Eine flammenfreie Methode zur Sterilisation von C. elegans Picks, Spateln und Skalpellen

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Sterilisieren von Wurmpickeln, Spateln und Skalpellen mit einer Mikroverbrennungsanlage anstelle einer offenen Flamme.

Abstract

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) ist ein optimaler Modellorganismus für Forschung und Lehre an primär universitären Einrichtungen. Studenten können schnell die sterile Technik erlernen, die erforderlich ist, um C. elegans-Kulturen zu erhalten. Die Sterilisation von Platinpickeln, die zum Übertragen von Würmern von einer Platte auf eine andere verwendet werden, erfolgt traditionell, indem der Meißel in einer Flamme von einem Bunsenbrenner oder einer Ethanollaterne gehalten wird. Bunsen-Brenner benötigen jedoch eine Gasquelle, und beide Geräte bergen das Risiko eines versehentlichen Brandes, der mit einer offenen Flamme verbunden ist. Hier wird eine Technik zur Sterilisation von Wurmpicks, Spateln und Skalpellen mit einer bakteriologischen Infrarot-Schleifenmikroverbrennungsanlage demonstriert. Dieses Gerät benötigt nur eine Steckdose und minimiert potenzielle Brandgefahren. Durch die Senkung des Risiko- und Gasbedarfs eignet sich diese Technik gut für Forschung und Lehre im Grundstudium.

Introduction

Der Modellorganismus C. elegans eignet sich aufgrund der geringen Kosten, der Wartungsfreundlichkeit und des Anwendungsspektrums 1,2,3,4 sowohl für die Forschung als auch für die Lehre an primär grundständigen Einrichtungen (PUIs). Um mit Würmern umzugehen - zum Beispiel, um einen Wurm von einer Platte zur anderen zu bewegen, können Experimentatoren einen Wurmpickel verwenden. Eine Vielzahl von Picks kann für die Verwendung mit C. elegans hergestellt oder gekauft werden. Plektren werden am häufigsten mit einer Platin- oder Platin / Iridium-Spitze hergestellt, die in einem Glas-, Metall- oder Holzgriff montiert ist. Glasgriffe können im eigenen Haus hergestellt werden, indem eine Pasteur-Pipette um einen Platindraht geschmolzen wird, bis der Draht sicher ist. Weitere Informationen über die Haltung von C. elegans, einschließlich des Anbaus und der Pflege von Würmern und ihrer Nahrungsquellen, finden Sie in WormBook⁵ und anderen Quellen ^6,7,8.

Bei der Arbeit mit C. elegans werden aseptische Techniken typischerweise verwendet, um eine Kontamination mit Mikroben und Pilzen zu verhindern. Beispiele für aseptische Techniken sind die Sterilisation von Instrumenten, die Autoklavierung von Reagenzien und die Durchführung von Arbeiten in sterilen Bereichen. Wurmpicks werden typischerweise mit einer offenen Flamme⁹ sterilisiert. Darüber hinaus verbrannt die Sterilisation des Wurmpickels Würmer und verhindert so versehentliche Verwechslungen von Stämmen bei der Arbeit mit mehreren Wurmstämmen. Typische Methoden zum Sterilisieren von Wurmpicks beinhalten eine offene Flamme entweder von einem Bunsenbrenner, einer Ethanollaterne oder einem Standardfeuerzeug (Tabelle 1). Wir waren motiviert, sicherere Alternativen zu bestehenden Methoden im Labor zu suchen, als ein Student unwissentlich Ethanol verschüttete, während er eine Ethanollaterne füllte, und versehentlich ein kleines Feuer auslöste, als er die Laterne entzündete. Leider wurden viele Unfälle mit Ethanollaternen^10,11,12 gemeldet. Glücklicherweise wurden alternative Sterilisationsmethoden für den Einsatz in der Mikrobiologie validiert, und der Zweck dieses Artikels ist es, zu demonstrieren, wie man dieses Gerät verwendet, um Instrumente für die Verwendung mit C. elegans zu sterilisieren.

In mikrobiologischen Labors ist die aseptische Technik ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Serologische Schleifen und Drähte aus Platin werden entweder mit einer offenen Flamme 13 oder einer Mikroverbrennungsanlage^14,15,16 sterilisiert. Andere Namen für Mikroverbrennungsanlagen sind Mikrosterilisatoren oder Bacto-Verbrennungsanlagen. Zu den Vorteilen der Mikroverbrennungsanlage gegenüber herkömmlichen Flammenmethoden gehören die Verringerung der Brandgefahr, die Eliminierung des Vergießens von verbrannten Materialien und die Möglichkeit, in einer laminaren Haube / Biosicherheitskabine^16,17,18 zu arbeiten. Tatsächlich empfehlen sowohl die American Society of Microbiology als auch die Weltgesundheitsorganisation die Verwendung von Mikroverbrennungsanlagen gegenüber der Verwendung einer offenen Flamme^17,19,20. Im Vergleich zu Bunsenbrennern benötigen Mikroverbrennungsanlagen auch keine Gasleitung, die einige Labors möglicherweise nicht haben oder nicht an jeder Bank für Studenten zur Verfügung gestellt haben. Inspiriert von diesen Vorteilen wurde ein Protokoll entwickelt, um die Verwendung von Flammen durch Mikroverbrennungsanlagen zur Sterilisation von häufig verwendeten Instrumenten wie Spitzhacken, Spateln und Skalpellen im Labor von C. elegans zu ersetzen. Diese Methode kann für Ausbilder und Forscher geeignet sein, die die Sicherheit und/oder Flexibilität bei der Arbeit mit C. elegans verbessern möchten.

Protocol

1. Bereiten Sie die Mikroverbrennungsanlage vor

1. Befestigen Sie eine Schlaufenhalter-Zubehörführung an der Mikroverbrennungsanlage, indem Sie sie am Außenlauf befestigen.
2. Schließen Sie eine Mikroverbrennungsanlage an eine Standardsteckdose mit 120 V oder 230 V an.
   HINWEIS: Dies kann auf einer Tischplatte oder in einer Laminar-Flow-Haube erfolgen.
3. Stellen Sie die Mikroverbrennungsanlage auf die hohe Einstellung und lassen Sie sie je nach Herstellerangaben 10-20 Minuten lang aufwärmen, um eine optimale Temperatur von 800-825 ^°C zu erreichen.
   HINWEIS: Wenn die Verbrennungsanlage länger als 3 h eingeschaltet bleibt, kann die niedrigere Temperatureinstellung (500 ^°C) als Standby-Einstellung verwendet werden. Laut Benutzerhandbüchern der Hersteller verlängert dies die Nutzungsdauer der Geräte.

2. Sterilisieren Sie den Pick, den Spatel oder das Skalpell

1. Setzen Sie das Instrument in den zylindrischen Sterilisationsbereich ein, ohne die Seiten zu berühren, indem Sie entlang der Führung²¹ gleiten.
   HINWEIS: Wenn Sie ein Skalpell sterilisieren, ist es wichtig, die Keramikwand nicht mit der Klinge zu berühren. Das Abkratzen der Keramikwand kann die Integrität der Heizeinheit beeinträchtigen.
2. Halten Sie das Instrument für 5-7 s im Sterilisationsbereich.
3. Entfernen Sie das Instrument, ohne die Seiten zu berühren, indem Sie entlang der Führung rückwärts gleiten.
4. Lassen Sie das Instrument 3-5 s abkühlen, bevor Sie einen Wurm berühren, um ein Verbrennen zu vermeiden.
   HINWEIS: Skalpelle oder Spatel, die nicht abkühlen dürfen, singen den Agar.
5. Nachdem Sie Würmer gepflückt haben, setzen Sie den Meißel für 5-7 s erneut in die Kammer ein, um alle Würmer auf dem Pick zu verbrennen.

3. Vergleichende Methode - Sterilisation von Instrumenten mit einem Bunsenbrenner

1. Binden Sie den Bunsenbrenner über Gummischläuche an die Gasleitung an. Stellen Sie sicher, dass Sie den Schlauch fest befestigen und den Brenner von Überkopfobjekten fernhalten.
2. Schalten Sie das Gas ein, indem Sie den Knopf an der Gasleitung drehen.
3. Zünden Sie den Brenner mit einem Schlagbolzen oder Feuerzeug.
4. Stellen Sie die Flamme mit dem Gasknopf und dem Lufteinlass ein, bis ein blauer Kegel sichtbar ist.
5. Halten Sie den Plektrum, den Spatel oder das Skalpell in der Flamme, bis es rot leuchtet.
6. Lassen Sie das Instrument 3-5 Sekunden abkühlen, bevor Sie einen Wurm berühren, um ein Verbrennen zu vermeiden.
   HINWEIS: Skalpelle oder Spatel, die nicht abkühlen dürfen, singen den Agar.
7. Nachdem Sie Würmer gepflückt haben, setzen Sie den Pick erneut in die Flamme ein, um alle Würmer auf dem Pick zu verbrennen.

4. Experiment

1. Kultur OP50 Escherichia coli (E. coli) Bakterien in Luria Brühe²² über Nacht auf einem 37 ^°C Shaker.
2. Nach der Nachtkultur die Kultur in sterilem Wasser im Verhältnis 1:100 verdünnen.
   HINWEIS: Dieser Verdünnungsfaktor wurde gewählt, um die Trennung der Kolonien nach dem Plattieren zu gewährleisten.
3. Tauchen Sie einen mit einem Bunsenbrenner sterilisierten Wurmpickel in die Bakterienlösung, sterilisieren Sie ihn erneut mit dem Bunsenbrenner und schwenken Sie ihn in 100 ml sterilem Wasser.
4. Die 100 μL Wasser auf eine 10 cm LB Agar^22,23 Petrischale auffüllen^, das Wasser mit einem sterilen Zellstreuer verteilen und bei Raumtemperatur 24 h mit aufgesetztem Deckel inkubieren.
5. Führen Sie die Schritte 4.3-4.4 mit einem Wurmpickel durch, der mit einer Mikroverbrennungsanlage sterilisiert wurde.
6. Führen Sie als Positivkontrolle die Schritte 4.3-4.4 ohne erneute Sterilisation durch.
7. Führen Sie als Negativkontrolle die Schritte 4.3-4.4 mit sterilem Wasser anstelle der bakteriellen Lösung durch.
8. Zählen Sie die Kolonien nach der Inkubationszeit manuell.

Results

Ein einfaches Experiment (Abschnitt 4) wurde entwickelt, um die relativen Kontaminationsraten unter Verwendung einer Mikroverbrennungsanlage im Vergleich zu einer Flamme zu demonstrieren (Abbildung 1, Tabelle 2). Während diese Ergebnisse Kontaminationsraten über Methoden hinweg darstellen, wäre es nicht notwendig, diese Methode zu wiederholen, um die Mikroverbrennungstechnik zu verwenden. Das Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Negativkontrolle war steriles Wasser ohne Bakterien. Die Positivkontrolle verwendete keine der beiden Sterilisationstechniken: Der Meißel wurde in die verdünnte OP50-Kultur getaucht und dann direkt in das sterile Wasser überführt. Alle Replikate und Bedingungen wurden am selben Tag parallel ausgeführt. In allen drei Negativkontrollplatten wurden null Kolonien gezählt. Eine durchschnittliche Anzahl von 4,7 (± 0,3 SEM) Kolonien wurde erhalten, wenn der Bunsenbrenner zur Sterilisation von Picks verwendet wurde. Eine mittlere Anzahl von 3,3 (±1,2 SEM) Kolonien wurde im Mikroverbrennungszustand beobachtet. Eine mittlere Anzahl von 298,3 (±17,9 SEM) Kolonien wurde jedoch unter der positiven Kontrollbedingung erhalten. Ein 2-Tailed-t-Test unter der Annahme einer gleichen Varianz, die den Bunsenbrenner mit der Mikroverbrennungsanlage vergleicht, ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied, p = 0,35. So erzielte die Mikroverbrennungsanlage Sterilitätsergebnisse, die ebenso wirksam sind wie der Bunsenbrenner.

Abbildung 1: Keimzahl bei Sterilisationsmethoden. Die Spitzhacken wurden in 1:100 OP50-Kultur in steriles Wasser getaucht und dann mit einem Bunsenbrenner oder einer Mikroverbrennungsanlage sterilisiert. Die Picks wurden dann in steriles Wasser getaucht, auf LB-Agar^22,23 plattiert und 24 h bei Raumtemperatur inkubiert^, und die Kolonien wurden manuell gezählt. Die Positivkontrolle hatte keine Sterilisation, und die Negativkontrolle verwendete steriles Wasser ohne Bakterien. n = 3 Replikate pro Bedingung. Hinweis: Die y-Achse wird unterbrochen, um die Trennung von Datenpunkten in relevanten Teilen des Diagramms zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Sterilisationsverfahren	Kosten	Laboranforderungen	Vorteile		Benachteiligungen
Mikro-Verbrennungsanlage	$365–530	120 V oder 230 V Steckdose	• Tragbar • Keine offene Flamme oder freiliegendes Heizelement • Einsetzbar in Laminar-Flow-Hauben und biologischen Sicherheitswerkbänken		• Aufwärmzeit • Höhere Kosten
Bunsenbrenner	$24–169	Gasleitung	• Schnelle Einrichtung • Niedrige Kosten		• Offene Flamme • Nicht empfohlen für den Einsatz in Laminar-Flow-Haube oder biologischer Sicherheitswerkbank
Ethanol-Lampe	$11	Nichts	• Schnelle Einrichtung • Niedrige Kosten • Nachfüllbar		• Offene Flamme • Sicherheitsrisiko beim Nachfüllen • Nicht empfohlen für den Einsatz in Laminar-Flow-Haube oder biologischer Sicherheitswerkbank • Nicht erlaubt an bestimmten Institutionen
Feuerzeug	$5–8	Nichts	• Niedrige Kosten • Barrierefrei • Einwegartikel • Nachfüllbar		• Offene Flamme • Handbedienung • Nicht empfohlen für den Einsatz in Laminar-Flow-Haube oder biologischer Sicherheitswerkbank

Tabelle 1: Vergleich der Verfahren zur Sterilisation von Instrumenten. Vier Methoden zur Sterilisation von Instrumenten wurden anhand von Vor- und Nachteilen, Kosten und Laboranforderungen verglichen.

Replizieren	Zustand
	Mikro-Verbrennungsanlage	Bunsenbrenner	Negativkontrolle	Positve-Steuerung
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
Bedeuten	3.3	4.7	0.0	298.3
SEM	1.2	0.3	0.0	17.9

Tabelle 2: Rohdaten der Keimzahlen über Sterilisationsmethoden hinweg. Die Spitzhacken wurden in 1:100 OP50-Kultur in steriles Wasser getaucht und dann mit einem Bunsenbrenner oder einer Mikroverbrennungsanlage sterilisiert. Die Picks wurden dann in steriles Wasser getaucht, auf LB-Agar^22,23 plattiert und 24 h bei Raumtemperatur inkubiert^, und die Kolonien wurden manuell gezählt. Die Positivkontrolle hatte keine Sterilisation, und die Negativkontrolle verwendete steriles Wasser ohne Bakterien. n = 3 Replikate pro Bedingung. Mittelwert und SEM unter den einzelnen Zählungen gemeldet.

Discussion

C. elegans ist ein Modellorganismus, der sich gut für Übungen in Bachelor-Lehrlabors eignet. Die Verwendung von Mikroverbrennungsanlagen anstelle von offenen Flammen bietet Vorteile sowohl in Forschungslabors als auch in Klassenzimmerlabors. In der Tat können Bachelor-Laborkurse angesichts der Anzahl der neu ausgebildeten Wissenschaftler im Raum ein höheres Risiko für versehentliche Brände darstellen. Darüber hinaus steigt das Brandrisiko, wenn Ethanol verwendet wird, um Instrumente in der Nähe der Flammenquelle zu sterilisieren, da Ethanoldämpfe entzündbar sind. Die Portabilität bietet auch einen Vorteil für Klassenzimmer, in denen nicht an jedem Prüfstand Gasleitungen installiert sind. Diese Methode wurde in Lehr- und Forschungslabors an unserer Einrichtung eingesetzt, was seit ihrer Gründung im Jahr 2016 zu keiner Zunahme der Kontamination und zu null Laborsicherheitsunfällen geführt hat.

Um die Kompatibilität mit Mikroverbrennungsanlagen sicherzustellen, wurde eine Reihe von Meißeln mit unterschiedlichen Halterungen, Drahtzusammensetzungen und Drahtlehren getestet. Die Drahtzusammensetzung umfasste 100% Platin sowie 90% Platin / 10% Iridium mit einer Drahtdicke von 30-32 G, und unabhängig von Dicke und Zusammensetzung beeinträchtigte die Heizmethode die Drahtintegrität nicht. Die Halterungen umfassten zwei verschiedene Arten von kommerziell erhältlichen Pickgriffen und hauseigene Glashalterungen von Pasteur-Pipetten. Beachten Sie, dass Picks nicht glühend heiß leuchten wie in der Flamme. Eine ausreichende Sterilisation ist jedoch weiterhin erreicht, solange der Sterilisator die richtige Temperatur erreicht hat. Daher ist es wichtig, die Mikroverbrennungsanlage für 10 oder 20 Minuten aufwärmen zu lassen, wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben. Das Gerät mindestens 5 s in der Kammer zu halten, um eine Sterilisation zu erreichen, ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Wenn Sie das Instrument länger als 7 s in der Kammer lassen, wird das Instrument nicht beschädigt, ist aber unnötig. Während dies ein relativ einfaches Verfahren mit minimalen Schritten ist und wahrscheinlich keine Fehlerbehebung erfordert, kann es einige Übung erfordern, um zu lernen, das Instrument im Lauf zu stabilisieren, ohne die Seiten zu berühren.

Um eine offene Flamme zu ersetzen, muss eine Sterilisationsmethode alle in einem Labor verwendeten Anwendungen abdecken. Zusätzlich zur Sterilisation von Instrumenten können C. elegans Labore Bunsenbrenner auch verwenden, um ein steriles Feld für andere Aufgaben wie das Gießen von Platten oder das Impfen von Kulturen zu schaffen¹³. Ob dies jedoch ein steriles Feld schafft oder noch lebensfähige Verunreinigungen anzieht, bleibt^{umstritten 14}. Obwohl dies nicht in allen Einrichtungen eine Option ist, kann eine Biosicherheitswerkbank oder eine Laminar-Flow-Haube für diese Zwecke verwendet werden, so dass ein Labor ohne den Einsatz offener Flammen funktionieren kann. Bedienungsanleitungen für die meisten Mikroverbrennungsanlagen raten von der Verwendung zur Sterilisation von Skalpellklingen ab, da das Abkratzen der Innenwände den Sterilisator beschädigt. Wenn man jedoch vorsichtig eine Führung verwendet, kann man eine Skalpellklinge oder einen Spatel sterilisieren, ohne die Innenwände zu berühren. Dies erweitert die Verwendung der Technik, um das Chunking ohne Verwendung einer Flamme zu ermöglichen, und ermöglicht es einem C. elegans-Labor , zu funktionieren, ohne die Techniken zwischen der Sterilisation verschiedener Objekte zu wechseln.

Wie in Tabelle 1 beschrieben, bieten Mikroverbrennungsanlagen eine erhöhte Sicherheit, eine erhöhte Kompatibilität mit Laminar-Flow-Hauben und eine erhöhte Portabilität gegenüber flammenbasierten Methoden, haben jedoch Einschränkungen. Sie sind teurer als die anderen Methoden und benötigen eine Aufwärmzeit, bevor Sterilisationstemperaturen erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode, die routinemäßig in vielen mikrobiologischen Laboratorien verwendet wird, in einigen Forschungs- und Lehrlaboratorien von C. elegans anwendbar sein kann, die die Laborsicherheit verbessern wollen, ohne die Sterilität zu beeinträchtigen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
90% Platin 10% Iridium Draht	Tritech	PT-9010	Andere Quellen und Drahtzusammensetzungen können verwendet werden.
Agarose	Sigma Aldrich	A6013	LB Agar Inhaltsstoff
Bunsenbrenner	Fisher Scientific	50-110-1225	Andere Bunsenbrenner können verwendet werden
Ethanollampe	Carolina	706604	Hier als Referenz zu Tabelle 1
Feuerzeug	Carolina	706636	Hier als Referenz zu Tabelle 1
enthalten Schlaufenhalter Zubehör	Fisher	22-630-002	Im Manuskript als "Leitfaden"
bezeichnetMikroverbrennungsanlage	Thomas Scientific	1154J15	Es gibt viele Unternehmen, die ähnliche Geräte verkaufen. Ähnliche Modelle, die auch von Benchmark Scientific verkauft werden (B1001),   Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400) und BT Lab Systems (BT1702).
N2 Würmer	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB Inhaltsstoff
OP50 E. coli	CGC	OP50
Petrischale	Fisher	08-772B
Plektrengriff	Tritech	TWPH1
Skalpellklinge	Fisher	12-000-161
Skalpellgriff	Fisher	12-000-164
Spatel	Fischer	14-374	Andere Spatel funktionieren
Sterile Zellspreizer	VWR	76206-438	Andere Zellspreizer dürfen verwendet werden, solange sie steril sind
Trypton	Sigma Aldrich	T7293	LB Zutat
Hefeextrakt	Sigma Aldrich	Y1625	LB Zutat