Summary

Dosisaufnahme der platin- und rutheniumbasierten Verbindungsexposition in Zebrafischen durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma mit breiteren Anwendungen

Published: April 21, 2022
doi:

Summary

Die erhöhte Rate pharmako- und toxikokinetischer Analysen von Metallen und metallbasierten Verbindungen in Zebrafischen kann für Umwelt- und klinische Translationsstudien von Vorteil sein. Die Begrenzung der unbekannten Wasserexpositionsaufnahme wurde durch die Durchführung von Spurenmetallanalysen an verdautem Zebrafischgewebe unter Verwendung der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma überwunden.

Abstract

Metalle und metallbasierte Verbindungen umfassen vielfältige pharmakoaktive und toxikologische Xenobiotika. Von der Schwermetalltoxizität bis hin zu Chemotherapeutika hat die Toxikokinetik dieser Verbindungen sowohl historische als auch moderne Relevanz. Zebrafische sind zu einem attraktiven Modellorganismus für die Aufklärung der Pharmako- und Toxikokinetik in Umweltexpositions- und klinischen Translationsstudien geworden. Obwohl Zebrafischstudien den Vorteil haben, dass sie einen höheren Durchsatz haben als Nagetiermodelle, gibt es mehrere signifikante Einschränkungen für das Modell.

Eine solche Einschränkung ist dem wässrigen Dosierungsschema inhärent. Die Wasserkonzentrationen aus diesen Studien können nicht extrapoliert werden, um zuverlässige interne Dosierungen zu liefern. Direkte Messungen der metallbasierten Verbindungen ermöglichen eine bessere Korrelation mit verbindungsbezogenen molekularen und biologischen Antworten. Um diese Einschränkung für Metalle und metallbasierte Verbindungen zu überwinden, wurde eine Technik entwickelt, um Zebrafischlarvengewebe nach der Exposition zu verdauen und Metallkonzentrationen in Gewebeproben durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICPMS) zu quantifizieren.

ICPMS-Methoden wurden verwendet, um die Metallkonzentrationen von Platin (Pt) aus Cisplatin und Ruthenium (Ru) aus mehreren neuartigen Ru-basierten Chemotherapeutika im Zebrafischgewebe zu bestimmen. Darüber hinaus unterschied dieses Protokoll Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larve sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode angewendet werden kann, um die in Larvengeweben vorhandene Metalldosis zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode angepasst werden, um bestimmte Metalle oder metallbasierte Verbindungen in einem breiten Spektrum von Expositions- und Dosierungsstudien zu identifizieren.

Introduction

Metalle und metallbasierte Verbindungen haben nach wie vor pharmakologische und toxikologische Relevanz. Die Prävalenz der Schwermetallexposition und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit haben die wissenschaftlichen Untersuchungen seit den 1960er Jahren exponentiell erhöht und 2021 ein Allzeithoch erreicht. Die Konzentrationen von Schwermetallen im Trinkwasser, die Luftverschmutzung und die berufliche Exposition überschreiten weltweit die gesetzlichen Grenzwerte und bleiben ein Problem für Arsen, Cadmium, Quecksilber, Chrom, Blei und andere Metalle. Neuartige Methoden zur Quantifizierung der Umweltexposition und zur Analyse der pathologischen Entwicklung sind nach wie vor sehr gefragt 1,2,3.

Umgekehrt hat der medizinische Bereich die physiochemischen Eigenschaften verschiedener Metalle für die klinische Behandlung genutzt. Metallbasierte Medikamente oder Metallodrugs haben eine reiche Geschichte von medizinischen Zwecken und haben Aktivität gegen eine Reihe von Krankheiten gezeigt, mit dem höchsten Erfolg als Chemotherapeutika4. Das berühmteste Metallodrug, Cisplatin, ist ein Pt-basiertes Krebsmedikament, das von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als eines der wichtigsten Medikamente der Welt eingestuftwird 5. Im Jahr 2010 hatten Cisplatin und seine Pt-Derivate bei mehreren Krebsarten eine Erfolgsrate von bis zu 90% und wurden in etwa 50% der Chemotherapien verwendet 6,7,8. Obwohl Pt-basierte Chemotherapeutika unwiderlegbaren Erfolg hatten, hat die dosislimitierende Toxizität Untersuchungen alternativer metallbasierter Medikamente mit verfeinerter biologischer Verabreichung und Aktivität in Gang gesetzt. Von diesen Alternativen sind Ru-basierte Verbindungen zu den beliebtesten 9,10,11,12 geworden.

Neuartige Modelle und Methoden sind erforderlich, um mit dem Bedarf an pharmakologischen und toxikokinetischen Metallstudien Schritt zu halten. Das Zebrafischmodell liegt an der Schnittstelle von Komplexität und Durchsatz, da es sich um ein Wirbeltier mit hoher Fruchtbarkeit mit 70% konservierter Genhomologiehandelt 13. Dieses Modell war ein Vorteil in der Pharmakologie und Toxikologie, mit umfangreichen Screenings für verschiedene Verbindungen für die Entdeckung von Blei, Zielidentifizierung und mechanistische Aktivität14,15,16,17. Das Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien hängt jedoch typischerweise von wässrigen Expositionen ab. Da die Aufnahme aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung in Lösung (d. h. Photodegradation, Löslichkeit) variabel sein kann, kann dies eine wesentliche Einschränkung der korrelierenden Dosisabgabe und des Ansprechens sein.

Um diese Einschränkung für den Vergleich der Dosis mit höheren Wirbeltieren zu überwinden, wurde eine Methodik entwickelt, um die Spurenmetallkonzentrationen im Zebrafischlarvengewebe zu analysieren. Hier wurden Dosis-Wirkungs-Kurven tödlicher und subletaler Endpunkte für Cisplatin und neuartige Ru-basierte Krebsmedikamente ausgewertet. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden auf nominale Konzentrationen von 0, 3,75, 7,5, 15, 30 und 60 mg/L Cisplatin untersucht. Die Pt-Akkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und die Aufnahme der jeweiligen Dosen durch den Organismus betrug 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 und 461,9 ng (Pt) pro Organismus. Zusätzlich wurden Zebrafischlarven bei 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79 exponiert. Diese Konzentrationen wurden analytisch so bestimmt, dass sie 0, 0,17, 0,44, 0,66 und 0,76 mg/L Ru enthielten. Dieses Protokoll ermöglichte auch die Unterscheidung von Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larven sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Methodik war in der Lage, zuverlässige, robuste Daten für Vergleiche der pharmako- und toxikokinetischen Aktivität zwischen einem gut etablierten Chemotherapeutikum und einer neuartigen Verbindung zu liefern. Diese Methode kann auf eine breite Palette von Metallen und metallbasierten Verbindungen angewendet werden.

Protocol

Der AB-Stammzebrafisch (Danio rerio) wurde für alle Experimente verwendet (siehe Materialtabelle), und das Haltungsprotokoll (# 08-025) wurde vom Rutgers University Animal Care and Facilities Committee genehmigt. 1. Zebrafischhaltung Züchten und pflegen Sie den Zebrafisch in einem rezirkulierenden aquatischen Lebensraumsystem auf einem 14 h hell:10 h dunklen Zyklus. Reinigen Sie kommunales Leitungswasser durch Sand- und Kohlenstoff…

Representative Results

Diese Ergebnisse wurden bereitsveröffentlicht 24. Gewebeaufnahmestudien wurden mit wässrigen Expositionen von Cisplatin und einer neuartigen Ru-basierten Antikrebsverbindung, PMC79, durchgeführt. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden für nominale Konzentrationen von Cisplatin 0, 3,75, 7,5, 15, 30 und 60 mg/L Cisplatin untersucht. Die Pt-Akkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und das Gewebe des Organismus enthielt entsprechende Dosen von 0,05, 8,7, 23,…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde implementiert, um die Verabreichung und Aufnahme von metallbasierten Krebsmedikamenten zu bestimmen, die entweder Pt oder Ru enthalten. Obwohl diese Methoden bereits veröffentlicht wurden, diskutiert dieses Protokoll wichtige Überlegungen und Details, um diese Methodik für eine Reihe von Verbindungen anzupassen. Das OECD-Protokoll in Verbindung mit der Gewebeverdauung und der ICPMS-Analyse ermöglichte es uns, festzustellen, dass PMC79 wirksamer als Cisplatin war und zu einer unte…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Förderung: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Darüber hinaus wird Brittany Karas durch den Schulungszuschuss T32NS115700 von NINDS, NIH, unterstützt. Die Autoren würdigen Andreia Valente und die portugiesische Stiftung für Wissenschaft und Technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) für die Lieferung von PMC79.

Materials

AB Strain Zebrafish (Danio reri) Zebrafish International Resource Center Wild-Type AB Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid VWR BDH Chemicals BDH3130-2.5LP Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake) Zeigler Bros, Inc. Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp PentairAES BS90 Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS Teledyne CETAC Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.  
Centrifuge Thermo Scientific CL 2 Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes VWR 21008-105 Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials Fisherbrand 03-339-25B Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D8418 Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer VWR 10153-834 Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide Merk KGaA, EDM Millipore 1.07298.0250 Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid EDM Millipore NX0408-2 Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands, Inc. Instant Ocean® Sea Salt Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System CEM, Matthews, NC Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). 
Multi-element Solution 3 SPEX CertiPREP CLMS-3 Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) Nu Instruments/Amatek Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. 
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 National Institute of Standards and Technology 3140 Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element High Purity Standards 100040-2 Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element High Purity Standards 100046-2 Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes Tetra 77101 Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid VWR BDH Chemicals 87003-261 Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath VWR B2500A-DTH Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion

Referenzen

  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97 (2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -. Z., Bo, H. -. B., Hao, X. -. J., Wang, J. -. Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).
  19. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011)
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013)
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0 (2014)
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Karas, B. F., Doherty, C. L., Terez, K. R., Côrte-Real, L., Cooper, K. R., Buckley, B. T. Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications. J. Vis. Exp. (182), e63587, doi:10.3791/63587 (2022).

View Video