Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.
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Methodenartikel
Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Embryonale Hornhautwunden von Küken zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich vollständig und schnell zu regenerieren, während erwachsene verwundete Hornhäute aufgrund fibrotischer Narbenbildung einen Verlust an Transparenz erfahren. Die Gewebeintegrität verletzter embryonaler Hornhäute wird intrinsisch wiederhergestellt, ohne dass Narbenbildung erkennbar ist. Aufgrund seiner Zugänglichkeit und einfachen Manipulation ist der Kükenembryo ein ideales Modell für die Untersuchung der narbenlosen Hornhautwundreparatur. Dieses Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Zuerst werden Eier im frühen Embryonalalter gefenstert, um Zugang zum Auge zu erhalten. Zweitens wird eine Reihe von physikalischen In-Ovo-Manipulationen an den extraembryonalen Membranen durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Zugang zum Auge in späteren Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, entsprechend dem Zeitpunkt, zu dem die drei Zellschichten der Hornhaut gebildet werden. Drittens werden lineare Hornhautwunden, die die äußere Epithelschicht und das vordere Stroma durchdringen, mit einem mikrochirurgischen Messer hergestellt. Der Regenerationsprozess oder vollständig wiederhergestellte Hornhäute können mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken nach dem Verwundungsverfahren auf Regenerationspotenzial analysiert werden. Bisherige Studien, die dieses Modell verwenden, haben gezeigt, dass verwundete embryonale Hornhäute eine Aktivierung der Keratozytendifferenzierung aufweisen, eine koordinierte Umgestaltung von ECM-Proteinen in ihre native dreidimensionale Makrostruktur durchlaufen und von sensorischen Hornhautnerven angemessen reinnerviert werden. In Zukunft könnte der mögliche Einfluss endogener oder exogener Faktoren auf den regenerativen Prozess bei heilenden Hornhäuten mit entwicklungsbiologischen Techniken wie Gewebetransplantation, Elektroporation, retroviraler Infektion oder Perlenimplantation analysiert werden. Die aktuelle Strategie identifiziert das embryonale Küken als ein entscheidendes experimentelles Paradigma zur Aufklärung der molekularen und zellulären Faktoren, die die heilung der narbenlosen Hornhautwunden koordinieren.
Einleitung
Die Hornhaut ist das transparente, äußerste Gewebe des Auges, das Licht überträgt und bricht, was der Sehschärfe förderlich ist. In der adulten Hornhaut führt eine Schädigung oder Infektion des Hornhautstromas zu einer schnellen und robusten Wundheilungsreaktion, die durch Keratozytenproliferation, Fibrose, erhöhte Entzündung, die zu Zytokin-induzierter Apoptose führt, Erzeugung von Reparatur-Myofibroblasten und Gesamtumbau der extrazellulären Matrix (ECM) gekennzeichnet ist1,2 . Nach einer Verletzung führt eine solche Hornhautgewebereparatur zu undurchsichtigem Narbengewebe, das die Transparenz der Hornhaut v....
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Protokoll
Der in diesem Protokoll verwendete Eierstamm war White Leghorn, und alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Illinois Wesleyan University genehmigt.
1. Inkubation von Kükeneiern
- Halten Sie die Eier bis zu 1 Woche nach dem Legen bei ~ 10 ° C, um die Entwicklung zu stoppen. Wenn Sie bereit sind, die Entwicklung des Kükenembryos einzuleiten, wischen Sie die gesamte Eierschale mit fusselfreien Tüchern ab (siehe Materialtabelle), die mit Wasser bei Raumtemperatur gesättigt sind, um Schmutz und Ablagerungen zu entfernen.
- Stellen Sie sicher, dass die Eier....
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Ergebnisse
Nach der früheren Sezierung von ACM und CAM bei E5.5, um die Schädelregion des sich entwickelnden Embryos freizulegen, wurde in Ovo eine Reihe von Platzwunden gemacht, die die zentrale Hornhaut E7 überspannten (Abbildung 1). Eine ideale Wunde, um die Regeneration der Hornhaut zu untersuchen, tritt nach drei Platzwunden auf, die jeweils an der gleichen Stelle der Hornhaut gemacht werden. Die erste Platzwunde durchquert das Hornhautepithel, während die zweite und dritte Platzwunde die.......
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Diskussion
Das Küken ist ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der fetalen, narbenlosen Hornhautwundenreparatur. Im Gegensatz zu Säugetieren ist das Küken während der gesamten Entwicklung mit den Strategien in ovo 8 oder ex ovo 24 leicht zugänglich. Die embryonale Kükenhornhaut ist viel größer als die Hornhaut von Nagetieren, wobei fast 50% des Schädelvolumens dem Augegewidmet sind 25, was sie sehr anfällig für körperliche Manipulation.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen in Bezug auf die in diesem Manuskript präsentierten Informationen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für künstlerische und wissenschaftliche Entwicklung durch die Illinois Wesleyan University an TS unterstützt und teilweise von NIH-R01EY022158 (PL) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 18 G Injektionsnadel | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 Grad abgewinkeltes Mikrodispariermesser | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) | Molekulare Sonden | D1306 | |
| 5-ml-Spritze | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor-markierte Sekundärantikörper | Molekulare Sonden | ||
| Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Hühnereiablagen | GQF | O246 | |
| Präparierzange, feine Spitze, gezahnt | VWR | 82027-408 | |
| Präparierschere, scharfe Spitze | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Zähne Gewebe Pinzette, voll gebogen | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Mikrodissektionsschere | VWR | 470315-228 | |
| Maus Anti-Fibronektin (IgG1) | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Maus Anti-Laminin (IgG1) | Entwicklungsstudien Hybridom Bank | 3H11 | |
| Maus-Antineuronen-spezifisches β-Tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Maus-Anti-Tenascin (IgG1) | Entwicklungsstudien Hybridom Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 Eierbrutkasten | GQF | 1502 | |
| Aufreißverpackung von Hand (1,88 Zoll Breite) | Scotch | n/a |
Referenzen
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
