Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Zusammenfassung

Kurzlebige oder vorübergehende Wechselwirkungen von Makromolekülen an und mit Lipidmembranen, einer Grenzfläche, an der eine Vielzahl essentieller biologischer Reaktionen stattfindet, sind mit biophysikalischen Standardmethoden von Natur aus schwer zu beurteilen. Die Einführung des Mass-sensitive Particle Tracking (MSPT) stellt einen wichtigen Schritt hin zu einer gründlichen quantitativen Charakterisierung solcher Prozesse dar. Technisch wurde dies durch das Aufkommen der interferometrischen Streumikroskopie (iSCAT) ermöglicht, die auf Massenphotometrie (MP) basiert. Wenn die Hintergrundentfernungsstrategie optimiert wird, um die zweidimensionale Bewegung von membranassoziierten Partikeln aufzudecken, ermöglicht diese Technik die Echtzeitanalyse sowohl der Diffusion als auch der Molekülmasse von unmarkierten Makromolekülen auf biologischen Membranen. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Durchführung und Analyse der massensensitiven Partikelverfolgung von membranassoziierten Systemen beschrieben. Messungen an einem handelsüblichen Massenphotometer erreichen eine Zeitauflösung im Millisekundenbereich und je nach MP-System eine Massennachweisgrenze bis hinunter zu 50 kDa. Um das Potenzial von MSPT für die eingehende Analyse der membrankatalysierten Makromoleküldynamik im Allgemeinen aufzuzeigen, werden Ergebnisse für beispielhafte Proteinsysteme wie den nativen Membraninteraktor Annex in V vorgestellt.

Einleitung

Einst nur als Barriere gegen die vielfältigen physikalischen Umgebungsbedingungen wahrgenommen, gelten biologische Membranen heute als funktionelle Einheiten und katalytische Plattformen ^1,2. Basierend auf ihrer Fähigkeit, Signale als Reaktion auf membranassoziierte Makromolekülreaktionen zu lokalisieren, zu verstärken und zu lenken, stellen Lipidgrenzflächen ein entscheidendes Element für eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Membrantransport und Signalkaskaden ^{dar 3,4,5}. Die Membrananhaftung, die als Keimbildungsstelle für den Aufbau stabiler Komplexe dient, beruht oft auf einem dynamischen Gleichgewicht zwischen membranassoziierten und zytosolischen Formen von Makromolekülen und ist daher von vorübergehender Natur ^6,7.

Trotz ihrer großen Bedeutung in der Biologie war es bisher eine Herausforderung, Methoden zu entwickeln, die Zugang zu den kompositorischen, räumlichen und zeitlichen Heterogenitäten membranassoziierter Makromolekülreaktionen in Echtzeit ermöglichen^{können 7,8}. Um die zugrunde liegenden molekularen Prozesse aufzulösen, sind zwei experimentelle Aspekte entscheidend: eine ausreichende Zeitauflösung und Einzelteilchenempfindlichkeit. Daher haben Ensemble-Durchschnittstechniken wie die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen (FRAP), aber auch die viel empfindlichere Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Einschränkungen, da sie räumliche Informationen weitgehend von zeitlichen Informationen entkoppeln⁹. Ein wichtiger Schritt zur Charakterisierung der individuellen Moleküldynamik war daher das Aufkommen von Single-Particle Tracking (SPT) in Kombination mit hochempfindlicher Mikroskopie. Insbesondere zwei SPT-Ansätze haben sich in dieser Hinsicht als wirksam erwiesen. Erstens ebnete die Verwendung von Fluorophoren als Markierungen und den entsprechenden Fluoreszenzdetektionssystemen den Weg für Nanometergenauigkeit und Millisekunden-Zeitauflösung^10,11,12. Zweitens verbesserte die streubasierte Detektion mit Goldnanopartikeln sowohl die Lokalisierungsgenauigkeit als auch die Zeitauflösung im Sub-Nanometer- bzw. Mikrosekundenbereich^13,14,15,16. Trotz der vielen Vorteile beider Ansätze und ihrer bedeutenden Beiträge zum mechanistischen Verständnis membranassoziierter Systeme^17,18 waren beide Techniken bisher begrenzt: Sie erfordern eine Markierung der interessierenden Moleküle, was ihr natives Verhalten möglicherweise stört und unempfindlich gegenüber der molekularen Zusammensetzung von membranassoziierten Partikeln^{ist 19,20}.

Beide Einschränkungen wurden kürzlich durch die Einführung eines neuartigen interferometrischen Streuungsansatzes (iSCAT) namens Massenphotometrie (MP) 21,22,23 überwunden. Diese Technik ermöglicht die Bestimmung von Massenverteilungen von Biomolekülen in Lösung entsprechend ihrem iSCAT-Kontrast bei der Landung auf einer Glasgrenzfläche. Für den Nachweis und die Charakterisierung von mobilen Molekülen, die auf Lipidmembranen diffundieren, musste jedoch ein ausgefeilterer Bildanalyseansatz entwickelt werden. Dies wurde inzwischen erfolgreich implementiert und ermöglicht es, die molekulare Masse einzelner unmarkierter Biomoleküle, die auf einer Lipidgrenzfläche diffundieren, nachzuweisen, zu verfolgen und zu bestimmen^24,25. Diese als dynamische Massenphotometrie oder Mass Sensitive Particle Tracking (MSPT) bezeichnete Technik ermöglicht nun die Beurteilung komplexer Makromolekülwechselwirkungen durch die direkte Aufzeichnung von Änderungen der Molekülmasse der verfolgten Entitäten und eröffnet damit neue Möglichkeiten für die mechanistische Analyse der membranassoziierten Molekulardynamik.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung, Bildgebung und die für MSPT erforderliche Datenanalysepipeline vorgestellt. Insbesondere werden Probenanforderungen und mögliche Probleme, die während der Messung und Analyse auftreten können, diskutiert. Darüber hinaus wird das beispiellose Potenzial zur Analyse membranwechselwirkender Makromolekülsysteme durch verschiedene repräsentative Ergebnisse gezeigt.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Generierung von mehrschaligen Vesikeln (MLVs)
   1. Berechnen Sie die Menge an chlorformgelösten Lipiden entsprechend der gewünschten Lipidmischung und dem erforderlichen Suspensionsvolumen.
      HINWEIS: Für den Respensions- (Reaktions-) Puffer wird eine endgültige Vesikelkonzentration von 4 mg/ml Lipiden empfohlen.
   2. Pipettieren Sie das berechnete Lipidvolumen in ein 1,5 ml Glasfläschchen mit positiven Verdrängungspipetten, die mit Glasspitzen ausgestattet sind.
   3. Verdampfen Sie das Lipidlösungsmittel unter einem schwachen Stickstoffstrom und drehen Sie die Durchstechflasche ständig, um eine gleichmäßige Verteilung der Lipide auf den Glaswänden zu gewährleisten.
   4. Stellen Sie eine vollständige Verdampfung des Lösungsmittels sicher, indem Sie die Durchstechflasche 15 Minuten lang unter einen stetigen Stickstoffstrom stellen.
   5. Entfernen Sie Restspuren von Chloroform durch Vakuumtrocknung in einem Vakuum-Exsikkator für eine weitere Stunde.
   6. Rehydrieren Sie die Lipidmischung im gewünschten Resuspensionspuffer (Reaktionspuffer) und wirbeln Sie die Suspension gründlich auf, bis sich der Lipidfilm von den Wänden der Durchstechflasche gelöst hat.
      HINWEIS: Der Reaktionspuffer sollte die Proteinaktivität und -stabilität gewährleisten. Der in dieser Studie verwendete Reaktionspuffer enthält 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl und 5 mM MgCl₂. Beachten Sie, dass jeder Puffer, der zur Verdünnung von Lipiden oder Proteinen verwendet wird, gefiltert werden muss, um störende partikuläre Verunreinigungen zu entfernen (siehe Schritt 5).
2. Generierung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs)
   1. Für aufeinanderfolgende Gefrier-Tau-Zyklen der Lipid-Resuspension (Schritt 1.1.6) werden 500 ml Wasser in einem Becherglas auf einer heißen Platte (zwischen 70 °C und 99 °C) gekocht und ein Behälter mit flüssigem Stickstoff hergestellt.
   2. Schockgefrieren Sie die Lipid-Resuspension im flüssigen Stickstoff. Übertragen Sie die Durchstechflasche mit heißem Wasser in das Becherglas, bis die Lösung vollständig aufgetaut ist. Wiederholen Sie diesen Frost-Tau-Zyklus 8-10 Mal oder bis die zuvor trübe Mischung klar erscheint.
      VORSICHT: Verwenden Sie geeignete Sicherheitskleidung und -ausrüstung wie Schutzbrille, Handschuhe und Pinzette, um einen direkten Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff, der gefrorenen Lipidfläschchen oder dem kochenden Wasser zu verhindern.
   3. Für die Erzeugung einer monodispersen Vesikelverteilung montieren Sie einen Lipid-Extruder und testen Sie seine Integrität mit Reaktionspuffer, um sicherzustellen, dass er nicht ausläuft.
      HINWEIS: Wenn eine Leckage beobachtet wird, setzen Sie den Lipid-Extruder vorsichtig wieder zusammen, bis kein Pufferverschütten erkennbar ist.
   4. Extrudieren Sie die Lipidsuspension für 37 Durchgänge durch eine Nukleoporemembran mit einer Porengröße von 50 nm²⁶. Die Anzahl der Durchgänge sollte ungleichmäßig sein, um sicherzustellen, dass das endgültige SUV-Gemisch die Nukleoporenmembran durchquert und somit frei von Lipidaggregaten oder mehrmaligen Vesikeln ist. Die extrudierten Vesikel werden später verwendet, um unterstützte Lipiddoppelschichten zu bilden (siehe Schritte 6 und 7).
      HINWEIS: SUVs können auch durch Beschallung der rehydrierten Lipidmischung gebildet werden. Die Herstellung durch Extrusion sorgt jedoch für eine monodispersere Verteilung von SUVs, was den Vesikelbruch während der unterstützten Lipiddoppelschichtbildung erleichtert. Extrudierte Vesikel können maximal 3 Tage im Kühlschrank gelagert werden.

2. Reinigung von Objektträgern

1. Verteilen Sie eine gleiche Anzahl von Objektträgern (Nr. # 1,5; 0,17 mm Dicke) mit Abmessungen von 24 mm x 60 mm und 24 mm x 24 mm in Polytetrafluorethylen (PTFE) Mikroskophaltern.
2. PTFE-Halter in Bechergläser mit Reinstwasser geben und 15 min bei Raumtemperatur beschallen.
   HINWEIS: Je nach Becherglas muss die Wassermenge so eingestellt werden, dass sie den PTFE-Halter vollständig abdeckt.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Halter aus dem Becherglas zu entfernen und das Wasser durch hochreines Isopropanol zu ersetzen. Den Halter in das Becherglas mit Isopropanol einführen und erneut für 15 min beschallen.
   HINWEIS: Je nach Becherglas muss das Volumen des Isopropanols so eingestellt werden, dass der PTFE-Halter vollständig bedeckt ist.
4. Isopropanol durch Reinstwasser ersetzen und das Becherglas mit den Haltern 15 min beschallen.
5. Entfernen Sie die PTFE-Halter aus den Bechergläsern und föhnen Sie die Objektträger im Halter unter einem stetigen Strom von Stickstoffgas oder Druckluft.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Deckobjektträger ordnungsgemäß gereinigt werden, indem Sie Handschuhe, saubere Bechergläser und Paraffinfolie verwenden, um jedes Becherglas abzudecken. Andernfalls kann Reststaub bei MSPT-Messungen zu erheblichen Hintergrundschwankungen führen.

3. Hydrophilierung von Objektträgern

HINWEIS: Um eine homogene und flüssigkeitsunterstützte Lipiddoppelschicht zu erhalten, ist die Hydrophilisierung von Objektträgern unerlässlich und muss kurz vor der Fließkammermontage durchgeführt werden.

1. Legen Sie PTFE-Halter mit nur 24 mm x 60 mm Objektträgern in einen Plasmareiniger mit Sauerstoff als Prozessgas und reinigen Sie die Objektträger mit Plasma (in dieser Arbeit verwendete Parameter: 30% Leistung, 0,3 mbar Sauerstoffdruck für 30 s; siehe Materialtabelle für Details des verwendeten Plasmareinigers).
   HINWEIS: Um Flüssigkeitsmembranen zu erhalten, müssen Plasmareinigungsparameter wie Leistung, Sauerstoffdruck und Reinigungszeit für jedes Instrument angepasst werden. Zu diesem Zweck wird die Verwendung von fluoreszierend markierten Lipiden empfohlen, um die Membranfluidität sicherzustellen, die mit der Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleaching (FRAP) -Experimenten quantifiziert werden kann²⁷. Wenn die Parameter nicht für den jeweiligen Aufbau optimiert sind, kann die Membrandiffusion aufgrund der reduzierten Membranfluidität beeinträchtigt werden.

4. Montage von Durchflusskammern

1. Halten Sie vor der Montage der Durchflusskammer die folgenden Komponenten bereit: gereinigte Objektträger (24 mm x 24 mm), hydrophilisierte Objektträger (24 mm x 60 mm), Aluminiumfolie, flache Pappe, Skalpell und doppelseitiges Klebeband.
2. Wickeln Sie den flachen Karton mit Aluminiumfolie ein.
3. Verteilen Sie die gereinigten 24 mm x 24 mm großen Objektträger auf der Aluminiumfolie mit ausreichendem Abstand zueinander.
4. Befestigen Sie doppelseitige Klebestreifen an den oberen und unteren Rändern der Objektträger.
5. Schneiden Sie jeden Objektträger mit dem Skalpell aus, so dass er von der Aluminiumfolie entfernt werden kann. Daher sollten an jedem Objektträger doppelseitige Streifen aus Klebeband angebracht sein, die an den oberen und unteren Rändern des Objektträgers angebracht sind (siehe Abbildung 1).
6. Befestigen Sie den 24 mm x 24 mm großen Objektträger mit den beiden doppelseitigen Bandstreifen an dem hydrophilisierten 24 mm x 60 mm großen Objektträger, um einen Fließpfad zwischen den kleineren und größeren Objektträgern zu bilden.
   HINWEIS: Um saubere Durchflusskammern zu gewährleisten, tragen Sie ständig Handschuhe und stellen Sie sicher, dass die Werkbank staubfrei ist.

5. Filtration von Reaktionspuffern

1. Sterilfiltern Sie alle Reaktionspuffer durch 0,45 μm Celluloseacetatmembranen, um ein minimales Hintergrundsignal während der MSPT-Messungen zu gewährleisten.
   HINWEIS: Wenn das Vorhandensein von Nukleotiden wie ATP für ein erfolgreiches Experiment unerlässlich ist, achten Sie auf eine mögliche Zunahme des Hintergrundsignals. Es wird empfohlen, nur minimale Mengen zu verwenden, die noch die Proteinaktivität gewährleisten.

6. Unterstützte Lipiddoppelschichtbildung (SLB)

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf dem Massenphotometer durchzuführen, um eine erfolgreiche Vesikelausbreitung und die vollständige Entfernung von nicht verschmolzenen Vesikeln visuell sicherzustellen.

1. Verdünnen Sie frisch extrudierte SUVs (siehe Schritt 1 für weitere Details) auf eine Endkonzentration von 0,4 mg/ml im erforderlichen Reaktionspuffer. Optional, um die Vesikelruptur zu fördern, fügen Sie 2 mM CaCl 2 zur Vesikelsuspension hinzu_.
   HINWEIS: Zweiwertige Kationen können die Aggregation einiger Lipide wie PiP₂ verursachen. Bei Gemischen, die solche Lipide enthalten, ist auf die Verwendung von_CaCl2 zur Förderung der Vesikelruptur oder anderer zweiwertiger Kationen im Resuspensionspuffer zu verzichten. Bei Bedarf für das Experiment können nach erfolgreicher Bildung der unterstützten Lipiddoppelschicht zweiwertige Kationen zugegeben werden.
2. Spülen Sie 50 μL der Vesikelsuspension in die Durchflusskammer (Schritt 4) und inkubieren Sie die Kammer für 2 min.
   HINWEIS: Puffer, Vesikel oder Proteinlösungen können mit einem kleinen Stück Einweichgewebe durch die Durchflusskammer gespült werden. Es ist aber auch möglich, ein mechanisches Pumpensystem einzusetzen.
3. Entfernen Sie unverschmolzene Vesikel durch wiederholtes (mindestens dreimaliges) Waschen der Durchflusskammer mit jeweils 200 μL des Reaktionspuffers.
   HINWEIS: Vesikel müssen gründlich aus der Durchflusskammer ausgewaschen werden, um ein stabiles Hintergrundsignal während der MSPT-Messungen zu gewährleisten.

7. Generierung der Kalibrierkurve

HINWEIS: Um den Kontrast der detektierten Partikel in molekulare Masse umzuwandeln, muss ihr Signal mit Proteinen bekannter Größe kalibriert werden. Es wird empfohlen, das Standard-Proteingrößenregime anzupassen, um den Bereich der Molekülmassen abzudecken, die für das interessierende System erwartet werden.

1. Biotinylierung von Standardproteinen mit einem Cysteinrest
   1. Berechnen Sie die entsprechende Menge an Maleimid-Biotin für das Standardprotein gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Inkubieren Sie das Standardprotein mit dem ermittelten Volumen an Maleimid-Biotin für 1 h bei Raumtemperatur.
   3. Um unkonjugiertes Maleimid-Biotin aus dem konjugierten Biotin-Protein-Komplex zu entfernen, führen Sie eine Größenausschlusschromatographie an einer Säule durch, die für das interessierende Protein geeignet ist.
   4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay.
      HINWEIS: Um das Standardprotein für weitere Messungen zu lagern, frieren Sie das Protein in Einweg-Aliquots in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 ° C.
2. Messung von Standardproteinen für die Kalibrierkurve
   1. In einer Durchflusskammer wird eine unterstützte Lipiddoppelschicht mit extrudierten 0,4 mg/ml SUVs (weitere Einzelheiten siehe Schritte 1 und 6) hergestellt, die 0,01 mol% (v/v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap biotinyl) enthält.
   2. 50 μL 2,5 nM zweiwertiges Streptavidin in die Doppelschicht in der Durchflusskammer geben und 10 min inkubieren.
      HINWEIS: Divalentes Streptavidin wurde exprimiert und gereinigt, wie in Howarth et ^al.28 beschrieben. Tetravalentes Streptavidin kann ebenfalls verwendet werden. Die Verwendung von zweiwertigem Streptavidin kann jedoch die mögliche Reaktionsstöchiometrie zwischen biotinylierten Lipiden und Standardproteinen, die zu einer Biotineinheit konjugiert sind, reduzieren, um die Zuordnung von Spezies zu erleichtern.
   3. Entfernen Sie ungebundenes zweiwertiges Streptavidin mit 100 μL Reaktionspuffer.
   4. 50 μL 100 nM Biotin-konjugiertes Standardprotein in die Doppelschicht in der Durchflusskammer geben und 2 min inkubieren.
      HINWEIS: Abhängig von der Biotinylierungseffizienz und davon, ob zwei- oder vierwertiges Streptavidin verwendet wird, können die optimalen Konzentrationen von biotinkonjugiertem Standardprotein und Streptavidin variieren.
   5. Führen Sie die MSPT-Messung gemäß den in Schritt 8 beschriebenen Details durch.
      ACHTUNG: Die bildgebenden Bedingungen müssen sowohl für die Proben- als auch für die Kalibrierstandards identisch sein.

8. Bildgebung

1. SLB-Bildung und Probenvorbereitung
   1. Wie in Schritt 6 näher beschrieben, führen Sie SUVs der gewünschten Lipidmischung (25 μL) in die Probenflusskammer ein und bilden eine unterstützte Lipiddoppelschicht. Waschen Sie die Kammer gründlich (dreimal) mit 100 μL Reaktionspuffer, um alle nicht verschmolzenen Vesikel zu entfernen.
   2. Geben Sie 50 μL des interessierenden Proteins in die Probenkammer.
      HINWEIS: Da MSPT eine Einzelpartikelmethode ist, muss die Proteinkonzentration im Bereich von pM bis nM gehalten werden, um eine ungestörte Partikeldetektion und -verfolgung zu ermöglichen.
2. Videoaufnahme
   1. Stellen Sie die gewünschten Bildgebungsbedingungen wie die Größe des Sichtfelds (FOV), die Bildrate, die Belichtungszeit und die Erfassungszeit in der Erfassungssoftware ein.
      HINWEIS: Die folgenden Einstellungen haben sich für MSPT auf einem kommerziellen Massenphotometer bewährt (siehe Materialtabelle): FOV von 128 Pixeln x 35 Pixeln, eine Bildrate von 1 kHz, die nach anschließender 5-facher Bildmittelung zu etwa 200 Bildern pro Sekunde führt, und eine Belichtungszeit von 0,95 ms.
   2. Passen Sie den Fokus automatisch oder manuell an. Bewegen Sie das Sichtfeld bei Bedarf mit der seitlichen Steuerung an eine Position mit einer homogenen Membran.
   3. Erstellen Sie einen Projektordner und beginnen Sie mit der Aufnahme des Films. Geben Sie nach Abschluss der Aufzeichnung einen Dateinamen in dem von der Erfassungssoftware aufgeforderten Dialogfeld an. Der Film wird dann automatisch als MP-Datei zur späteren Analyse im Projektordner gespeichert.
      HINWEIS: Zeichnen Sie mindestens drei Replikate in verschiedenen Durchflusskammern auf, um die Integrität einzelner Membranen und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Die Filmdauer kann im Voraus festgelegt werden und hängt von der Art des Experiments ab. In den meisten Fällen wird eine Erfassungszeit zwischen 5 min und 7 min empfohlen.
      ACHTUNG: Standardmäßig werden Filmaufnahmen auf der kommerziellen Massenphotometer-Erfassungssoftware komprimiert, bevor sie gespeichert werden, um Speicherplatz zu reduzieren. Die Dateikomprimierung muss jedoch deaktiviert werden, um eine benutzerdefinierte Datenanalyse zu ermöglichen, wie in diesem Protokoll beschrieben. Details zum Deaktivieren der Dateikomprimierung finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse-Pipeline wird von zwei interaktiven Jupyter-Notebooks (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb) begleitet. Die Jupyter-Notebooks und die zugehörigen benutzerdefinierten Python-Module, die für die Durchführung der unten beschriebenen MSPT-Analyse erforderlich sind, sind in einem öffentlichen Repository verfügbar: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. Für detaillierte Anweisungen zur Analyse unten verweisen die Leser auf MSPT analysis.ipynb , auf die über den obigen Link zugegriffen wird.

1. Videoverarbeitung
   1. Entfernen Sie die dominante statische Lichtstreuung mit dem pixelweisen Hintergrundschätzungsalgorithmus mithilfe der Funktion image_processing.mp_reader.
      1. Um die Hintergrundentfernung anzuwenden, wählen Sie die Option continuous_median für den Parametermodus und legen Sie eine geeignete Länge für das verschiebbare Medianfenster (window_length) im Notizbuchabschnitt B.1 fest. Optional können Sie die Filme nach der Hintergrundentfernung speichern, um sie für die Partikelerkennung und die Trajektorienverknüpfung zu verwenden (indem Sie den Parameter save_processed_movies auf True setzen).
         HINWEIS: Passen Sie die Fenstergröße (window_length) auf Werte zwischen 101 und 2001 an, abhängig von der Partikeldichte auf der Membran, dem erwarteten Diffusionskoeffizienten, der Erfassungsbildrate und der erforderlichen Verarbeitungsgeschwindigkeit.
         ACHTUNG: Die Hintergrundentfernungsstrategie funktioniert gut, wenn die Membran nicht zu dicht gepackt ist und wenn die Diffusion der Partikel ausreichend schnell ist (d.h. jedes Pixel ist die meiste Zeit nicht mit einem Partikel besetzt). Andernfalls wird der Kontrast der Partikel systematisch unterschätzt, da sie nicht richtig vom Hintergrundsignal unterschieden werden können. Dies kann kompensiert werden, indem die mittlere Fenstergröße auf Kosten der Rechengeschwindigkeit erhöht wird. Beachten Sie jedoch, dass das Festlegen der Fenstergröße zu groß die Ausgabe aufgrund der Abtastdrift negativ beeinflussen kann. Eine visuelle Inspektion der bearbeiteten Videos ist entscheidend.
   2. Erfassen Sie Partikel und ihre jeweilige Position im gesamten Film mit der Funktion particle_fitting.particle_fitter (siehe Notizbuchabschnitt B.2).
      1. Optimieren Sie die Empfindlichkeit der Partikelerkennung mit dem Schwellenwertparameter (Dresch; siehe Notebook-Abschnitt B.1), der verwendet wird, um Kandidatenpunkte durch Bildbinarisierung hervorzuheben. Der Einfluss unterschiedlicher Schwellenwertparameter auf die Spot-Detektionsempfindlichkeit kann in einem separaten Notizbuch (Movie visualization.ipynb) untersucht werden. Die Ergebnisse der Partikeldetektion werden automatisch in CSV-Dateien in einem Unterverzeichnis der Filmdatei gespeichert.
         HINWEIS: Das Einstellen des Schwellenwertparameters beliebig niedrig (z. B. für Filme, die mit dem verwendeten Massenphotometer aufgenommen wurden, ein Schwellenwertparameter unter 0,0005) wird nicht empfohlen, da die Kandidatenspots von unechtem Rauschen dominiert werden und somit die Verarbeitungszeit verlängern.
2. Verknüpfen Sie Partikel in aufeinanderfolgenden Frames mit dem Python-Paket trackpy (v.0.5.0)²⁹ zu Trajektorien.
   HINWEIS: Die Trajektorienverknüpfung wird nach der Spot-Erkennung im laufenden Betrieb durchgeführt. Infolgedessen wird eine zusätzliche CSV-Datei mit den Trajektorieninformationen in einem Unterverzeichnis der CSV-Datei zur Partikelerkennung gespeichert.
   1. Entfernen Sie Trajektorien mit zu wenigen Punkten mit dem Parameter minimum_trajectory_length (siehe Notebook-Abschnitt B.1), um eine robuste Bestimmung der Diffusionskoeffizienten zu ermöglichen. Detaillierte Erklärungen zu den anderen Parametern der trackpy-Funktionen finden Sie in der Dokumentation von trackpy.
3. Trajektorienanalyse
   1. Geben Sie im Notizbuchabschnitt C.1 die Bildrate (frame_rate) und die Pixelgröße in nm (pixel_size) an, die für die Filmerfassung verwendet wurden. Erstellen Sie mit der Funktion trajectory_analysis.get_csv_files (Notebook-Abschnitt C.2) eine Liste von CSV-Dateien, die die von trackpy zurückgegebenen Trajektorieninformationen enthalten (siehe Schritt 9.2).
   2. Geben Sie außerdem einen Ausgabedateinamen für den HDF5-Container an, der zum Speichern der Anpassungsergebnisse auf der Festplatte verwendet wird (Notebook-Abschnitt C.3). Analysieren Sie alle Trajektorien mit der Funktion trajectory_analysis.fit_trajectories im Notizbuchabschnitt C.4, der die Liste der CSV-Dateien durchläuft. Diese Funktion verwendet die Sprungdistanzverteilung (JDD)³⁰ und die MSD-31-Analyse (Mean Squared Displacement), um den Diffusionskoeffizienten jeder Trajektorie zu schätzen.
   3. Konvertieren Sie den medianen Kontrast jeder Trajektorie in die entsprechende Masse, indem Sie die Kontrast-Masse-Beziehung verwenden, die aus der MSPT-Kalibrierung erhalten wurde (siehe Abschnitt 7). Geben Sie die Steigung (Steigung) und den y-Schnittpunkt (Offset) der Kalibrierlinie an, die den iSCAT-Kontrast mit der Molekülmasse in Beziehung setzt (Funktion trajectory_analysis.apply_calibration; siehe Notebook-Abschnitt C.5). Diese Funktion fügt jedem Datenrahmen eine Spalte mit der Medianmasse der Trajektorie hinzu.
   4. Bewerten Sie die scheinbare Partikeldichte auf der Membran mit der Funktion trajectory_analysis.membrane_density, die den Mediandichtewert in Bezug auf detektierte Partikel und aktuelle Trajektorien während jedes Frames (siehe Notizbuchabschnitt C.6) als zusätzliche Spalten im Datenrahmen zurückgibt.
      HINWEIS: Da ein Teil der Partikel sowohl während des Detektions- als auch des Trajektorienverknüpfungsprozesses verloren geht, können die tatsächlichen Partikeldichten höher sein. Für zuverlässige Ergebnisse in Bezug auf Partikeldichten sowie Massenhistogramme können Sie repräsentative Filmschnappschüsse visuell untersuchen, um sicherzustellen, dass die Messbedingungen für die Einzelpartikelverfolgung plausibel sind (siehe Schritt 9.1.1).

10. Datenvisualisierung

1. Veranschaulichen Sie die Korrelation von Masse und Diffusionskoeffizient mit der zweidimensionalen Kerneldichteschätzung (KDE), die auf dem Python-Paket fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/) basiert.
2. Um das Diagramm zu generieren, geben Sie die HDF5-Datei mit den MSPT-Ergebnissen an (siehe Schritt 9.3.2 und Notebook-Abschnitt D.1) und wählen Sie einen einzelnen (Notebook-Abschnitt D.2) oder einen verketteten Datenrahmen (Notebook-Abschnitt D.3) als Eingabedaten für die plotting.generate_2D_KDE-Funktion (Notebook-Abschnitt D.4) aus.
   HINWEIS: Jeder geplottete Datensatz sollte idealerweise mehr als 1.000 Trajektorien für ein zuverlässiges 2D-KDE enthalten.

Ergebnisse

Folgt man dem detaillierten Protokoll hierin zur Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) in Strömungskammern (Abbildung 1), kann man in der nativen Ansicht aller dargestellten Zustände ein fleckenartiges Muster deutlich erkennen (Abbildung 2). Dieser Effekt wird durch die Oberflächenrauheit des Glases verursacht, die im Allgemeinen das Streusignal dominiert und zu visuell nicht unterscheidbaren Bedingungen führt (Glas, Glas mit SLB oder Glas mit SLB und angehängten Proteinen). Das Vorhandensein von Vesikeln ist jedoch aufgrund des großen Streuquerschnitts der Vesikel deutlich ausgeprägt und ermöglicht die Beobachtung von Vesikelbruch und Fusion zu homogenen Membranen (Abbildung 2B und Ergänzungsfilm 1). Wenn man das statische Streusignal der Glasoberfläche mit einem ratiometrischen Ansatz entfernt, der die dynamischen Elemente innerhalb des Sichtfeldes 24,25 betont, kann man unmarkierte Proteine aufdecken^, die auf der Membran diffundieren (Abbildung 2D), während ein leerer SLB (Abbildung 2C) oder Glas selbst (Abbildung 2A) als verrauschtes Bild erscheint.

Der inhärente Hintergrund von MSPT-Messungen kann lokal geschätzt werden, indem jeder Pixelwert durch den Median von n vorhergehenden und nachfolgenden Pixeln des Films an derselben Bildposition dividiert wird (Abbildung 3). Infolgedessen erscheinen Makromoleküle als isotrope Punktausbreitungsfunktionen (PSFs), deren Bewegung auf der Membran beobachtet, verfolgt und quantifiziert werden kann. Tatsächlich ermöglicht die Verfügbarkeit von Kontrast und dynamischem Verhalten die direkte Beziehung der Molekülgröße eines Partikels zu seinem jeweiligen diffusiven Verhalten, ohne dass das Partikel markiert werden muss. Um den während MSPT-Experimenten ermittelten iSCAT-Kontrast zu interpretieren, ist es jedoch unerlässlich, eine Kalibrierung durchzuführen, die die Signalamplitude in molekulare Masse übersetzt. Dies kann erreicht werden, indem Biomoleküle bekannter Masse über einen Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplex an ein SLB gebunden werden (Abbildung 4A). Als beispielhafte Strategie kann man biotinylierte Varianten von Rinderserumalbumin (BSA), Protein A (prA), alkalischer Phosphatase (AP) und Fibronektin (FN) verwenden, die an Streptavidin (STP) binden, das selbst an biotinhaltige Lipide (Biotinyl Cap PE) in der Membran gebunden ist. Wie in Abbildung 4A dargestellt, spiegelt der zunehmend ausgeprägte Kontrast dieser beispielhaften Makromoleküle das zunehmende Molekulargewicht der jeweiligen biotinylierten Standards wider. Durch die Zuordnung jedes Peaks der Kontrasthistogramme (Abbildung 4B) zur entsprechenden Masse des Oligomerzustands des Standardproteins ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen Kontrast und Masse^21,22 und kann anschließend für die Analyse unbekannter Makromolekülsysteme verwendet werden (Abbildung 4C).

Ein gutes Beispiel für die Anwendbarkeit und die Fähigkeiten von MSPT zur Analyse von Molekulargewichten und damit zur Untersuchung von Oligomerzuständen und Oligomerisierungsereignissen ist die Berücksichtigung von biotinylierter Aldolase und biotinyliertem IgG (Abbildung 5). Es wird allgemein berichtet, dass Aldolase ein Homotetramer³² ist. Die von MSPT aufgelöste Massenverteilung weist jedoch vier unterschiedliche Spitzen auf, was das Vorhandensein mehrerer Populationen unterstreicht (Abbildung 5A). Während der erste kleine Peak dem unbesetzten Streptavidin entspricht und aufgrund der Konfiguration in einem solchen Experiment zu erwarten ist, können ebenfalls Aldolasekomplexe mit nur zwei Untereinheiten (2SU) oder sechs Untereinheiten (6SU) nachgewiesen werden (Abbildung 5B). Interessanterweise weisen tetra- und hexamere Aldolase-Streptavidin-Komplexe im Vergleich zu dimerer Aldolase und Streptavidin allein einen reduzierten Diffusionskoeffizienten auf, was auf einen erhöhten viskosen Widerstand hinweist, z.B. durch die Anlagerung eines zweiten biotinylierten Lipids an das Streptavidin. In ähnlicher Weise weist biotinyliertes IgG drei Peaks in der Massenverteilung auf, wobei der erste Peak wieder mit der Masse eines einzelnen Streptavidins übereinstimmt. Die Masse des am häufigsten vorkommenden Peaks entspricht der Masse einer leichten und einer schweren Kette (1SU), d.h. der Hälfte eines IgG-Antikörpers. Der vollständige Antikörper mit zwei identischen Hälften (2SU) wird in etwa 11% der Fälle nachgewiesen. Die Abnahme des Diffusionskoeffizienten mit zunehmender komplexer Größe weist auf Wechselwirkungen des Streptavidins mit mehr als einem biotinylierten Lipid oder einem zusätzlichen Widerstand hin, der durch das angehängte IgG oder beides verursacht wird.

Neben der alleinigen Analyse membranabhängiger Oligomerzustände bietet MSPT auch den besonderen Vorteil, das diffusive Verhalten eines interessierenden Makromoleküls mit seinem Oligomerzustand zu korrelieren. Repräsentative Ergebnisse für diese Art der Analyse werden für Annexin V (AnV) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTxB) gezeigt, die an Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) bzw. Glykosphingolipide (GM1) binden, die in die Membran eingebaut sind (Abbildung 6A). Beide Kerndichteschätzungen (KDEs) weisen unimodale Verteilungen von Masse und Diffusion auf, was auf eine einzige reichlich vorhandene Spezies mit ähnlichem diffusivem Verhalten hinweist. Die Spitzenposition der Molekülmasse und des Diffusionskoeffizienten betrug 49,8 ± 2,2 kDa bzw. 1,4 ± 0,1 μm 2/s für AnV bzw. 62,7 ± 3,1 kDa bzw. 0,4 ± 0,1 μm²/s für CTxB. Die gemessenen Diffusionskoeffizienten sind vergleichbar mit zuvor gemeldeten Werten aus Hochgeschwindigkeits-AFM und FRAP^33,34. Die leicht reduzierte Masse im Vergleich zur Masse des erwarteten Makromoleküls (52 kDa für ein AnV-Trimer, 65 kDa für ein CTxB-Pentamer) kann auf das Vorhandensein kleinerer Komplexe mit weniger Untereinheiten im Ensemble hinweisen. Während der Massenunterschied zwischen den Proteinen klein ist und nahe der vorgegebenen Nachweisgrenze des Mikroskops (≈50 kDa) liegt, unterscheiden sich ihre Diffusionskoeffizienten erheblich. In einem äquimolaren Gemisch kann man beispielsweise durch den Vergleich der Diffusion des Gemisches mit der Verteilung von AnV und CTxB allein zu dem Schluss kommen, dass AnV auf der Membran häufiger vorkommt als CTxB (Abbildung 6B). Wenn jedoch die Konzentration von CTxB im Vergleich zur Konzentration von AnV verdoppelt wird, verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung CTxB als vorherrschendes Protein auf der Membran. Wie für Mischungen von AnV und CTxB dargestellt, erlaubt MSPT nicht nur, membranassoziierte Makromoleküle nach ihrem Molekulargewicht zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch die Unterscheidung verschiedener Makromolekülpopulationen nach ihrem diffusiven Verhalten.

Wie bei allen Mikroskopietechniken sind einige experimentelle Anforderungen entscheidend, um die gewünschte Datenqualität zu erreichen. Ein wichtiges Beispiel in diesem Zusammenhang sind gründlich gereinigte Deckgläser. Im Allgemeinen wird dies als Voraussetzung für mikroskopische Einzelmolekülexperimente angesehen, aber MSPT ist besonders empfindlich gegenüber Probenverunreinigungen. Die erhöhte Streuung, die von der Glasoberfläche ungereinigter Deckgläser ausgeht, verhindert eine quantitative iCAT-Messung. Insbesondere Restschmutz oder Staubpartikel auf unzureichend gereinigtem Glas können zu bemerkenswerten Bildverzerrungen führen, die im nativen Bildgebungsmodus als helle Flecken erkennbar sind (Abbildung 7A). Obwohl diese Defekte durch die Hintergrundschätzung aufgrund ihrer statischen Natur entfernt werden, kann die genaue Bestimmung des Kontrastes eines Partikels beeinträchtigt werden und somit seine quantitative Analyse negativ beeinflussen. Ein weiteres häufiges Problem, das in MSPT-Experimenten auftritt, sind die verbleibenden Vesikel, die entweder (orange eingekreist) durch das Sichtfeld schweben oder unverschmolzene Vesikel, die an einer bestimmten Position auf der Membran stecken (blau eingekreist) und als große pulsierende Streuer erscheinen (Abbildung 7B). Um ihr Auftreten und ihre Beeinträchtigung der Filmaufnahme zu minimieren, wird empfohlen, die SLB vor der Zugabe des Proteins gründlich zu waschen und frisch zubereitete Mischungen aus kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs) und zweiwertigen Kationen zu verwenden.

Ein Faktor, der beim Design von massensensitiven Partikel-Tracking-Experimenten berücksichtigt werden muss, ist die Dichte der Makromoleküle, die mit der Membrangrenzfläche assoziiert sind. Hohe Partikeldichten auf der Membran können in der Tat aus zwei Gründen Probleme verursachen: i) Die Verknüpfung von Partikeldetektionen aus aufeinanderfolgenden Frames mit Trajektorien wird mehrdeutig und erhöht somit die Wahrscheinlichkeit von Fehlern und falsch eingeschätzten Diffusionskoeffizienten. ii) Die Masse der Partikel, die aus der Amplitude ihrer entsprechenden PSF-Anpassung extrahiert wird, wird systematisch unterschätzt und die Massenspitzen erweitern sich, da die Trennung des statischen Hintergrundsignals vom dynamischen Teilchensignal immer schwieriger wird (Abbildung 7C). Derzeit ist die visuelle Beurteilung der Datenqualität bei der Erfassung von MSPT-Videos mit den verfügbaren kommerziellen Mikroskopen schwierig, da die implementierte ratiometrische Ansicht in der Erfassungssoftware die für die Massenphotometrie 21 festgelegte Hintergrundentfernung anstelle des hier und in den Referenzen^24,25 beschriebenen medianbasierten Algorithmus verwendet (Abbildung ^7D ). Die mittelwertbasierte kontinuierliche Hintergrundentfernung, die zur Visualisierung von Landemolekülen in der Massenphotometrie verwendet wird, bewirkt, dass diffuse Partikel als dunkle Fronten mit hellen Schwänzen erscheinen, wodurch die Flecken hochgradig anisotrop erscheinen und die PSF-Anpassung während des Nachweisverfahrens stören. Somit ist der Einsatz der implementierten mittelwertbasierten Bildverarbeitung in der Erfassungssoftware für die Analyse diffuser Biomoleküle auf Membranen ungeeignet.

Abbildung 1: Prozessflussdiagramm der einzelnen Schritte, die zur Analyse von Protein-Membran-Wechselwirkungen mit dem massensensitiven Partikel-Tracking (MSPT) erforderlich sind. Um Proben für MSPT-Messungen vorzubereiten, müssen Glasdeckelobjektträger gründlich gereinigt und mit einem Sauerstoffplasma aktiviert werden. Nach ihrer Montage in Probenflusskammern werden kleine unilamellare Vesikel (SUVs) für die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) vorbereitet und alle Reaktionspuffer gefiltert, um die Hintergrundstreuung zu reduzieren. SUVs werden hinzugefügt, um Lipiddoppelschichten in den Durchflusskammern zu bilden. Optional können den SUVs zweiwertige Kationen wie Ca^{2 + -} Ionen zugesetzt werden, um den Vesikelbruch zu fördern. Schließlich werden niedrige Konzentrationen des interessierenden Proteins in die Reaktionskammer gespült. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Native und ratiometrische Ansicht exemplarischer Oberflächen, die für MSPT-Messungen relevant sind. Repräsentative Aufnahmen der Oberflächenrauheit eines Glasdeckelobjektträgers (A), während der Bildung einer gestützten Lipiddoppelschicht (B), mit einer intakten gestützten Lipiddoppelschicht (C) und von exemplarischen Proteinen, die auf einem SLB (D) rekonstituiert sind. Alle vier Beispiele werden im nativen Modus angezeigt, auf den während der Messung selbst zugegriffen werden kann, und als verarbeitete ratiometrische Bilder nach medianbasierter Hintergrundentfernung. Maßstabsbalken repräsentieren 1 μm. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: Mediane Fenstergröße (window_length) = 1001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Diagramm der für die MSPT-Datenerfassung und -analyse erforderlichen Phasen. Nach der Datenerfassung für die Probe von Interesse auf dem Massenphotometer werden Filme verarbeitet, um den statischen Hintergrund durch einen pixelweise gleitenden Medianansatz zu entfernen. Danach werden Kandidatenteilchen identifiziert und durch eine Punktausbreitungsfunktion (PSF) angepasst, bevor sie sich mit Partikelbahnen verbinden. Um die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten für jedes Partikel zu ermöglichen, wird die Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD) oder der Sprungdistanzverteilung (JDD) verwendet. In diesem Stadium können Kontrastwerte entsprechend der durch die Kalibrierstrategie ermittelten Kontrast-Masse-Beziehung in Molekülmassen umgewandelt werden. Als letzter Schritt können Trajektorien basierend auf ihrer Länge oder Membranpartikeldichte gefiltert und durch zweidimensionale Kerndichteschätzung (2D-KDE) visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Kalibrierung des Masse-Kontrast-Verhältnisses für MSPT-Messungen. (A) Repräsentative ratiometrische Rahmen, erhalten für beispielhafte Streptavidin-Standardproteinkomplexe, die auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht diffundieren, die einen kleinen Prozentsatz an biotinylierten Lipiden enthält (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE-Verhältnis von 70:29,99:0,01 mol%). Als Modell-Molekulargewichtsstandards werden monovalentes Streptavidin²⁸ (nur STP) oder zweiwertiges Streptavidin²⁸ im Komplex mit entweder biotinyliertem Rinderserumalbumin (BSA), biotinyliertem Protein A (prA), biotinylierter alkalischer Phosphatase (AP) oder biotinyliertem Fibronektin (FN) gezeigt. Kandidatenpunkte werden orange hervorgehoben (gestrichelte Kreise) und erfolgreiche Partikeldetektionen rot hervorgehoben (durchgezogene Kreise). Die Skalenbalken repräsentieren 1 μm. (B) Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen von Kontrastwerten, die für die fünf Modellstandardproteine erhalten wurden. Alle angezeigten Daten stellen gepoolte Verteilungen von drei unabhängigen Experimenten pro Bedingung dar: STP nur n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 und FN n = 71.759 Trajektorien. Im Vergleich zu Partikelzahlen, die für Membranen mit Proteinen bestimmt wurden, ist die Anzahl der auf einer leeren Doppelschicht nachgewiesenen Partikel bei moderaten Membrandichten vernachlässigbar (Ergänzende Abbildung 1). Kontrastspitzen, die für die Massenkalibrierung in Betracht gezogen werden, werden durch durchgehende Linien markiert, während gestrichelte Spitzen Oligomerzustände darstellen, die nicht berücksichtigt werden. (C) Kontrast-zu-Masse-Kalibrierkurve, abgeleitet aus Spitzenkontrasten in Panel D und den jeweiligen Sequenzmassen der Komplexe. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler der durch Bootstrapping geschätzten Spitzenpositionen an (100 Resamples mit jeweils 1.000 Trajektorien). Für die Datenanalyse (siehe Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 7 Frames (nur STP), 9 Frames (BSA/FN), 15 Frames (prA), 10 Frames (AP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Entschlüsselung von Oligomerzuständen membranassoziierter Proteine. (A) 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von tetravalentem Streptavidin im Komplex mit biotinylierter Aldolase (linkes Panel) oder mit einem Biotin-modifizierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (rechtes Bild). Die Rekonstitution beider Komplexe wurde auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht durchgeführt, die DOPC, DOPG und Biotinyl Cap PE in einem Verhältnis von 70:29,99:0,01 Mol% enthält. Insgesamt wurden 116.787 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für den Streptavidin-Aldolase-Komplex (Partikeldichte von 0,1 μm-2) und 348.405 für den Streptavidin-IgG-Komposit (Partikeldichte von 0,1 ^μm-2) eingeschlossen. Es wurden nur Partikel mit einer Spurlänge von mindestens fünf Frames aufgenommen. Es werden marginale Wahrscheinlichkeitsverteilungen sowohl der Molekülmasse (oben) als auch des Diffusionskoeffizienten (rechts) dargestellt. Das schwarze x in beiden Panels markiert die jeweiligen lokalen Maxima der KDE. (B) Vergleich der ermittelten Oligomermassen für den Komplex von tetravalentem Streptavidin mit biotinmodifizierter Aldolase (linkes Panel) oder biotinyliertem IgG (rechtes Panel) mit, entsprechend den Sequenzmassen, erwarteten Molekulargewichten. Die Abkürzung SU wird im Namen der Untereinheit "Protein of Interests" eingeführt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler der durch Bootstrapping geschätzten Spitzenpositionen an (100 Resamples mit jeweils 1.000 Trajektorien). Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresh) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Auflösung des diffusiven Verhaltens der nativen membranwechselwirkenden Proteine Annexin V (AnV) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTxB). (A) 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von Annexin V (linkes Bild) und Choleratoxin-Untereinheit B (rechtes Bild). Für die AnV- und CTxB-Membranrekonstitution wurden Lipidzusammensetzungen von 80:20 mol% DOPC zu DOPS bzw. 99,99:0,01 mol% DOPC zu GM1 verwendet. Insgesamt wurden 206.819 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für AnV (Partikeldichte von 0,1 ^μm-2) und 142.895 Trajektorien für CTxB (Partikeldichte von 0,2 ^μm-2) eingeschlossen. (B) 2D-Kerneldichteschätzungen von CTxB- und AnV-Gemischen in einem Verhältnis von 1:1 (linkes Bild) bzw. 2:1 (rechtes Bild). Die Rekonstitution von Proteinmischungen wurde auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht durchgeführt, die DOPC-, DOPS- und GM1-Lipide in einem Verhältnis von 80:19,99:0,01 Mol enthielt. Insgesamt wurden 42.696 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für das 1:1-Gemisch (Partikeldichte von 0,1 μm-2) und 264.561 Trajektorien für das 2:^{1-Verhältnis} (Partikeldichte von 0,3 ^μm-2) eingeschlossen. Sowohl für (A) als auch für (B) wurden nur Partikel mit einer Spurlänge von mindestens fünf Frames einbezogen. Es werden marginale Wahrscheinlichkeitsverteilungen sowohl der Molekülmasse (oben) als auch des Diffusionskoeffizienten (rechts) dargestellt. Das weiße x in jedem Panel markiert das jeweilige globale Maximum der KDE. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: Mediane Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Mögliche Komplikationen im Verlauf von MSPT-Messungen oder während der Datenanalyse. (A) Repräsentative Bilder der Oberflächenrauheit, die sowohl in der nativen als auch in der verarbeiteten (medianbasierten Hintergrundentfernung) ratiometrischen Ansicht eines ungereinigten Deckglasobjektträgers angezeigt werden. In beiden Fällen stellen helle Flecken Restoberflächenverunreinigungen dar, die artefaktfreie Messungen behindern. (B) Beispielhafte Bilder von Restvesikeln im Sichtfeld nach unzureichender Membranwäsche. Sowohl statische (blau hervorgehobene) als auch streuende (orange hervorgehobene) Vesikel beeinträchtigen die Messqualität entweder durch Pulsieren und Wackeln bzw. durch ihre Richtungsbewegung. (C) Als Einzelpartikeltechnik erfordert MSPT niedrige Partikeldichten (repräsentatives Bild, oberes Bild), um eine ordnungsgemäße Verknüpfung und Massenbestimmung jedes Partikels zu ermöglichen. Bei hohen Membran-Partikel-Dichten (mittleres Panel) ist die Partikelpassung beeinträchtigt, was sich auf die Massenbestimmung auswirkt (siehe unteres Panel). (D) Repräsentative ratiometrische Bilder von Partikeln, die auf einer Membrangrenzfläche nach entweder mittelbasierter (oberes Panel) oder medianbasierter Hintergrundentfernung diffundieren. Für die Diffusion von Partikeln erzeugt die mittlere Hintergrundentfernungsstrategie verzerrte Bilder der PSF des Partikels, wie sie in den kleinen Einsätzen zwischen dem oberen und mittleren Panel zu sehen sind. Im Gegensatz dazu können unverzerrte Partikel-PSFs durch den medianbasierten Ansatz erhalten werden. Unteres Feld: Vergleich von Linienprofilen durch die Mitte des PSF, erhalten nach mittel- oder medianbasierter Hintergrundentfernung. Für alle nativen und ratiometrischen Bilder, die in dieser Abbildung angezeigt werden, stellen die Maßstabsbalken 1 μm dar. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresh) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Vergleich von proteinfreien und besetzten Membranen. Repräsentative Bilder einer intakten gestützten Lipiddoppelschicht vor (A) und nach (B) der Zugabe von gereinigtem Streptavidin (STP). Kandidatenstellen, die erfolgreich an das Modell PSF angepasst wurden, sind rot eingekreist. (C) Kontrastwahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikeln, die auf einer leeren Membran (Membranhintergrund, grau) und auf einer Doppelschicht mit diffundierenden Streptavidinpartikeln (blau) nachgewiesen wurden. Beide Wahrscheinlichkeitsverteilungen stellen die gepoolten Daten von drei unabhängigen Experimenten mit identischen Filmerfassungs- und Analyseparametern dar. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 7 Frames. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsfilm 1: Beispielhafter Film, der den Bruch und die Verschmelzung von Vesikeln zu einer homogenen Membran zeigt, die mit dem Massenphotometer aufgezeichnet wurde. Bildverarbeitungs-Medianfenstergröße (window_length) = 1.001 Frames. Maßstabsbalken: 1 μm. Kameraanzahlbereich: schwarz = 16.892; weiß = 65.408. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzungsfilm 2: Beispielhafte Filme, die die Diffusion von Annexin-V- (oben) und biotinylierten Aldolase-Komplexen (unten) auf einer Doppelschicht zeigen, wie sie aus MSPT-Messungen gewonnen wurde. Bildverarbeitungs-Medianfenstergröße (window_length) = 1.001 Frames. Maßstabsbalken: 1 μm. Interferometrischer Streukontrastbereich: schwarz = -0,0075; weiß = 0,0075. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll erweitert die Massenphotometrie²¹, eine Technik, die die Masse einzelner Biomoleküle analysiert, die auf Glas adsorbieren, zu einem noch vielseitigeren Werkzeug, das in der Lage ist, gleichzeitig die Masse und Diffusion von nicht markierten membraninteragierenden Biomolekülen zu messen. Diese Analyseerweiterung wird durch die Implementierung einer modifizierten Hintergrundentfernungsstrategie erreicht, die an die laterale Bewegung der Moleküle angepasst ist^24,25. Im Allgemeinen ist die Hintergrundentfernung für iSCAT-basierte Ansätze von größter Bedeutung, da die starke Streuung der Glasoberflächenrauheit das Haupthindernis für die Analyse darstellt und die genaue Bestimmung des lokalen Hintergrunds jedes Pixels für die Quantifizierung der Partikelmasse und -position unerlässlich ist. Neben der an die Partikelbewegung angepassten Bildanalyse vervollständigen die anschließende Partikeldetektion, Trajektorienverknüpfung und Datenanalyse die neuartige Erweiterung von MP in die massensensitive Partikelverfolgung (MSPT).

Im Allgemeinen sind gründlich gereinigte Glasabdeckobjektträger und eine saubere Arbeitsumgebung kritische Voraussetzungen für die erfolgreiche Durchführung von MSPT-Experimenten. Aufgrund des Fehlens einer Makromolekülmarkierung ist das erworbene Signal von Natur aus nicht selektiv. Saubere Proben sowie die richtige Handhabung der Proben sind daher entscheidend, um sicherzustellen, dass Beobachtungen nicht falsch interpretiert werden können. Insbesondere bei der Untersuchung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht werden Kontrollmessungen von proteinfreien Membranen empfohlen, um Hintergrundbeiträge zu bewerten (Ergänzende Abbildung 1). Neben der Einbeziehung von Kontrollmessungen wird daher empfohlen, die in Abbildung 2 dargestellten Vorbereitungsschritte für jede Durchflusskammer zu befolgen. In Kombination stellen diese Sicherheitsmaßnahmen sicher, dass das detektierte Signal von dem interessierenden Biomolekül stammt und nicht beispielsweise von einer kontaminierten Durchflusskammer, einem Puffer oder einer Membran.

Neben den Vorsichtsmaßnahmen bezüglich des experimentellen Designs ist auch bei der MSPT-Bildverarbeitung Vorsicht geboten. Während der Videoverarbeitung sollte der Wert für drei Parameter sorgfältig ausgewählt werden, um korrekte Ergebnisse zu gewährleisten: i) die Länge des Medianfensters für die Hintergrundentfernung, ii) der Schwellenwert für die Partikelerkennung und iii) der maximale Suchradius während der Verknüpfungszuweisung. Ein größeres medianes Fenster (i) erleichtert im Allgemeinen die Trennung von diffusen Partikeln vom überlagerten quasi-konstanten Hintergrund. Bei zu großen Fenstergrößen wird sich die Probendrift jedoch schließlich bemerkbar machen und die Genauigkeit der Hintergrundschätzung verringern. Optimale Einstellungen hängen stark von den Probeneigenschaften und Messbedingungen ab. Dennoch kann ein Wert von 1.001 als robuster Ausgangspunkt herangezogen werden. Der Schwellenwertparameter (ii) muss in Abhängigkeit von der niedrigsten in der Probe erwarteten Molekülmasse abgestimmt werden. Ein Wert unter 0,0005 wird für Messungen mit dem in dieser Studie verwendeten Massenphotometer nicht empfohlen. Um die Analysezeiten zu verkürzen, können höhere Werte gewählt werden, wenn eine Probe mit hohem Molekulargewicht erwartet wird. Der Suchradius bei der Trajektorienverknüpfung (iii) gibt den maximalen radialen Abstand in Pixeln an, in dem die verschobene Position des Partikels in aufeinanderfolgenden Bildern gesucht wird. Es sollte an das schnellste Partikel in der Probe angepasst werden, und wenn es bevorzugt wird, könnte stattdessen ein adaptiver Suchbereich (siehe Dokumentation von Trackpy) verwendet werden, um die Rechenzeit zu reduzieren. Insbesondere in der Anfangsphase eines Projekts empfiehlt es sich, die Filme mit unterschiedlichen Parametern erneut zu analysieren, um die erzielten Ergebnisse zu validieren.

Angesichts der Einzelmolekülnatur von MSPT sollte es vermieden werden, bei hohen Membranpartikeldichten zu messen, da diese die genaue Kontrast- und Massenbestimmung beeinträchtigen können. Es hat sich gezeigt, dass Dichten unter einem Partikel pro Quadratmikrometer für MSPT-Messungen günstig sind²⁴. Eine weitere Überlegung sind die erwarteten Diffusionskoeffizienten in der Probe. Obwohl MSPT auf eine breite Palette von Diffusionskoeffizienten anwendbar ist, hat es eine untere Grenze für zugängliche Diffusionskoeffizienten. Durch die lokale Eingrenzung auf einen Bereich von wenigen Pixeln während eines signifikanten Teils des mittleren Fensterzeitraums wird das Partikel mit dem statischen Hintergrund zusammengeführt. Für die in diesem Protokoll verwendeten Bildgebungsbedingungen wird die Messung von Diffusionskoeffizienten unter 0,01 μm²/s nicht empfohlen. Bei dieser Diffusionsgeschwindigkeit beträgt beispielsweise die mittlere quadratische Verschiebung eines Partikels während der mittleren Fensterhälfte etwa 4 Pixel und ist damit ähnlich groß wie die Ausdehnung des PSF. Infolgedessen wird die statische Hintergrundschätzung wahrscheinlich Signalbeiträge des Partikels selbst enthalten, was zu einem scheinbar reduzierten Kontrast des Partikels führt, bis es sich schließlich dem Rauschpegel nähert. Makromolekül-Diffusionskoeffizienten zwischen 0,05 und 10 μm²/s können jedoch eindeutig aufgelöst werden.

Um das Spektrum der MSPT-Anwendungen weiter zu erweitern, kann man sich eine Weiterentwicklung des medianbasierten Hintergrundalgorithmus durch die Eliminierung von Pixeln vorstellen, die vorübergehend mit einem Partikel belegt sind, oder durch eine Korrektur der Abtastdrift, die größere mittlere Fenstergrößen ermöglicht. Beide Ansätze würden die Probleme bei Messungen bei hohen Partikeldichten und langsamer Diffusion lindern. Verbesserungen in Bezug auf die geringere Massenempfindlichkeit sind mit einer neuen Generation von Massenphotometern am Horizont, die den Zugang zu Biomolekülen kleiner als 50 kDa ermöglichen können. Daher werden zukünftige MSPT-Experimente in der Lage sein, Einzelmoleküldynamik und membranbezogene Wechselwirkungen für ein noch breiteres Spektrum von Membranmimikrien wie gepolsterte Doppelschichten und makromolekulare Systeme zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Annexin V	Sigma Aldrich	#SRP8026	Beispiel membraninteragierendes Protein
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad Laboratories Inc.	#5000006	Bradford-Assay-Kit zur Bestimmung der Proteinbestandskonzentrationen
Biotin-markiertes Rinderalbumin	Sigma Aldrich	#A8549	beispielhaftes Protein, das als Standardprotein für MSPT verwendet werden kann
Choleratoxin-Untereinheit B	Sigma Aldrich	#SAE0069	z.B. membraninteragierende
Protein-Deckgläser, #1.5, 24 x 24 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co.	KG#0102062
Deckgläser, #1,5, 24 x 60 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102242
Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)	Avanti Polar Lipids	#850375	Lipid - in Form von extrudierten kleinen unilamellären Vesikel, die für die unterstützte Lipiddoppelschichtbildung benötigt
werden Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap Biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	#870273	Lipid - in Form von extrudierten kleinen unilamellären Vesikel, die für die Bildung von Lipiddoppelschichten erforderlich sind
Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)	Avanti Polar Lipids	#840475	Lipid - in Form von extrudierten kleinen unilamellären Vesikel, die für die Bildung von Lipiddoppelschichten erforderlich sind
Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS)	Avanti Polare Lipide	#840035	Lipid - in Form von extrudierten kleinen unilamellären Vesikel, die für die Bildung von Lipiddoppelschichten benötigt
doppelseitiges Klebeband	TESA	#57912-00000-02	das für die Montage von Glasprobenkammern benötigt
Extruder	Avanti Polar Lipids	#610023	Lipid-Extruder zur Ermöglichung monodisperser Vesikelverteilungen
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#A39261	Maileimid-fusioniertes Biotin, das zur Biotinylierung von Standardproteinen für MSPT
Fibronektin (biotinyliert)	Cytoskeleton Inc.	#FNR03-Ein	Beispielprotein, das als Standardprotein für das MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit	Cytiva	#28403842	verwendet werden kann, Standardproteine, z.B. Aldolase, die biotinyliert und als Molekulargewichtsstandards für MSPT
GM1 Gangliosid (Gehirn, Schaf-Natriumsalz)	Avanti Polare Lipide	#860065	verwendet werden könnenLipid - in Form von extrudierten kleinen unilamellären Vesikel, die für die unterstützte Bildung von Lipiddoppelschichten erforderlich sind
Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Biotin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)#	31820	beispielhaftes Protein zur Hervorhebung des Vorhandenseins verschiedener Proteinzustände
Isopropanol, 99,5%, für die Spektroskopie	Thermo Fisher Scientific	#10003643
Niedriges Autofluoreszenz-Immersionsöl	Olympus K.K.	#IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive	Addgene	#20860	erforderlich zur Expression und Reinigung von divalentem Streptavidin in Kombination miteinander
pET21a-Streptavidin-Dead	Addgene	#20859	erforderlich zur Expression und Reinigung von divalentem Streptavidin in Kombination miteinander
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinyliert	Thermo Fisher Scientific	#29339	z.B. Protein, das als Standardprotein für MSPT
Pierce Protein A verwendet werden kann, biotinyliertes	Fisher Scientific	#29989	Beispielprotein, das als Standardprotein für MSPT
Refeyn Acquire	Refeyn Ltd.		Steuerungssoftware für Refeyn OneMP
Refeyn One	Refeyn Ltd.	-	Massenphotometer
sterile Spritzenvorsatzfilter 0,45 &Mikro; m Celluloseacetat-Membran	VWR International	#514-0063	benötigt, um Partikel aus dem Puffer von Interesse
zu filtern tetravalentes Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	#SNN1001	tetravalentes Streptavidin, um das Vorhandensein mehrerer Biotin-Bindungsstellen zu ermöglichen
Whatman Nuclepore Hydrophile Membran, 0,05 µ m Porengröße, 25 mm Circle	Cytiva	#110603	eine Porengröße von 50 nm wird für die unterstützte Lipid-Doppelschichtbildung im Rahmen des MSPT
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