Name: Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie ein serumfreies Kultursystem zur Anreicherung von Tränendrüsenstammzellen aus BALB/c-Mäusen. Diese Methode ermöglicht Langzeitexpansion und Differenzierung für regenerative Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31871413) und zwei Programme von Guangdong Science and Technology (2017B020230002 und 2016B030231001) unterstützt. Wir sind den Forschern, die uns während der Studie geholfen haben, und den Mitarbeitern des Tierzentrums für ihre Unterstützung bei der Tierpflege wirklich dankbar.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Es gibt etablierte Methoden zur Isolierung und In-vitro-Kultur von Tränenstammzellen für die Tränenstammzellkultur und die LG-Verletzungsreparatur. Shatos et al.17 und Ackermannet al. 6 erfolgreich kultivierte und subkultivierte Tränenstammzellen von Ratten und Mäusen durch 2D-Kulturmethoden, wodurch es möglich ist, Tränenstammzellen für die Behandlung von ADDED zu transplantieren. Studien an Stammzellen18 und mesenchymalen Stammzel...

Tränendrüsenstammzellen (LGSCs) erhalten die Zellerneuerung der Tränendrüse (LG) und sind die Quelle von Acin- und duktalen Zellen. Daher gilt die LGSC-Transplantation als alternativer Ansatz zur Behandlung schwerer entzündlicher Schäden und einer wässrig-defizienten Erkrankung des trockenen Auges (ADDED)1,2,3. Mehrere Kulturmethoden wurden angewendet, um LGSCs anzureichern. Tiwari et al. trennten und kultivierten primäre LG-Zellen mit Kollagen I und Matrixgel, ergänzt mit mehreren Wachstumsfaktoren; Die LG-Zellen konnten jedoch nicht kontinuierlich kultiviert werden4. Unter Verwendung einer zweidimensionalen (2D) Kultur wurden von der Maus LG-abgeleitete Stammzellen von You et al.5 und Ackermann et al. isoliert. 6, die die Stamm- / Vorläuferzellmarkergene Oct4, Sox2, Nanog und Nestin exprimieren und subkultiviert werden könnten. Es gibt jedoch keinen eindeutigen Hinweis darauf, dass sich diese Zellen in Acinare oder duktale Zellen differenzieren können, und es gibt kein Transplantationsexperiment, um das Differenzierungspotenzial in vivo zu überprüfen.
Kürzlich wurden c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-Zellen durch Durchflusszytometrie von Maus-LGs isoliert, es wurde festgestellt, dass sie LG-Vorläuferzellmarker wie Pax6 und Runx1 exprimieren und in vitro in Kanäle und Acini differenzieren. Bei Mäusen mit ADDED konnte die orthotope Injektion mit diesen Zellen beschädigte LGs reparieren und die sekretorische Funktion von LGs2 wiederherstellen. Die Anzahl der mit dieser Methode isolierten Stammzellen war jedoch gering, und es gibt keine geeigneten Kulturbedingungen für die Expansion der isolierten LGSCs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein geeignetes Kultursystem eingerichtet werden muss, um erwachsene LGSCs mit stabiler und kontinuierlicher Expansion für die Untersuchung von LGSCs bei der Behandlung von ADDED effektiv zu isolieren und zu kultivieren.
Organoide, die aus Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, sind eine Gruppe von Zellen, die den verwandten Organen histologisch ähnlich sind und ihre eigene Erneuerung aufrechterhalten können. Nachdem das Darmorganoid der Maus 20097 erfolgreich von Sato et al. kultiviert wurde, wurden Organoide aus anderen Organen nacheinander kultiviert, basierend auf Satos Kultursystem, wie z.B. Gallenblase8, Leber9, Bauchspeicheldrüse 10, Magen 11, Brust12, Lunge 13, Prostata 14 und Speicheldrüse 15 . Aufgrund des hohen Anteils an adulten Stammzellen vor der Zelldifferenzierung in Organoidkultur gilt die dreidimensionale (3D) Organoidkulturmethode als optimal für die Isolierung und Kultur adulter Stammzellen von LG.
Ein LGSC-Kultursystem für erwachsene Mäuse wurde in der vorliegenden Studie durch Optimierung der 3D-, serumfreien Kulturmethode etabliert. Es ist erwiesen, dass die LGSCs, die sowohl von normalen als auch von ADDED-Mäusen kultiviert wurden, eine stabile Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Proliferation zeigten. Nach der Transplantation in die ADDED-Maus-LGs kolonisierten LGSCs die beeinträchtigten LGs und verbesserten die Tränenproduktion. Darüber hinaus wurden rot fluoreszierende LGSCs aus ROSA26mT/mG-Mäusen isoliert und kultiviert. Diese Arbeit bietet eine zuverlässige Referenz für die LGSC-Anreicherung in vitro und LGSC-Autotransplantat in der klinischen Anwendung für die ADDED-Therapie.

<table><tbody><tr><td>Animal (Mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Model Animal Research Center der Universität</td><td></td><td></td>Nanjing</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Laboratory Animal Center der Sun Yat-sen University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Model Animal Research Center der Universität</td><td></td><td></td>Nanjing</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Model Animal Research Center der Universität</td><td></td><td></td> Nanjing</tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Dörrautomat</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blutzählkammer</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator mit konstanter Temperatur</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Gel-Bildgebungssystem</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrisches Bad für das Wasserbad</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresegerät</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>quantitatives Fluoreszenz-PCR-Instrument</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneidemaschine für gefrorenes Gewebe</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontale Zentrifuge</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Lamellare Rastermikroskopaufnahme</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoffbehälter</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperatur hoch Geschwindigkeitszentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Ultraviolett-Spektralphotometer</td><td>Thermo</td><td>Messung der RNA-Konzentration</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinschneidemaschine</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Verstärker</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Wert-Tester</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Kühlschrank</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermostatischer Kulturoszillator</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument zur Einbettung von Gewebeparaffin</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Ultra-Tieftemperatur-Kühlschrank</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&Grad; C Ultratiefkühlschrank</td><td>Thermo</td> Reinstwasseraufbereitungssystem ELGA<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tierversuch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Sigma D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>Sigma 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Mensch FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matrixgel)BD</td><td></td> <td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Maus EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Abgeleitet von Glycin max; kann Trypsin, Chymotrypsin und Plasminase in geringerem Maße hemmen. Ein mg hemmt 1,0-3,0 mg Trypsin.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049<</td><td></td></tr><tr><td>strong>HE Färbung & Immunfärbung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Verwendete Verdünnung: IHC) 2 &mu; g/ml, (WENN) 0,2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 2 &mu; g/ml, (WENN) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Esel Anti-Maus IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 2 &mu; g/ml, (WENN) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 2 &mu; g/mL, (WENN) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-AQP5 Kaninchen-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 1 &mu; g/mL, (WENN) 0,1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin Ratten-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Verwendete Verdünnung: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Keratin14 Kaninchen-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 1 &mu; g/ml, (WENN) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Kaninchen-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 1 &mu; g/mL, (WENN) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry Maus Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Verwendete Verdünnung: (IHC) 2 &mu; g/ml, (WENN) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry Kaninchen Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Verwendete Verdünnung: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB Kit (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Halterung Medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG Antikörper (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Verwendete Verdünnung: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Verwendete Verdünnung: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (Einbettung von Hydrogel)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Neutraler Balsam</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Neutraler Balsam</td><td></td></tr><tr><td>Nicht immunisiertes Ziegenserum</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat tribasisches Dihydrat</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Verbindung</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Guangzhou Chemie</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Grün I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td> <td>DNA-Polymerase</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (Nukleinsäure stain)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Construction & Zelltransfektion</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td> <td>OXID-Ampicillin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Endotoxinfreies Plasmid-Extraktionskit</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plasmid Transfektionskit</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR Reaktionskit</td><td>Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Extraktionskit</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; Chemisch kompetente Zelle</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Tryton</td><td></td> <td>OXID></td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>OXID</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><strongPrimer und Sequenz</td><td>Company<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 Lentivirus No-Load Vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin Labor, Sun Yat-sen Universität</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dreidimensionales, serumfreies kultursystem für tränendrüsenstammzellen

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Die auf Tränendrüsen (LG) basierende Therapie ist eine vielversprechende Strategie für Tränendrüsenerkrankungen. Das Fehlen einer zuverlässigen, serumfreien Kulturmethode, um eine ausreichende Anzahl von LG-Stammzellen (LGSCs) zu erhalten, ist jedoch ein Hindernis für die weitere Forschung und Anwendung. Die dreidimensionale (3D), serumfreie Kulturmethode für erwachsene Maus-LGSCs ist hier gut etabliert und gezeigt. Die LGSCs könnten kontinuierlich durchgangen und dazu gebracht werden, sich zu Acinare oder duktalen Zellen zu differenzieren.
Für die LGSC-Primärkultur wurden die LGs von 6-8 Wochen alten Mäusen mit Dispase, Kollagenase I und Trypsin-EDTA verdaut. Insgesamt 1 × 104 Einzelzellen wurden in 80 μL Matrix-Gel-Tränendrüsen-Stammzell-Medium-Matrix (LGSCM) in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte gesät, die mit 20 μL Matrix-Gel-LGSCM-Matrix vorbeschichtet war. Die Mischung wurde nach der Inkubation für 20 min bei 37 °C erstarrt und 600 μL LGSCM zugegeben.
Für die LGSC-Wartung wurden LGSCs, die 7 Tage lang kultiviert wurden, durch Dispase und Trypsin-EDTA in einzelne Zellen disaggregiert. Die einzelnen Zellen wurden nach der in der LGSC-Primärkultur verwendeten Methode implantiert und kultiviert. LGSCs konnten über 40 Mal durchgangen werden und kontinuierlich die Stamm- / Vorläuferzellmarker Krt14, Krt5, P63 und Nestin exprimieren. LGSCs, die in LGSCM kultiviert werden, haben eine Selbsterneuerungskapazität und können sich in vitro und in vivo in Acinare oder duktale Zellen differenzieren.

Etablierung eines serumfreien 3D-Kultursystems In dieser Studie wurde LGSCM mit EGF, Wnt3A, FGF10 und Y-27632 für Maus-LGSCs entwickelt, und LGSCs wurden erfolgreich isoliert und mit einer 3D-Kulturmethode kultiviert (Abbildung 1A). Ein erfolgreiches 3D-serumfreies Kultursystem aus LGSCs von C57BL/6-Mäusen, NOD/ShiLtJ-Mäusen, BALB/c-Mäusen und ROSA26mT/mG-Mäusen wurde mit dieser Methode16 etabliert. Für eine männliche Maus wurden 1,5-2 ×...

Die dreidimensionale, serumfreie Kulturmethode für adulte Tränendrüsenstammzellen (LG) ist für die Induktion der Bildung und Differenzierung von LG-Organoiden in Acinare oder duktale Zellen gut etabliert.

Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Dieses Protokoll bietet eine vorteilhafte Strategie zur Anreicherung von Tränendrüsenstammzellen für die Regeneration und Rekonstruktion der Tränendrüse. Tränendrüsenstammzellen zeigen eine langfristige Expansionskapazität und das Potenzial der Differenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Kulturmedium für Tränendrüsenstammzellen serumfrei ist, was den enormen Wert für die Reparatur der Tränendrüse zeigt Beginnen Sie, indem Sie eine sechs bis acht Wochen alte BALB / c-männliche Maus erhalten und die Haut hinter dem Ohr schneiden, um die Tränendrüse und das sie umgebende Bindegewebe freizulegen.Ziehen Sie das Bindegewebe durch stumpfe Dissektion mit Hilfe einer Pinzette ab und entfernen Sie die Tränendrüse. Tauchen Sie die Tränendrüsen 10 Sekunden lang in eine sechs Zentimeter große Schale mit vier Millilitern 75% Ethanol und spülen Sie sie sofort zweimal mit 10-Millimolar-PBS-Lösung ab. Schneiden Sie die Tränendrüsen in kleine Fragmente von etwa einem Millimeter gewürfelt.Geben Sie sie in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und behandeln Sie das Gewebe mit 500 Mikrolitern von 25 Einheiten pro Milliliterdispase und 500 Mikrolitern 0,1% Kollagenase I für e

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.

Manipulation der Murine Lakrimal

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.

Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Tränendrüsenorganoide, die aus primärem Maus- und menschlichem Gewebe gewonnen werden, hergestellt, erhalten, genetisch verändert, differenziert, funktionell charakterisiert und transplantiert werden.

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Dissoziation alter Maus-Tränendrüsen, um lebensfähige Einzelzellen für die Sequenzierung einzelner RNA zu erhalten. Sequentielle enzymatische Verdauung und sanfte Handhabung erhalten die Zellintegrität und liefern hochwertige Suspensionen, die für zelltypspezifische Isolation und transkriptomische Analyse altersassoziierter Veränderungen in Tränendrüsenpopulationen geeignet sind.

Protokoll für Einzelzell-Dissoziation, RNA-Sequenzierung und Isolierung von Myoepithelzellen und Fibroblasten aus den gealterten Lacrimal- und Speicheldrüsen

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Menschliche Thrombozyten-Lysat ist eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren und eine starke Ergänzung in der Zellkultur. Dieses Protokoll stellt den Prozess der Vorbereitung einen großen Pool an menschlichen Thrombozyten-Lysat ausgehend von platelet rich plasma, Durchführung mehrerer Gefrier-Auftau-Zyklen und zum Abbau der Thrombozyten-Fragmente.

Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Erfahren Sie ein serumfreies Kultursystem zur Anreicherung von Tränendrüsenstammzellen aus BALB/c-Mäusen. Diese Methode ermöglicht Langzeitexpansion und Differenzierung für regenerative Forschung.

Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

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