den Speicheldrüsen der Mücken, und wenn die Mücke eine Blutmahlzeit von ihrem Wirt nimmt, werden diese Sporozoiten in den Blutkreislauf des Wirts injiziert15.

Interventionen zur Malariabekämpfung, die Vektorkontrollstrategien und den Einsatz wirksamer Malariamedikamente kombinieren, sind bei der Bekämpfung dieser Krankheit von entscheidender Bedeutung geworden15. Mit zunehmender Resistenz gegen Parasiten und Moskitos steigt die Dringlichkeit der Identifizierung neuartiger Malariamittel16. Daher ist die in vivo Bewertung von transmissionsblockierenden Verbindungen wichtig16. Nach der Entwicklung solcher wirksamen übertragungsblockierenden Medikamente wurde das SMFA verwendet, um zu beurteilen, ob diese Verbindungen die sexuelle Entwicklung von P. falciparum in der Anopheles-Mücke hemmen 17,18,19. Dieser Assay hat seit den 1970-1980er Jahren Anerkennung als Goldstandard für die Bewertung der Übertragungsblockierung20,21 erlangt. Dieser Assay bietet eine billigere Alternative als andere Assays wie RT-qPCR, die spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus werden keine Patienten benötigt, um die Experimente durchzuführen. Dieser Assay beinhaltet auch die Bereitstellung von Gametozyten-induziertem Blut an weibliche Moskitos, die dann seziert werden, um zu beurteilen, ob eine Oozystenentwicklung vorliegt21. Dies ermöglicht die Gametozytenquantifizierung und den Nachweis deformierter Oozysten aufgrund der Verbindungen22. Damit eine Verbindung als wirksam eingestuft werden kann, müssen die Prävalenz (der Anteil der Moskitos, die mindestens eine Oozyste im Mitteldarm beherbergen) und die Anzahl der Oozysten (Intensität) im Mückenmitteldarm bewertet werden, um die Infektionshemmung zu beurteilen 17,21,22.

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Protokoll

Abbildung 1 zeigt das Protokoll. Die Ethikkommission für Gesundheitswissenschaften der Universität Pretoria (506/2018) hat eine ethische Freigabe für die Entnahme und Verwendung von menschlichem Blut erhalten.

1. Gametozytenkultur

HINWEIS: Vor der Einrichtung des SMFA wurde an der Universität von Pretoria eine Gametozytenkultur vorbereitet (siehe Reader et al.22 für das vollständige Protokoll).

  1. Bereiten Sie eine Gametozytenkultur vor, die aus Gametozyten der Stufe V des Parasitenstamms NF54 besteht.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Gametozytentomie der Kultur zwischen 1,5% und 2,5% liegt, mit einem 50% Hämatokrit im männlichen Serum A +, dem frische rote Blutkörperchen hinzugefügt werden.
  3. Die Kultur wird in verschiedene Kolben aufgeteilt und 48 h vor der Durchführung der SMFA 2 μM jeder Verbindung für jede jeweilige Behandlung hinzugefügt. Lassen Sie die Kontrollgruppe unbehandelt.
  4. Beurteilen Sie die Gametozytenkultur kurz vor der Durchführung der SMFA, um die Exflagellation männlicher Gameten mit einem Verhältnis von 3: 1 weiblich zu männlich sicherzustellen.

2. Künstliche Infektion von Moskitos durch die SMFA

HINWEIS: Biologische Sicherheit: Infizierte Moskitos sollten in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) mit eingeschränktem Zugang untergebracht werden.

  1. Geben Sie mit einem Mundsauger 25 nicht gefütterte weibliche An. gambiae-Mücken in einen 350-ml-Futterbecher. Machen Sie dasselbe für jeden Behandlungsbecher und kennzeichnen Sie die Becher eindeutig danach, ob sie als Kontroll- oder Behandlungsgruppen verwendet werden sollen. Wählen Sie die Anzahl der Becher pro Behandlung entsprechend der Anzahl der enthaltenen technischen Replikate.
    HINWEIS: Koloniemücken im Alter zwischen 5 und 7 Tagen werden in einer typischen Bewertung der übertragungsblockierenden Verbindung verwendet. Verhungernde Moskitos für 3-4 Stunden oder länger vor der Blutfütterung erleichtern die Blutaufnahme während der SMFA.
  2. Schließen Sie das Glasfördersystem an das Wasserbad an und halten Sie die Temperatur bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Glaszuführung besteht aus zwei Armen, die mit dem Silikonschlauch verbunden sind, an den das Wasserbad angeschlossen ist (Abbildung 2). Die hohle Struktur des Feeders ermöglicht die Zirkulation von Wasser und die Aufrechterhaltung der Temperatur des Blutes.
  3. Bereiten Sie den Kuhdarm (oder die synthetische Membran) vor, indem Sie ihn in Leitungswasser abspülen und in Stücke schneiden, die für jeden Futterautomaten angebracht sind. Decken Sie jeden Feeder ab und befestigen Sie die Membran mit einem elastischen Band.
    HINWEIS: Für den Darm war keine ethische Freigabe erforderlich, da er von einer örtlichen Metzgerei gekauft wurde, wo er zur Zubereitung von Speisen an die Öffentlichkeit verkauft wird.
  4. Stellen Sie die Infektionsbecher unter die Futterautomaten, wobei die Membran auf dem Netz des Bechers liegt.
  5. Fügen Sie 1 ml Gametozyten-infiziertes Blut zu den Feedern der Kontrollbecher und Gametozyten-infiziertes Blut mit zusätzlicher Verbindung zu jedem entsprechenden Compound-Feeder und Becher hinzu.
  6. Lassen Sie die Moskitos ca. 40 Minuten mit unbedeckten Futterautomaten füttern.
    HINWEIS: Die Fütterung erfolgt unter Insektenbedingungen (25 °C, 80% relative Luftfeuchtigkeit) im Dunkeln. Der Durchmesser eines Anlegers beträgt ca. 13 mm.
  7. Entfernen Sie nach der Fütterung die Feeder aus den Tassen, spülen Sie die Feeder aus und behandeln Sie das überschüssige Blut mit Hypochlorit.
  8. Entfernen Sie die nicht gefütterten Moskitos aus dem Becher, indem Sie alle Moskitos auf Eis schlagen (für 1-2 min) und die nicht gefütterten Moskitos von denen trennen, die eine Blutmahlzeit eingenommen haben. Suchen Sie nach geschwollenen und roten Bäuchen (die auf Blut hinweisen), um die gefütterten, vollständig verstopften Moskitos von den nicht gefütterten zu unterscheiden (Abbildung 3).
  9. Stellen Sie die Infektionsbecher in die Biosicherheitskammer (Ergänzende Abbildung S1) und versorgen Sie jede Tasse mit einem 10% Zuckerwasserpad, das das Zuckerwasser an wechselnden Tagen für 8-10 Tage ersetzt.

3. Vorbereitung von infizierten Moskitos

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls findet im BSL2-Infektionsraum statt. Nur autorisiertes, geschultes Personal darf den Infektionsraum betreten, in dem infizierte Moskitos untergebracht sind. Moskitos werden in modifizierten Bechern gehalten, die nur einen Eintrittspunkt enthalten, der automatisch abdichtet, wenn der Mundsauger entfernt wird. Diese Becher werden in einen transparenten, thermoplastischen Behälter gestellt, um ein Entweichen zu verhindern. Der Container befindet sich im Infektionsraum hinter einem Doppeltürsystem. Alle notwendigen Protokolle müssen für die versehentliche Exposition gegenüber infizierten Moskitos vorhanden sein (Zusatzdatei S1). Die Protokolle sind länderspezifisch und hängen von den Anforderungen der Institution ab.

  1. An den Tagen 8-10 nach der Infektionsfütterung die infizierten Moskitos niederschlagen, indem Sie sie auf Eis legen und in gekennzeichnete Röhrchen mit 70% Ethanol geben (halten Sie die Moskitos jeder Kontroll- und Behandlungsgruppe getrennt).
  2. Stellen Sie sicher, dass alle Moskitos tot sind, bevor Sie den Infektionsraum verlassen.

4. Sektionen infizierter Moskitos

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls wird im Labor durchgeführt.

  1. Übertragen Sie die Moskitos auf beschriftete Petrischale, die mit Filterpapier ausgekleidet sind, und halten Sie die Kontroll- und Testgruppen getrennt.
  2. Legen Sie einen Tropfen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf einen Objektträger (entsprechend der Kontroll-/Testgruppe) und übertragen Sie eine einzelne Mücke vom Filterpapier auf das PBS.
  3. Entfernen Sie den Mitteldarm von der immobilisierten, infizierten Probe, indem Sie den Thorax der Mücke mit der Seziernadel feststecken, während Sie das 7. Bauchsegment mit der Pinzette ziehen.
  4. Wenn der Darm freigelegt und sichtbar ist, suchen Sie nach den Malpighischen Tubuli (Abbildung 4A, B), um den Darm von den Eierstöcken zu unterscheiden. Entfernen Sie es aus dem PBS, übertragen Sie es auf einen Tröpfchen von 0,1% Mercurochrom auf einem neuen Objektträger und lassen Sie den Darm 8-10 min einfärben.
  5. Legen Sie nach dem Färben ein Deckglas auf den gefärbten Darm und betrachten Sie den Darm unter Hellfeldbeleuchtung mit 20-facher bis 40-facher Vergrößerung (Abbildung 4C, D).
  6. Notieren Sie das Vorhandensein und die Anzahl der Oozysten pro Mitteldarm für jede Kontroll- und Behandlungsgruppe (Zusatzdatei S2).
  7. Berechnen Sie die Übertragungsblockierungsaktivität mit Gleichung (1):
    %TBA figure-protocol-1 (1)
    wobei TBA = übertragungsblockierende Aktivität (Verringerung der Oozystenprävalenz); p = Oozystenprävalenz; C = Kontrolle; und T = Behandlung.
  8. Berechnen Sie die übertragungsreduzierende Aktivität mit Gleichung (2):
    %TRA = figure-protocol-2 (2)
    wobei TRA = transmissionsreduzierende Aktivität (Verringerung der Oozystenintensität); I = Oozystenintensität; C = Kontrolle; und T = Behandlung.
    HINWEIS: Die TBA ist möglicherweise nicht signifikant reduziert, aber ein signifikanter Unterschied kann in der TRA beobachtet werden und umgekehrt. Dies ist abhängig vom zu bewertenden chemischen Material.
  9. Führen Sie statistische Analysen mit dem nicht-parametrischen t-Test (Mann-Whitney) durch.

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Ergebnisse

Die Gesamtzahl der sezierten Kontrollproben betrug 47, mit einer durchschnittlichen Prävalenz von 89% und einer Intensität von 9,5 Oozysten pro Mitteldarm (Tabelle 1, wie zuvor veröffentlicht22). Für die Verbindung MMV1581558 erreichte die Stichprobengröße insgesamt 42 Proben mit einer Oozystenprävalenz von 36% und einer durchschnittlichen Intensität von 1,5 Oozysten. Dies zeigt eine Reduktion der Oozystenprävalenz um 58% und eine TRA von 82% über alle drei biologischen Replikate ...

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Diskussion

Damit dieses Protokoll erfolgreich ausgeführt werden kann, sollte jedem Schritt Aufmerksamkeit geschenkt werden, auch wenn dies ein langwieriger und mühsamer Prozess sein kann. Einer der wichtigsten Schritte besteht darin, sicherzustellen, dass die Gametozytenkultur von guter Qualität ist und dass sie aus reifen Gametozyten mit dem richtigen Verhältnis von Mann zu Frau besteht, bevor die SMFA23,24 beginnt. Während der SMFA ist es auch wichtig, die Gametozytenkult...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Prof. Lyn-Mari Birkholtz und Dr. Janette Reader vom Department of Biochemistry, Genetics and Microbiology, Institute for Sustainable Malaria Control, an der University of Pretoria, für die Kultivierung und Bereitstellung der Gametozytenkultur. Der Parasitenstamm wurde von der letztgenannten Abteilung bezogen (nicht Teil dieser Publikation). das Department of Science and Innovation (DSI) und die National Research Foundation (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 an LK und UID 84627 an LMB); die NRF Communities of Practice (UID 110666 zu LMB und LK); und die Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) des South African Medical Research Council werden ebenfalls für Mittel der DSI anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinderdarm/Metzgerei
Compound MMV1581558MMVPandemie-Reaktionsbox
PräpariernadelnWRIMMaßgeschneidertes
FalkenrohrLasec
GlasfeederGlastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)Graphpad
MercurochromeMerck (Sigma-Aldrich)129-16-8
ObjektträgerMerch (Sigma-Aldrich)S8902
ParafilmCleansafe
PBS TablettenThermoFisher ScientificBP2944
Biosicherheitswerkbank aus PlexiglasWits UniversityHergestellt von den Auftragnehmern von Wits
Plastikbecher (350 mL)Plastic Land

Referenzen

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