Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ubiquitination ist eine Art posttranslationale Modifikation, die nicht nur die Stabilität, sondern auch die Lokalisation und Funktion eines Substratproteins reguliert. Der Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert fast alle grundlegenden zellbiologischen Prozesse. Die Reinigung ubiquitinierter Proteine hilft bei der Untersuchung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Steuerung der Funktion von Substratproteinen. Hier wird ein schrittweises Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53 beschrieben. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das gesamte zelluläre Flag-markierte p53-Protein wurde mit Anti-Flag-Antikörper-konjugierter Agarose unter nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt. Alternativ wurde das gesamte zelluläre His-markierte ubiquitinierte Protein unter Verwendung von nickelgeladenem Harz unter Denaturierungsbedingungen gereinigt. Ubiquitinierte p53-Proteine in den Eluaten wurden erfolgreich mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Mit diesem Verfahren können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert.
Einleitung
Ubiquitin ist ein evolutionär konserviertes Protein aus 76 Aminosäuren 1,2,3. Ubiquitin bindet kovalent Lysinreste an Zielproteine durch Kaskaden mit aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und Ligase (E3) Enzymen. Ubiquitin wird zunächst durch das Enzym E1 aktiviert und dann auf die E2-konjugierenden Enzyme übertragen. Anschließend interagieren E3-Ubiquitin-Ligasen sowohl mit Ubiquitin-beladenen E2-Enzymen als auch mit Substratproteinen und vermitteln die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminal von Ubiquitin und einem Lysinrest im Substrat
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
HINWEIS: H1299-Zellen wurden freundlicherweise von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt und erwiesen sich als negativ für Mykoplasmenkontamination.
1. Zellkultur
- Für die Erstkultur 1 x 106 Zellen der menschlichen Lungenadenokarzinom-Zelllinie, H1299, in eine 10 cm Petrischale mit 10-12 ml RPMI 1640 Medium geben, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Glutaminzusatz, 1% Natriumpyruvat und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin). Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Teilen Sie ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das schematische Diagramm zeigt die Flag-tagged p53 (Flag-p53) und His/HA double-tagged ubiquitin (HH-Ub) Proteine (Abbildung 1A). Die Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine sind in Abbildung 1B zusammengefasst. Poly-His-markiertes Ubiquitin kann zu Zielproteinen in Säugetierzellen ligiert werden. Ubiquitinierte Proteine können mit Flag/M2-Beads unter nichtdenaturierenden Bedingungen oder durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC).......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Ubiquitinierung spielt bei fast allen physiologischen und pathologischen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle2. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte beim Verständnis der molekularen Rolle von Ubiquitin in Signalwegen gemacht und wie Veränderungen im Ubiquitin-System zu verschiedenen menschlichen Krankheiten führen2. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt dazu bei, Einblicke in die genaue Rolle der Ubiquitinierung in diesen Prozessen zu erhal.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (81972624) an D.L.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Maus IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (von Schafen) | GE healthcare | NA931 | Sekundäres Antibdoy |
| Amersham ECL Ratten-IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (vom Esel) | GE healthcare | NA935 | Sekundäres Antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 Kügelchen |
| Monokolonaler Anti-GFP-Antikörper | Santa cruz | sc-9996 | Primärer Antikörper |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primärer Antikörper |
| Mono-Mdm2-Antikörper (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primärer Antikörper |
| Anti-p53 monokolonaler Antikörper (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primärer Antikörper |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | Lösungsmittel |
| Fötales Rinderserum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptid | Sigma-Alddich | F3290 | Elutionspuffer vorbereiten |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | Ergänzung |
| Guanidin-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | Lösungsmittel |
| H1299 | Stammzellbank, Chinesische Akademie für Immidazol | ||
| Sangon Biotech | A500529-0100 | Lösungsmittel | |
| Immobilon Western Chemilumineszenz HRP Substrat | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 Reagenzien | Invitrogen | 11668019 | Transfektionsreagenz |
| HY-13259 | Proteasom-Inhibitor | ||
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Lösungsmittel |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Lösungsmittel |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | Lösungsmittel |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | Lösungsmittel |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickelgeladenes Harz |
| Nitrozellulose-Blotting-Membran | GE Healthcare | 10600002 | 0,45 & Mikro; Mio. Porengröße |
| Opti-MEM reduziertes Serummedium | Gibco | 31985-070 | Transfektionsmedium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Sangon Biotech | E607011-0100 | Antibiotikum |
| Proteasehemmer Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | Lösungsmittel |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360-070 | Ergänzung |
| Tris-Base | Sangon Biotech | A501492-0005 | Lösungsmittel |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | Lösungsmittel |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | Reagenz |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | Nahrungsergänzungsmittel |
| Ultra High Sensitive Chemilumineszenz Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Harnstoff | Sangon Biotech | A510907-0500 | Lösungsmittel |
Referenzen
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
