Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Tränendrüsenstammzellen (LGSCs) erhalten die Zellerneuerung der Tränendrüse (LG) und sind die Quelle von Acin- und duktalen Zellen. Daher gilt die LGSC-Transplantation als alternativer Ansatz zur Behandlung schwerer entzündlicher Schäden und einer wässrig-defizienten Erkrankung des trockenen Auges (ADDED)^1,2,3. Mehrere Kulturmethoden wurden angewendet, um LGSCs anzureichern. Tiwari et al. trennten und kultivierten primäre LG-Zellen mit Kollagen I und Matrixgel, ergänzt mit mehreren Wachstumsfaktoren; Die LG-Zellen konnten jedoch nicht kontinuierlich kultiviert werden⁴. Unter Verwendung einer zweidimensionalen (2D) Kultur wurden von der Maus LG-abgeleitete Stammzellen von You et ^al.5 und Ackermann et al. isoliert. ⁶, die die Stamm- / Vorläuferzellmarkergene Oct4, Sox2, Nanog und Nestin exprimieren und subkultiviert werden könnten. Es gibt jedoch keinen eindeutigen Hinweis darauf, dass sich diese Zellen in Acinare oder duktale Zellen differenzieren können, und es gibt kein Transplantationsexperiment, um das Differenzierungspotenzial in vivo zu überprüfen.

Kürzlich wurden c-kit+ dim^/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-Zellen durch Durchflusszytometrie von Maus-LGs isoliert, es wurde festgestellt, dass sie ^{LG-Vorläuferzellmarker} wie Pax6 und Runx1 exprimieren und in vitro in Kanäle und Acini differenzieren. Bei Mäusen mit ADDED konnte die orthotope Injektion mit diesen Zellen beschädigte LGs reparieren und die sekretorische Funktion von LGs² wiederherstellen. Die Anzahl der mit dieser Methode isolierten Stammzellen war jedoch gering, und es gibt keine geeigneten Kulturbedingungen für die Expansion der isolierten LGSCs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein geeignetes Kultursystem eingerichtet werden muss, um erwachsene LGSCs mit stabiler und kontinuierlicher Expansion für die Untersuchung von LGSCs bei der Behandlung von ADDED effektiv zu isolieren und zu kultivieren.

Organoide, die aus Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, sind eine Gruppe von Zellen, die den verwandten Organen histologisch ähnlich sind und ihre eigene Erneuerung aufrechterhalten können. Nachdem das Darmorganoid der Maus 2009⁷ erfolgreich von Sato et al. kultiviert wurde, wurden Organoide aus anderen Organen nacheinander kultiviert, basierend auf Satos Kultursystem, wie z.B. Gallenblase⁸, Leber⁹, Bauchspeicheldrüse 10, Magen 11, Brust^{12, Lunge 13}, Prostata 14 und Speicheldrüse ¹⁵ . Aufgrund des hohen Anteils an adulten Stammzellen vor der Zelldifferenzierung in Organoidkultur gilt die dreidimensionale (3D) Organoidkulturmethode als optimal für die Isolierung und Kultur adulter Stammzellen von LG.

Ein LGSC-Kultursystem für erwachsene Mäuse wurde in der vorliegenden Studie durch Optimierung der 3D-, serumfreien Kulturmethode etabliert. Es ist erwiesen, dass die LGSCs, die sowohl von normalen als auch von ADDED-Mäusen kultiviert wurden, eine stabile Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Proliferation zeigten. Nach der Transplantation in die ADDED-Maus-LGs kolonisierten LGSCs die beeinträchtigten LGs und verbesserten die Tränenproduktion. Darüber hinaus wurden rot fluoreszierende LGSCs aus ROSA26^{mT/mG-Mäusen} isoliert und kultiviert. Diese Arbeit bietet eine zuverlässige Referenz für die LGSC-Anreicherung in vitro und LGSC-Autotransplantat in der klinischen Anwendung für die ADDED-Therapie.

Alle Experimente in diesem Protokoll folgten den Tierpflegerichtlinien des Ethikkomitees für Tierversuche der Sun Yat-sen Universität. Alle zellbezogenen Operationen sind an der ultrasauberen Werkbank im Zellenoperationssaal durchzuführen. Alle Operationen, bei denen Xylol verwendet wird, sind in Abzügen durchzuführen.

1. LGSC-Primärkultur

1. LG-Isolation
   1. Holen Sie sich eine 6-8 Wochen alte BALB / c männliche Maus und schneiden Sie die Haut hinter dem Ohr, um das LG und das Bindegewebe um es herum freizulegen. Bindegewebe durch stumpfe Dissektion mit Hilfe einer Pinzette abziehen und das LG entfernen.
   2. Spülen Sie die LGs zweimal mit 4 ml steriler 10 mM PBS-Lösung, um Blut in einer 6 cm Schale zu entfernen. Tauchen Sie die LGs in eine 6 cm Schale mit 4 ml 75% Ethanol für 10 s und spülen Sie sie zweimal sofort mit 10 mM PBS ab.
2. Erhalten Sie einzelne Zellen von LG
   1. Verwenden Sie HEPES-Pufferlösung (50 mM HEPES/KOH, PH 7,4; 150 mM NaCl in Reinstwasser), um 25 HE/ml Dispase herzustellen. Bereiten Sie die 0,1% ige Kollagenase I-Lösung mit Reinstwasser vor.
   2. Schneiden Sie die LGs in kleine Fragmente (ca. 1 mm³), geben Sie sie in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und behandeln Sie die Gewebe mit 500 μL 25 U/ml-Dispase und 500 μL 0,1% Kollagenase I für 1 h bei 37 °C.
   3. Verwenden Sie 10 mM PBS, um Trypsin-EDTA-Lösung vorzubereiten (0,05 g / L Trypsin, 0,04 g / L EDTA). Behandeln Sie die LG-Fragmente aus Schritt 1.2.2 mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 10 min bei 37 °C und dissoziieren Sie die Fragmente in einzelne Zellen durch wiederholtes Pipettieren.
   4. Filtern Sie die Suspension durch einen 70-μm-Filter, sammeln Sie das Filtrat in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrigieren Sie 5 min lang bei 150 × g .
   5. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, fügen Sie 10 ml 10 mM PBS hinzu, um das Zellpellet zu waschen, und zentrifugieren Sie die Suspension.
   6. Wiederholen Sie Schritt 1.2.5, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml DMEM/F12 (1:1-Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium und Hams F-12) hinzu, um die Zellpellets wieder auszusetzen.
3. LGSC Primärkultur
   1. Bereiten Sie das Tränendrüsenstammzellmedium (LGSCM) vor, das DMEM / F12, 1x N2-Ergänzung, 1x B27-Ergänzung, 2 mM Glutaminersatz, 0,1 mM NEAAs (nichtessentielle Aminosäuren), 50 ng / ml murinen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / ml Fibroblastenwachstumsfaktor 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A und 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor) enthält.
   2. Fügen Sie 20 μL Matrix-Gel-LGSCM-Matrix (Matrixgel: LGSCM = 1:1) in der Mitte der Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um sie zu einem Kreis (6-8 mm Durchmesser) zu erweitern, und inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei 37 ° C, um den Brunnen zu beschichten.
   3. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellzahl zu bestimmen, und addieren Sie 40 μL LGSCM mit insgesamt 1 × 10⁴ Zellen in 40 μL des Matrixgels. Mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette, um eine Matrix-Gel-LGSCM-Mischung zu erhalten (Matrix-Gel: LGSCM = 1:1).
   4. Verwenden Sie eine Pipette, um vorsichtig 80 μL der Mischung über den vorbeschichteten Bereich in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte in Schritt 1.3.2 fallen zu lassen.
   5. Die Mischung für 20 min bei 37 °C inkubieren und 600 μL LGSCM hinzufügen.
   6. Wechseln Sie das Kulturmedium in jedem Brunnen alle zwei Tage. Suchen Sie nach 7 Tagen Kultur nach LGSC-Kugeln mit einem Durchmesser von 100-300 μm unter dem inversen Mikroskop (Okular: 10x, Objektiv: 4x).
      HINWEIS: LGSCs können insgesamt länger als 14 Tage kultiviert werden.
4. Isolieren und kultivieren Sie primäre LGSCs von ROSA26 mT/mG-Mäusen und DED-Mäusen (NOD^/ShiLtJ ) gemäß den oben beschriebenen Schritten.

2. LGSC Wartung und Durchgang

1. Entfernen Sie das Kulturmedium gut aus der Sphärenkultur.
2. Disaggregieren Sie die LGSC-Kugeln, die 7 Tage lang durch Inkubation in 20 μL 10 U/ml Dispase und 100 μL 10 mM PBS für 30 min bei 37 °C kultiviert wurden.
3. Die Suspension für 4 min in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge bei 150 × g geben. Entfernen Sie den Überstand.
4. Behandeln Sie die Kugeln mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin-Inhibitor (TI) hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um das Trypsin zu neutralisieren und die Kugeln in einzelne Zellen zu dissoziieren.
5. 5 min bei 150 × g zentrifugieren und den Überstand entfernen, um LGSCs im Pellet zu erhalten. Fügen Sie 1 ml LGSCM hinzu, um das LGSC-Pellet zu resuspendieren.
6. Kennzeichnen Sie die einzelnen Zellen wie in den Schritten 1.3.1 bis 1.3.6 beschrieben.

3. LGSC-Differenzierung

1. Verfahren 1: Verlängern Sie die Kulturzeit von LGSCs von 7 auf 14 Tage mit dem LGSC-Kultursystem zur zufälligen Differenzierung.
2. Verfahren 2: Ändern Sie das Verhältnis der Matrix-Gel-LGSCM-Mischung von 1:1 auf 1:2 zu Beginn der LGSC-Kultur zur Differenzierung duktaler Zellen. Samen Sie die LGSCs für 14 Tage in die Matrix zur Induktion ein (siehe Schritt 1.3).
3. Verfahren 3: Ersetzen Sie die LGSCM nach der Passage durch die LGSCM-10% ige Mischung aus fetalem Rinderserum (FBS) zur Differenzierung von Acinarenzellen. Differenzierung für 14 Tage induzieren.

4. LG-Gewebeaustrocknung

1. LG-Gewebe (Schritt 1.1.1) erhalten und die LGs mit 4 ml steriler 10 mM PBS-Lösung in einer 6 cm Schale für 2 min ausspülen. Bewegen Sie das Gewebe zu 10% Formalinlösung zur Fixierung für 24 h.
2. Spülen Sie das fixierte Gewebe mit 10 mM PBS für 2 Minuten ab, um das Formalin zu entfernen, und geben Sie das Gewebe in eine Gewebeeinbettungsbox. Legen Sie die Einbettungsbox in den automatischen Dörrautomaten ein.
3. Verwenden Sie den automatischen Dörrautomaten, um das Gewebe wie folgt zu dehydrieren: 70% Ethanol, 2 h; 80% Ethanol, 2 h; 90% Ethanol, 30 min; 95% Ethanol, 30 min; absolutes Ethanol, 30min; absolutes Ethanol, 2 h; absolutes Ethanol: 100% Xylol (1: 1) Gemisch, 30 min; 100% Xylol, 30 min; 100% Xylol, 2 h; 100% Xylol: Paraffin (1: 1) Mischung, 30 min; Paraffin, 2 h; Paraffin,3 Std.

5. LG Organoid / Kugel Dehydratation

1. LG Organoide/Kugeln (Schritte 2.1-2.3) erhalten Sie in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und spülen Sie die LG Organoide/Kugeln mit 1 ml steriler 10 mM PBS-Lösung für 2 min ab.
2. Zentrifen Sie bei 100 × g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
3. Bereiten Sie die 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung wie folgt vor: 20 g PFA in eine Mischung aus 400 ml 10 mM PBS und 40 μL 1 M NaOH geben, die Lösung gut schütteln und in einem 65 °C warmen Wasserbad für 2 h erhitzen, bis die PFA vollständig aufgelöst ist. Verwenden Sie nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 10 mM PBS, um das Volumen auf 500 ml zu erhöhen, und lagern Sie es bei 4 ° C.
4. 1 ml 4% PFA in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Organoid/Kugelpellet geben und das Röhrchen zur Fixierung für mindestens 24 h in einen 4 °C Kühlschrank geben.
5. Nach der Fixierung 100 × g für 1 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 1 ml 10 mM PBS in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Organoid / Kugelpellet hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren für 2 Minuten, um das PFA abzuspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
6. 1 min bei 100 × g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
7. Einbettendes Hydrogel zum Auflösen erhitzen und 50-60 μL einbettendes Hydrogel in das Organoid / Kugelpellet geben und mischen. Die Mischung in Form eines Tröpfchens auf den Parafilm pipettieren und 5 Minuten warten, bis sie bei Raumtemperatur erstarrt ist.
8. Dehydrieren Sie das Gel mit den Organoiden/Kugeln in einem neuen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen wie folgt.
   1. Fügen Sie 1 ml 50% Ethanol in die Tube hinzu, warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie die Ethanolkonzentration nacheinander auf 70%, 80%, 90%, 95% ändern.
   2. Fügen Sie 1 ml absolutes Ethanol in die Tube hinzu, warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Rohr. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   3. Fügen Sie 1 ml einer Mischung aus 0,5 ml absolutem Ethanol und 0,5 ml 100% Xylol in die Tube hinzu, warten Sie 30 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Rohr.
   4. Fügen Sie 1 ml 100% Xylol in das Rohr hinzu, warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
      HINWEIS: Die Schritte 5.8.5-5.8.6 müssen in einem Metallbad bei 65 °C durchgeführt werden.
   5. Fügen Sie 1 ml einer Mischung aus 0,5 ml Paraffin und 0,5 ml 100% Xylol in die Tube hinzu, warten Sie 30 min bei 65 ° C und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Rohr.
   6. Fügen Sie 1 ml Paraffin in die Tube hinzu, warten Sie 30 Minuten bei 65 ° C und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus dem Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt und verlängern Sie die Bearbeitungszeit auf 1 h.

6. Paraffineinbettung und -schnitt

1. Paraffin-Einbettung
   1. Schalten Sie vor dem Einbetten die Einbettmaschine ein und heizen Sie sie vor, um das Paraffinwachs im Paraffintank zu schmelzen.
   2. Legen Sie das getrocknete Gewebe oder das Organoid / Kugelgel in die Rille der Einbettungseisenbox und legen Sie die Eisenbox in das Paraffin der Einbettmaschine.
   3. Entfernen Sie den Kunststoffdeckel und legen Sie die Kunststoffeinbettungsbox auf die Eisenbox, um sie abzudecken. Bringen Sie die Einbettungseisenbox auf einen Kühltisch.
   4. Nachdem das Paraffin in der Einbettbox zu Blöcken kondensiert ist, nehmen Sie es aus der Eisenbox und schneiden Sie es direkt in Scheiben oder lagern Sie es vorübergehend in einem 4 ° C Kühlschrank.
2. Paraffin-Schnitt
   1. Vor dem Paraffinschneiden die Paraffinschneidemaschine vormontieren und destilliertes Wasser zur Vorwärmung in die Spüle der Schneidemaschine geben. Beginnen Sie mit dem Schneiden, wenn die Wassertemperatur auf 42 ° C ansteigt.
   2. Fixieren Sie die Probe auf dem Probensteckplatz des Paraffinschneidegeräts. Stellen Sie die Querschnittsdicke beim Schneiden auf 5 μm ein.
   3. Schneiden Sie das Beispiel kontinuierlich ab. Befestigen Sie den vollständig gefliesten Abschnitt auf dem Antirutsch im Slicer-Tank.
   4. Nach dem Schneiden legen Sie die mit Probengewebe befestigten Objektträger in einen biochemischen Inkubator bei 37 ° C zum Trocknen für 24 h. Lagern Sie die Objektträger vorübergehend im Kühlschrank bei 4 °C.

7. Hämatoxylin- und Eosinfärbung

1. Die Paraffinabschnitte bei 60 °C 30 min schmelzen, die Abschnitte 15 min in 100% Xylol einweichen und wiederholen.
2. Behandeln Sie die Abschnitte mit absolutem Ethanol auf einem Shaker für 5 min.
3. Behandeln Sie die Abschnitte mit 90% Ethanol, 80% Ethanol und 70% Ethanol auf einem Shaker, jeweils für 3 min.
4. Behandeln Sie die Abschnitte mit entionisiertem Wasser auf einem Shaker für 5 min und 2 min nacheinander.
5. Färben Sie die Abschnitte auf einer nassen Box für 5 min mit 4 mg / ml Hämatoxylinlösung. Spülen Sie die Abschnitte in fließendem Wasser für 10 min.
6. Rühren Sie die Abschnitte auf einem Shaker zuerst mit entionisiertem Wasser für 2 min und dann mit 0,5% -1% Eosin für 1 min.
7. Rühren Sie die Abschnitte mit 70% Ethanol, 80% Ethanol und 90% Ethanol auf einem Shaker für jeweils 3 Minuten nacheinander. Rühren Sie die Abschnitte mit absolutem Ethanol auf einem Shaker für 5 min.
8. Weichen Sie die Abschnitte 15 Minuten lang in 100% Xylol ein und wiederholen Sie das Einweichen.
9. Verwenden Sie eine Pipette oder Pipette, um 3-4 Tropfen neutralen Balsam zum Objektträger hinzuzufügen, und bedecken Sie ihn langsam mit einem Abdeckobjektträger. Trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur an der Luft.

8. Immunhistochemische (IHC) Färbung

1. Die Paraffinabschnitte 30 min bei 60 °C schmelzen, die Abschnitte 10 min in 100% Xylol einweichen und diesen Schritt zweimal wiederholen.
2. Rühren Sie die Abschnitte auf einem Shaker zuerst mit absolutem Ethanol, 90% Ethanol und 80% Ethanol für 2 min (jeweils), nacheinander, und dann mit deionisiertem Wasser für 3 min. Wiederholen Sie das Rühren mit deionisiertem Wasser zweimal.
3. Die Abschnitte auf einem Shaker zunächst mit einer Mischung aus 20 mL 30%_H2O2und 180 mL Methanol für 10 min und dann mit entionisiertem Wasser für 5 min rühren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
4. Die Abschnitte werden in vorgekochten Zitronensäurepuffer (1 l deionisiertes Wasser mit 3 g Na₃C 6 H₅O 7,2H₂O und 0,4 g C 6 H₈O₇, pH _6,0), 10min in die Mikrowelle gegeben, um sie auf einem unterkritischen Siedepunkt zu halten, und bei Raumtemperatur 30 min abkühlen lassen. Rühren Sie die Abschnitte mit entionisiertem Wasser auf einem Shaker für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
5. Rühren Sie die Abschnitte mit 10 mM PBS auf einem Shaker für 5 min und wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Schließen Sie den Gewebebereich auf der nassen Box mit einem wasserabweisenden Marker ein, fügen Sie einen Tropfen gebrauchsfertiges, nicht immunes Ziegenserum hinzu, um die Proben zu bedecken, und legen Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
6. Entfernen Sie das Serum, fügen Sie den Proben einen primären Antikörper hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 ° C. Entfernen Sie den primären Antikörper, rühren Sie die Abschnitte mit 10 mM PBS auf einem Shaker für 5 min und wiederholen Sie diesen Rührschritt mit 10 mM PBS dreimal.
7. Fügen Sie einen sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Proben abzudecken, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Nassbox. Rühren Sie die Abschnitte mit 10 mM PBS auf einem Shaker für 5 min und wiederholen Sie den Rührschritt dreimal.
8. Frisch zubereitete 0,03-0,05%ige 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung hinzufügen, um die Proben auf der Nassschachtel abzudecken und 30-90 s zu färben. Spülen Sie die Abschnitte mit fließendem Wasser für 10 min.
   HINWEIS: Steuern Sie die Färbezeit, indem Sie unter einem Lichtmikroskop beobachten, bis eine gelbe Farbe erscheint.
9. Fügen Sie 4 mg / ml Hämatoxylinlösung hinzu, um die Proben zu bedecken, färben Sie für 5 Minuten auf einer nassen Box und spülen Sie die Abschnitte für 10 min mit fließendem Wasser ab.
10. Rühren Sie die Abschnitte auf einem Shaker mit 80% Ethanol, 90% Ethanol und absolutem Ethanol für jeweils 2 Minuten nacheinander und weichen Sie die Abschnitte für 30 min in 100% Xylol ein.
11. Verwenden Sie eine Pipette oder Pipette, um 3-4 Tropfen neutralen Balsam zum Objektträger hinzuzufügen, und bedecken Sie ihn langsam mit einem Abdeckobjektträger. Trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur an der Luft.

9. Globale Immunfluoreszenzfärbung von Organoiden/Sphären

HINWEIS: Die mit 4%iger PFA-Lösung fixierten Organoide/Kugeln werden in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt (siehe Schritte 5.1 bis 5.4). Führen Sie die Fluoreszenzmarkierung wie folgt durch.

1. Dehydrieren Sie die Organoide/Kugeln, indem Sie 1 ml 30%ige Saccharoselösung in das Röhrchen geben und über Nacht in einem Kühlschrank bei 4 °C inkubieren.
2. 100 μL PBST-Lösung (10 mM PBS-Lösung mit 0,1% Triton X-100) in das Röhrchen geben, um die Organoide/Kugeln für 5 min zu spülen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 × g für 1 min und sammeln Sie das Pellet. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
3. Geben Sie 0,5-1 ml gebrauchsfertiges, nicht immunes Ziegenserum in das Röhrchen und verschließen Sie es bei Raumtemperatur für 1 h. Zentrieren Sie das Röhrchen bei 100 × g für 1 min und sammeln Sie das Pellet.
4. Fügen Sie mehrere Tropfen verdünnten primären Antikörpers hinzu, um das Pellet einfach abzudecken und 48 h lang in einem Kühlschrank bei 4 ° C zu inkubieren. Zentrieren Sie das Röhrchen bei 100 × g für 1 min und sammeln Sie das Pellet.
5. Wiederholen Sie Schritt 9.2.
6. Fügen Sie mehrere Tropfen eines fluoreszierenden sekundären Antikörpers und einer 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Lösung in das Röhrchen hinzu, um das Pellet einfach abzudecken und in einem Kühlschrank bei 4 ° C für 24 h zu inkubieren, wobei Licht vermieden wird.
7. Wiederholen Sie Schritt 9.2 und vermeiden Sie Licht.
8. Geben Sie 100 μL PBST-Lösung in die Tube und lagern Sie sie vorübergehend in einem 4 ° C Kühlschrank, weg von Licht. Beobachten und fotografieren Sie die Organoide/Kugeln mit dem Lichtblatt-Rastermikroskop.

10. LGSC pLX-mCherry Transfektion

HINWEIS: Die Herstellung von lentiviralen Partikeln muss in einer Biosicherheitskabine und einer sauberen Bank auf BSL2-Biosicherheitsniveau durchgeführt werden.

1. Die Lentivirus-Verpackungszelle 293T in einer 6-Well-Platte mit DMEM + 10% FBS bei 37 °C, 5% CO₂ für 3-5 Tage kultivieren, um 80% Zellkonfluenz zu erreichen.
2. Transfect des Lentivirus-Vektors pLX-mCherry in LGSCs.
   HINWEIS: Die Reagenzienzubereitung ist für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte indiziert.
   1. Bereiten Sie zwei sterile 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor und fügen Sie jedem Röhrchen 250 μL DMEM/F12 hinzu.
   2. 7,5 μL Transfektionsreagenz in ein Röhrchen geben und das Reagenz gründlich durch Pipettieren mischen.
   3. 2 μg pLX-mCherry-Plasmid ohne Endotoxin und passendes Lentivirus-Verpackungsplasmid in ein anderes Röhrchen geben und das Transfektionsreagenz (2 μL/μg Plasmid) hinzufügen.
   4. Mischen Sie die Flüssigkeit in beiden Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Mischungen 5 min bei Raumtemperatur stehen.
   5. Entfernen Sie das Kulturmedium der 293T-Zellen und fügen Sie die Mischung aus Schritt 10.2.4 zu den 293T-Zellen hinzu. Wechseln Sie das Kulturmedium nach 8 h auf frisches DMEM + 10% FBS.
   6. Nach 48 h den Virusüberstand zum ersten Mal sammeln und durch einen 0,45 μm Filter filtern. Nach 72 h den Virusüberstand zum zweiten Mal sammeln und durch einen 0,45 μm Filter erneut filtern.
      HINWEIS: Lagern Sie beide gefilterten Überstände bis zur Lentivirus-Transduktion auf Eis.
3. Beziehen Sie die LGSCs von DED-Mäusen (NOD/ShiLtJ) (siehe Schritt 1).
4. Fügen Sie 1 ml des vorgesammelten pLX-mCherry-Lentivirus-Überstands hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren.
5. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf einen Shaker im CO₂ Inkubator auf 37 °C. Schütteln Sie es bei 100 U / min, um den Kontakt zwischen dem Lentivirus und den Zellen zu maximieren. Nach 8 h die Mischung bei 250 × g für 4 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
6. Fügen Sie 1 ml DMEM/F12 hinzu, um das Zellpellet zu resuspendieren. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellzahl zu bestimmen und eine Gesamtzelle von 1 × 10 4 Zellen in 100 μL Matrix-Gel-LGSCM-Matrix (Matrixgel: LGSCM = 1:1) in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte^, die mit 20 μL Matrix-Gel-LGSCM-Matrix vorbeschichtet ist (siehe Schritt 1.3.2).
7. Wählen Sie nach 7 Tagen Kultur (siehe Schritt 1) Kugeln mit roter Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop aus, um die Kultur zu erweitern.

11. LGSC orthotopische Transplantation

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe werden in einem SPF-Operationssaal durchgeführt und alle chirurgischen Instrumente werden sterilisiert.

1. Erhalten Sie die LGSC-Kugeln von ROSA26^{mT/mG-Mäusen} mit roter Fluoreszenz (td-Tomato) oder mCherry-Transfektion, die 7 Tage lang kultiviert wurden (siehe Schritt 1).
2. Ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 1:1-Mischung aus Matrixgel und DMEM/F12 vor Gebrauch auf Eis abkühlen. Verdauen Sie die LGSC-Kugeln zu einzelnen Zellen und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen / ml in der Röhre.
3. Anästhesien der NOD/ShiLtJ-Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg).
   HINWEIS: Die NOD / ShiLtJ-Maus ist ein ideales Modell mit idiopathischen ADDED-Symptomen, einschließlich reduzierter Tränensekretion, entzündlicher Infiltration und orbitaler Ulzeration.
4. Verwenden Sie nach der Anästhesie Kochsalzlösung oder Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern, und verwenden Sie dann eine Augenschere, um einen 5-8 mm langen Schnitt in die Haut hinter dem Ohr (in der Nähe des Auges) der Anästhesiemäuse zu machen, um die LGs freizulegen.
   HINWEIS: Iodophor sollte ausschließlich zur Desinfektion um den Schnitt herum verwendet werden.
5. Injizieren Sie 2 × 10⁴ Zellen in das linke LG und injizieren Sie das Gemisch ohne Zellen (siehe Schritt 11.2) in das rechte LG als Kontrolle.
6. Stellen Sie die LGs nach der Injektion mit einer Augenzange in ihre ursprüngliche Position zurück und nähen Sie die Wunde. Füttern Sie die Mäuse für 2 Monate und beobachten Sie die Wirkung der Behandlung.
   HINWEIS: Das Käfigkissenmaterial muss nach der Operation ebenfalls streng sterilisiert werden, und das Kissenmaterial sollte einmal täglich ausgetauscht werden. Nach dem Nähen der Wunde kann Tramadol selektiv in die Schwanzvene von Mäusen in der Standarddosis von 2,5 mg/kg injiziert werden, um eine Analgesie zu erreichen.
7. Diese Mäuse werden 2 Monate nach dem Experiment betäubt (siehe Schritt 11.3). Filmen Sie die Symptome der Augenregion.
   1. Suchen Sie während der Anästhesie nach folgenden Symptomen: Entspannung der Nacken- und Gliedmaßenmuskulatur; tiefe, langsame und stetige Atmung; Verengung der Schüler; Verschwinden des Hornhautreflexes.
   2. Halten Sie während der Anästhesie und Operation die Körpertemperatur von Mäusen bei 37 ° C. Nach der Operation fügen Sie dem Trinkwasser für Mäuse geeignete Antibiotika hinzu, um das Risiko einer Wundinfektion zu verringern. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Geben Sie die Mäuse, die operiert wurden, erst dann an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück, wenn sie vollständig genesen sind.
   3. Nachdem Sie die Symptome der Augenregion gefilmt haben, öffnen Sie die ImageJ-Software, klicken Sie auf Datei | | öffnen Freihandauswahl, halten Sie die linke Maustaste gedrückt und wählen Sie den Bereich der Orbitalgeschwüre im Bild aus. Klicken Sie auf | analysieren Maßnahme , um den relativen Bereich der Ulzeration zu erhalten.
8. Legen Sie den phenolroten Baumwollfaden für 10 s auf die seitliche Canthus von Anästhesiemäusen; Messen und erfassen Sie die Länge des verfärbten Teils des Baumwollfadens. Euthanasie die Mäuse durch Zervixwirbelluxation nach Tränenmessung.
9. Sezieren Sie die Mäuse und erhalten Sie die LGs für die IHC-Analyse.

12. RNA-Isolierung

HINWEIS: Kühlen Sie die Zentrifuge vor dem Experiment auf 4 °C vor und garantieren Sie, dass alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien frei von RNAse-Kontaminationen sind.

1. Sammeln Sie LGSCs oder LG-Fragmente in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 ml Zelllysepuffer hinzu und lysieren Sie die Zellen oder Gewebe vollständig durch Wirbelschwingung.
2. Fügen Sie 0,2 ml Chloroform hinzu und lassen Sie es nach der Wirbelschwingung für 1 min 10 min bei Raumtemperatur stehen. Zentrifuge für 15 min bei 4 °C, 12.000 × g.
   HINWEIS: Nach der Zentrifugation wird die Flüssigkeit in drei Schichten aufgeteilt, und die RNA befindet sich in der obersten transparenten wässrigen Phase.
3. Die oberste transparente wässrige Phase wird vorsichtig pipettiert und in ein neues 1,5 ml RNAse-freies Zentrifugenröhrchen überführt.
4. Fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropylalkohol hinzu und mischen Sie vorsichtig. Lassen Sie die Mischung 10 min bei Raumtemperatur stehen und zentrifugieren Sie dann 15 min bei 4 °C, 12.000 × g.
5. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 75% Ethanol hinzu. Drehen Sie das Rohr um, um das Pellet und die Zentrifuge für 5 min bei 4 °C, 7.500 × g zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
6. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und legen Sie das Zentrifugenröhrchen in die ultrasaubere Werkbank, um es für ca. 20 min zu trocknen.
   HINWEIS: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn das weiße Pellet durchscheinend wird. Führen Sie alle Operationen auf Eis durch.
7. Fügen Sie 20 μL RNAse-freies Wasser hinzu, um das Pellet vollständig aufzulösen. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) und lagern Sie die RNA-Lösung bei -80 °C.

13. PCR

1. Umgekehrte Transkriptionsreaktion
   1. 1 μg Gesamt-RNA (berechnen Sie das Volumen der zugesetzten RNA-Lösung entsprechend der Konzentration der RNA-Lösung) in das PCR-Reaktionsröhrchen geben und bei 65 °C für 5 min zur Denaturierung inkubieren.
   2. 1 min auf Eis legen und dann enzymfreies Wasser hinzufügen, bis das Gesamtvolumen 12 μL erreicht. Fügen Sie 4 μL 4x DNA Master Mix hinzu und inkubieren Sie es bei 37 ° C für 5 min.
   3. Legen Sie die Tube auf Eis, fügen Sie 4 μL 5x RT Master Mix hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Stellen Sie die folgenden PCR-Einstellungen ein: 37 °C für 15 min, 50 °C für 5 min, 98 °C für 5 min, 4 °C für 1 min.
   4. Lagern Sie es bei -20 ° C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, nachdem die umgekehrte Transkriptionsreaktion abgeschlossen ist.
2. PCR-Reaktion
   1. Bereiten Sie die PCR-Reaktion im PCR-Röhrchen wie folgt vor: 14,1 μL enzymfreies Wasser, 2 μL dNTP, 2 μL 10x Puffer, 0,8 μL Primer (10 μM, 0,4 μL Forward Primer und 0,4 μL Reverse Primer, siehe Tabelle der Materialien), 1 μL Reverse Transkription cDNA (siehe Schritt 13.1) und 0,1 μL Taq-Enzym.
   2. Setzen Sie die vorbereitete PCR-Reaktion in die PCR-Vorrichtung für die PCR ein. Für das PCR-Verfahren beachten Sie die Anleitung des Taq-Enzym-Kits (siehe Materialtabelle).
3. Agarosegel-Elektrophorese
   1. Mit einer Analysenwaage werden 242 g Tris und 37,2 g Na 2 EDTA·_{2H 2}O wiegen und zu einem 1 L Becherglas gegeben. Geben Sie ~ 800 ml deionisiertes Wasser und 57,1 ml Eisessigsäure in das Becherglas, mischen Sie gut, fügen Sie deionisiertes Wasser zu 1 L hinzu, um 50x TAE-Puffer zu erhalten, und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Verdünnen Sie den 50x TAE-Puffer vor Gebrauch mit deionisiertem Wasser.
   2. Verwenden Sie eine Analysenwaage, um 1,2 g Agarose zu wiegen, und geben Sie sie in einen konischen Kolben, der 80 ml 1x TAE-Puffer enthält. Erhitzen Sie es wiederholt in der Mikrowelle, bis es vollständig aufgelöst ist.
   3. Den Kolben unter fließendem Leitungswasser abkühlen, bis die Lösungstemperatur auf 60 °C sinkt. Fügen Sie 8 μL Nukleinsäureflecken hinzu, gießen Sie die Lösung nach dem Mischen in den Gelatinierungsbehälter, stellen Sie den Kamm auf und lassen Sie ihn 30 min bei Raumtemperatur stehen.
   4. Ziehen Sie den Kamm heraus und laden Sie die PCR-Produkte in das vorbereitete Agarosegel. Elektrophorese bei 120 V für 30 min durchführen.
   5. Legen Sie das Gel in das ECL Gel-Bildgebungssystem und fotografieren Sie.

Etablierung eines serumfreien 3D-Kultursystems
In dieser Studie wurde LGSCM mit EGF, Wnt3A, FGF10 und Y-27632 für Maus-LGSCs entwickelt, und LGSCs wurden erfolgreich isoliert und mit einer 3D-Kulturmethode kultiviert (Abbildung 1A). Ein erfolgreiches 3D-serumfreies Kultursystem aus LGSCs von C57BL/6-Mäusen, NOD/ShiLtJ-Mäusen, BALB/c-Mäusen und ROSA26mT/mG-Mäusen wurde mit dieser Methode16 etabliert. Für eine männliche Maus wurden 1,5-2 × 106 Zellen aus zwei LGs durch Dissoziation gewonnen. Nach einer Woche Kultur bildeten sich 30-60 Kugeln bei der Aussaat von 1 × 104 LG-Zellen zu Beginn der Kultur. Darüber hinaus exprimierten die mit dieser Methode kultivierten Zellen Epcam, Krt5, Krt14, P63, Nestin und andere Stammzellmarker16, was darauf hindeutet, dass die erhaltenen Zellen die Eigenschaften von LGSCs aufwiesen. Krt14 und Ki67 wurden in allen Kugeln exprimiert, die von LGSCs gebildet wurden, die 7 Tage lang kultiviert waren (Abbildung 1B), was darauf hindeutet, dass die LGSCs eine Selbsterneuerungskapazität hatten.

Während einer 7-tägigen Kultur erreichten LGSC-Kugeln einen Durchmesser von 100 μm. Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung zeigten Zellularität an Tag 7 (Abbildung 1C und Abbildung 1F). Die Anreicherungsfaktoren von LGSC, die nach 7 Tagen Primärkultur und Subkultur erhalten wurden, deuteten darauf hin, dass die mit dieser Methode angereicherten LGSCs eine starke Proliferationsfähigkeit aufwiesen (Abbildung 1D). In diesem System konnten LGSCs über 40 Mal durchgangen werden, und sie behielten immer noch Stammzelleigenschaften bei (Abbildung 1E und Abbildung 1G). Abschließend beschreibt dieses Papier ein Protokoll zur Etablierung eines serumfreien 3D-Kultursystems für LGSCs in vitro. Die durch dieses Protokoll kultivierten Zellen haben eine kontinuierliche und stabile proliferative Fähigkeit.

Differenzierung in vitro induzieren
Die Differenzierungskapazität von LGSCs in vitro wurde analysiert. Wenn sie länger als 7 Tage kultiviert wurden, verloren LGSCs allmählich an Wachstumsfähigkeit, und die Expression von AQP5, Ltf, Krt19 und anderen mit der Differenzierung verbundenen Markern nahm zu, während die Expression von Krt14 allmählich um16 abnahm. LGSCs wurden durch FBS und einen geringen Anteil an Matrixgel dazu gebracht, mehr Knospen zu bilden (Abbildung 2A, B). Darüber hinaus zeigte die H & E-Färbung, dass FBS die Kugeln dazu bringen könnte, mehr kavitierende Strukturen zu erzeugen (Abbildung 2C).

Die bisherigen Arbeiten deuteten darauf hin, dass die abnehmende Matrixhärte die Differenzierung von LGSCs in duktal-ähnliche Organoide förderte. Die Basalschichtzellen behielten die Eigenschaften von Stammzellen bei, die Krt14 exprimierten, während sich die basalen oberen Schichtzellen zu kanalartigen Strukturen mit Hohlräumen differenzierten und Krt19 exprimierten. Darüber hinaus könnte die Zugabe von FBS die Differenzierung von LGSCs in Acinar-ähnliche Organoide induzieren, die die Eigenschaften von Stammzellen mit hohem Kern-Zytoplasma-Verhältnis beibehalten. Einige differenzierte Acinar-ähnliche Zellen exprimierten hohe AQP5-Spiegel mit niedrigem Kern-Zytoplasma-Verhältnis16.

 LGSCs in vivo reparieren 
Basierend auf den oben genannten Experimenten wurde die Fähigkeit von LGSCs, beschädigte LGs zu reparieren, durch orthotopische Injektion untersucht. Nach orthotoper Injektion von ROSA-LGSCs in NOD/ShiLtJ-Mäuse bildeten sich neben den LGs neue Tränenläppchen (Abbildung 3A-C). Die meisten Läppchen bestanden aus reifen Acinarzellen mit hoher Expression von AQP5, und es gab eine intralobuläre Kanalbildung mit niedriger AQP5-Expression (Abbildung 3D-F). Nach Injektion von ROSA-LGSCs für 8 Wochen wurde der Zerfall um die Umlaufbahn der Empfänger gemessen. Die Messungen zeigten, dass die Injektion von LGSCs die Zerfallsfläche um ~60% reduzierte (Abbildung 3G, H). Die Dissektion zeigte, dass das LG-Volumen nach der Injektion für 10 Wochen zunahm (Abbildung 3I). Die Menge an Tränensekretion auf der ROSA-LGSC-Injektionsseite war höher als auf der Kontrollseite, aber niedriger als bei Wildtyp-Mäusen (Abbildung 3J). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die von diesem Kultursystem geernteten Zellen die Eigenschaften von LGSCs aufweisen und für die Stammzelltherapie bei Mäusen mit ADDED und Xerophthalmie verwendet werden können.

Abbildung 1: Isolierung und Charakterisierung von LGSCs . (A) Die Strategie der primären und kontinuierlichen Passagekultur der LGSC. (B) Immunfluoreszenzfärbung von LGSCs am Tag 7. LGSCs exprimieren Epithelzellmarker E-Cadherin (rot), Stammzellmarker Krt14 (rot), proliferativer Zellmarker Ki67 (rot). Gegenfleck, DAPI (blau). (C) Die Morphologie der LGSCs in Kultur für 1, 3, 5 und 7 Tage. (D) Relativer Anreicherungsfaktor der LGSC-Kultur in der Primärkultur und Subkultur. Der relative Anreicherungsfaktor ist das Verhältnis der Gesamtzahl der nach 7 Tagen Kultur erhaltenen Zellen zur Anzahl der in Kultur ausgesäten Zellen. P < 0,01. (E) Transkription von adulten Stamm-/Vorläuferzellmarkern der Maus LG und verschiedener Passage LGSCs (P1, P10, P20 und P40). (F) Die Morphologie (links) und H & E-Färbung (rechts) von LGSCs in der Primärkultur am Tag 7. (G) LGSCs, die in verschiedenen Passagen kultiviert sind (P1, P10, P20 und P40). Maßstabsstäbe = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Abkürzungen: LG = Tränendrüse; LGSCs = LG-Stammzellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol;; NC = Negativkontrolle; TE = Trypsin-EDTA; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Differenzierung von LGSCs in vitro. (A,B) Morphologie von LGSCs, die in normalem Medium oder Differenzierungsmedium kultiviert werden. (A) LGSC, die 10 Tage lang in P10 kultiviert wurden (links: normales Medium, rechts: FBS-haltiges Medium). (B) LGSCs 14 Tage lang in P31 kultiviert (links: normales Medium, rechts: Medium mit 1/3rd-Matrixgel). (C) H&E-Färbung der 14 Tage lang kultivierten LGSCs (oben: normales Medium, unten: FBS-haltiges Medium). Maßstabsstäbe = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Abkürzungen: LG = Tränendrüse; LGSCs = LG-Stammzellen; H&E = Hämatoxylin und Eosin; FBS = fetales Rinderserum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Transplantation von LGSCs Allotransplantation und Linderung der ADDED-Symptome. (A-F) IHC-Färbung von NOD/ShiLtJ LG, transplantiert mit 7-Tage-Kulturen von ROSA-LGSCs nach 8 Wochen. Verwenden Sie die linke und rechte Seite derselben Maus wie die experimentelle Gruppe und die Kontrollgruppe. (A-C) IHC-Färbung mit Anti-td-Tomaten-Antikörper; (D-F) IHC-Färbung mit Anti-AQP5-Antikörper; (A, D) LG injiziert mit Fahrzeug (1:1 Mischung aus Matrixgel und DMEM/F12), (B, E) LG injiziert mit ROSA-LGSCs, (C, F) die vergrößerten Bilder der schwarzen Quadrate in B, E (roter Pfeil, intralobulärer Kanal). (G, H) Der Zustand der NOD/ShiLtJ-Mausaugenhöhle nach Injektion von ROSA-LGSCs nach 8 Wochen. Die Injektion von LGSCs lindert den Zerfall um die Augenhöhle erheblich. (I) LGs der NOD/ShiLtJ-Maus nach 10 Wochen (links: LG von der zellinjizierten Seite, rechts: LG von der Kontrollseite). (J) Tränenvolumen von Wildtyp- und NOD/ShiLtJ-Mäusen, denen nach 8 Wochen 7-Tage-Kulturen von ROSA-LGSCs transplantiert wurden. Das Tränenvolumen von ROSA-LGSC-injizierten LGs ist höher als das der Kontroll-LGs, aber deutlich niedriger als das von WT-LGs. n = 3; NOD/ShiLtJ-Mäuse, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Maßstabsstäbe = 50 μm (A-F). Abkürzungen: LG = Tränendrüse; LGSCs = LG-Stammzellen; IHC = immunhistochemisch; WT = Wildtyp; HINZUGEFÜGT = wässrig-defiziente Erkrankung des trockenen Auges. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.