Summary
Den presenterte metoden gir en innovativ måte for prosjektering av biomimetiske fiberstrukturer i tredimensjonale (3D) stillaser (f.eks. hjerteklaffbrosjyrer). 3D-trykte, ledende geometrier ble brukt til å bestemme form og dimensjoner. Fiberorientering og egenskaper var individuelt justerbare for hvert lag. Flere prøver kan produseres i ett oppsett.
Abstract
Elektrospinning har blitt en mye brukt teknikk innen kardiovaskulær vevsteknikk, da det gir muligheten til å lage (mikro-)fibrøse stillaser med justerbare egenskaper. Målet med denne studien var å lage flerlags stillaser som etterligner de arkitektoniske fiberegenskapene til menneskelige hjerteklaffbrosjyrer ved hjelp av ledende 3D-trykte samlere.
Modeller av aortaventilcusps ble opprettet ved hjelp av kommersiell dataassistert design (CAD) programvare. Ledende polylaktisk syre ble brukt til å fremstille 3D-trykte brosjyremaler. Disse cusp negativene ble integrert i en spesielt designet, roterende elektrospinning mandrel. Tre lag polyuretan ble spunnet på samleren, etterligner fiberorienteringen av menneskelige hjerteklaffer. Overflate- og fiberstruktur ble vurdert med et skanningselektronmikroskop (SEM). Anvendelsen av fluorescerende fargestoff tillot i tillegg mikroskopisk visualisering av flerlags fiberstrukturen. Strekktesting ble utført for å vurdere stillasets biomekaniske egenskaper.
3D-utskrift av essensielle deler til elektrospinningsriggen var mulig på kort tid for et lavt budsjett. Aortaventilen som ble opprettet etter denne protokollen var trelags, med en fiberdiameter på 4,1 ± 1,6 μm. SEM-avbildning avslørte en jevn fordeling av fibre. Fluorescensmikroskopi avslørte individuelle lag med forskjellig justerte fibre, der hvert lag nøyaktig nådde ønsket fiberkonfigurasjon. De produserte stillasene viste høy strekkfasthet, spesielt i retning av justering. Utskriftsfilene for de forskjellige samlerne er tilgjengelige som Tilleggsfil 1, Tilleggsfil 2, Tilleggsfil 3, Tilleggsfil 4 og Tilleggsfil 5.
Med en høyt spesialisert oppsett- og arbeidsflytprotokoll er det mulig å etterligne vev med komplekse fiberstrukturer over flere lag. Spinning direkte på 3D-trykte samlere skaper betydelig fleksibilitet i produksjon av 3D-former til lave produksjonskostnader.
Introduction
Kardiovaskulær sykdom er den ledende dødsårsaken i vestlige land 1. Selv om det forskes mye på dette feltet, anslås det at byrden av degenerativ hjerteklaffsykdom vil øke ytterligere i løpet av de neste årene2. Kirurgisk eller intervensjonell hjerteklaffutskifting er mulig som terapeutisk alternativ. På dette tidspunktet er mekaniske og bioprosthetiske hjerteklaffer tilgjengelige, begge med individuelle ulemper. Mekaniske ventiler er trombogene og krever livslang antikoagulasjon. Selv om biologiske ventiler ikke krever antikoagulasjon, viser de mangel på ombygging, høy forkalkningshastighet og samtidig nedbrytning3.
Vevskonstruerte hjerteklaffer kan være i stand til å håndtere disse ulempene ved å introdusere et mikrofibøst stillas i kroppen som tillater in vivo-ombygging. Ulike metoder, for eksempel elektrospinning (ESP), decellularisering, mikromolding, spray, dip-coat og 3D-bioprinting, er tilgjengelige. Disse metodene kan velges for å skape spesifikke egenskaper, være billigere og raskere, eller bare på grunn av mangel på alternativer. Metoder og materialer kan til og med kombineres for å skape mer komplekse strukturer4. ESP har for eksempel vært en standard teknikk for å lage stillaser i vevsteknikk, noe som muliggjør kombinasjon av forskjellige materialer og justering av fiberdiametre, fiberretninger og porøsiteter4. Videre tillater en rekke etterbehandlingsteknikker optimalisert vevsoppussing, forbedret hemokompatibilitet og justerbar biologisk nedbrytning av elektrospun stillaser 5,6,7.
Basic ESP bruker enten statiske eller roterende samlere, som har en direkte innvirkning på graden av fiberjustering og oppnådde fiberdiametre8. På grunn av produksjonsrestriksjoner består klassiske ESP-roterende samlere av roterende trommer, plater, ledninger eller metallstenger. Innføringen av 3D-printing gjør det mulig å lage mer individualiserte samlergeometrier som ikke er begrenset av tradisjonelle produksjonsteknikker. Denne individualiseringen er spesielt nyttig for opprettelse av 3D-konstruksjoner som hjerteklaffbrosjyrer.
Den naturlige trelags (fibrosa, spongiosa, ventrikkelis) arkitekturen til menneskelige hjerteklaffbrosjyrer er vevets respons på de mekaniske kreftene og skjærspenningen de blir utsatt for i hjertesyklusen 9,10. Fibrene i lamina fibrosa er orientert omkrets, mens fibrene i lamina spongiosa er tilfeldig justert og de av lamina ventrikkelen radialt. Et trippellag med tilsvarende fiberretninger foreslås dermed å etterligne egenskapene til disse ventilene i et vevskonstruert stillas.
Arbeidsflytprotokollen beskriver en innovativ metode for å produsere trelags 3D-hjerteklaffbrosjyrer ved hjelp av 3D-utskrift og elektrospinning. I tillegg presenteres et kvalitetskontrolltrinn for å sikre nøyaktig fiberorientering i hvert lag.
Protocol
1. Forberedende arbeid
- 3D-utskrift
MERK: Følgende trinn krever nedlasting av STL-filene (Standard Triangle Language) som leveres som Tilleggsfil 1, Tilleggsfil 2, Tilleggsfil 3, Tilleggsfil 4 og Tilleggsfil 5 med dette manuskriptet. Samlerdeler leveres som STL-filer. Tilkoblingsflensen leveres som "STandard for utveksling av produktmodelldata" (STEP) -fil for å tillate justering av samleren slik at den passer til individuelle oppsett. Videre er det gitt en teknisk tegning for de sentrale metallstengene for konvensjonell produksjon som Supplemental File 6.- Åpne skjæreprogramvaren (se materialtabellen) og konfigurer det aktive skrivehodet for ikke-konduktiv polylaktisk syre (PLA) og en 0,4 mm dyse.
MERK: Skjæreprogramvare, filament og dysediameter kan variere avhengig av tilgjengelig 3D-skriver. - Last opp STL-filene Specimen_mount_A (Supplemental File 3) og Speciment_mount_B (Supplemental File 4) til skjæreprogramvaren.
- Roter modellene slik at de trekantede overflatene plasseres på byggeplaten.
- Merk alle deler, høyreklikk, og velg Multipliser valgte modeller. Skriv inn 1 i ledeteksten Antall eksemplarer, og klikk OK. Plasser totalt fire modeller på byggeplaten.
- Sett stykketykkelsen til 0,1 mm, veggtykkelsen til 1 mm, fylltettheten til 40 %, og fjern merket for Generer støtte .
- Klikk Stykke -knappen | Lagre i flyttbare flyttbare områder for å lagre utskriftsfilen på en USB-stasjon.
- Legg ikke-ledende PLA i skriveren, og start utskriftsfilen.
- Når utskriften er fullført, fjerner du modellene fra byggeplaten og ser etter fordreining i de nederste hjørnene.
- I skjæreprogramvaren, hold materialparametrene og erstatt modellene med Collector_Flange (Supplemental File 1 og Supplemental File 5) og Leaflet_Template (Supplemental File 2).
- Roter flensen slik at den flate sirkulære overflaten er mot byggeplaten. I tillegg roterer du brosjyremalen, slik at den firkantede overflaten plasseres direkte på byggeplaten.
- Merk flensen og multipliser modellen som i trinn 1.1.4. Type 1 for å motta 1 kopi og 1 original av flensmodellen på byggeplaten.
- Merk brosjyremodellen og multipliser med 8 for å motta totalt ni brosjyremodeller, ved å følge trinnene som er beskrevet i 1.1.4.
- Sett stykketykkelsen til 0,1 mm, veggtykkelsen til 1 mm, fylltettheten til 80 %, og fjern merket for Generer støtte .
- Klikk Stykke -knappen | Lagre i Flyttbar for å lagre den nye utskriftsfilen på en USB-stasjon.
- Legg ledende PLA i skriveren og start utskriftsprosessen.
- Etter ferdigstillelse av trykket, fjern modellene fra byggeplaten. Fjern individuelle filamentfibre på bunnen av pakningsvedlegget negativt nøye med en trådkutter hvis disse er til stede i brosjyremodellene (da ingen støttestrukturer ble brukt).
- Åpne skjæreprogramvaren (se materialtabellen) og konfigurer det aktive skrivehodet for ikke-konduktiv polylaktisk syre (PLA) og en 0,4 mm dyse.
- Spinnende løsning
FORSIKTIG: Tetrahydrofuran (THF) og dimetylformamid (DMF) er skadelige løsningsmidler som ikke skal inhaleres eller kontakte huden. Det anbefales på det sterkeste å bruke løsemiddelsikre hansker og vernebriller mens du håndterer dem. Når du håndterer dem, arbeid under en eksoshette da de er ekstremt flyktige.- Plasser en vekt under avtrekkshetten og plasser en glassflaske på 200 ml skruehett på den. Ta skalaen.
- Hell 50 ml DMF og 50 ml THF i glassflasken. Legg merke til vekten av løsningsmidlene.
- Plasser en magnetisk stang inne i flasken, plasser flasken på en magnetisk rører, og slå den på.
- Multipliser den angitte vekten med 0,15 (= 15% m/v) og overfør den tilsvarende mengden polyuretan (PU) sakte inn i glassflasken som inneholder løsningsmiddelblandingen (DIN 1310).
- Lukk flasken og rør i minst 12 timer ved romtemperatur for å oppnå en homogen løsning.
2. Oppsett av elektrospinning
- Forsamling
MERK: Ettersom brosjyrens stillaser laget med den presenterte oppsamleren er relativt små, anbefales valgfri bruk av en trommelmandrel med stor diameter (D: 110 mm). Dette gjør det mulig å lage større, flerlags stillaser, noe som vil være gunstig for mikroskopisk, biokompatibilitet og biomekanisk vurdering.- Monter oppsamleren ved hjelp av de 3D-trykte delene og seks skruer M3 x 15.
- Bruk tre skruer for å feste metallstengene til en av flensene.
- Skyv en Specimen_mount_B mellom metallstengene. Kontroller at plassene for maler peker i motsatt retning av flensen.
- Fyll de tre sporene på Specimen_mount_B med maler for hjerteklaffbrosjyre.
- Plasser Specimen_mount_A på toppen og fyll plassene med maler.
- Skyv en annen Specimen_mount_A inn og fyll ut mellomrommene med maler.
- Korriger malene ved å plassere den andre Specimen_mount_B øverst.
- Sett den andre flensen på toppen og bruk M3-skruene til å feste den.
MERK: Påse at alle pakningsvedleggsmalene er orientert i samme retning (rett kant av pakningsvedlegget parallelt med metallstengene). - Plasser den monterte brosjyresamleren i elektrospinningsoppsettet og fest flensene tett til motoraksen (dvs. M6-skruer og vingemuttere) (figur 1).
FORSIKTIG: Ettersom ledende PLA er mer sprø enn vanlig PLA, bruk en momentnøkkel på 1,4 Nm når du fester bolter som legger press på materialet for å unngå å knipse. - Plasser en nåleholder 30 cm fra oppsamleren.
- Fest en 14 gauge (G) nål med en flat spiss i nåleholderen og fest den i høyden på samlerens akse.
- Koble et fleksibelt, løsningsmiddelbestandig (f.eks. polytetrafluoretylen (PTFE)) til Luer-lock-porten på nålen.
MERK: DMF og THF oppløser mange plast. Det er nødvendig å bruke løsemiddelbestandige materialer når du arbeider med disse løsningsmidlene, for eksempel metall- og glassverktøy. Når plastverktøy er nødvendig (dvs. sprøyte eller slange), må du sørge for å bruke løsemiddelresistente materialer. - Før røret til sprøytepumpen for senere tilkobling av den polymerfylte sprøyten.
- Tilkobling av strømforsyningsenhet (PSU)
FORSIKTIG: Under konfigureringen må du kontrollere at strømforsyningen er koblet fra hovedstrømkilden.- Koble to skjermede høyspenningskabler til strømforsyningens anod og katode.
- Bruk en krokodilleklips til å koble kabelen som er koblet til katoden (-polen) til 14 G nålen. Kontroller forbindelsen mellom klips og nål. Før deretter høyspenningskabelen, slik at den går utenfor spinningområdet for å unngå forstyrrelser.
- Koble oppsamleren til anoden (+ polen) ved hjelp av en krokodilleklemme og den andre høyspenningskabelen. Bruk en slepering eller en glidekontakt ved hjelp av en strippet kabel for å opprette kontakt ved samlerens flens.
- Klargjøring av sprøyten
MERK: Dette trinnet bør utføres umiddelbart før spinningprosessen starter.- Fyll en luerlåssprøyte på 20 ml med den roterende løsningen fremstilt i trinn 1.2.
- Koble sprøyten til det løsemiddelresistente røret og skyv løsningen manuelt inn i rørsystemet til en dråpe er synlig på spissen av kanylen.
- Plasser sprøyten i sprøytepumpen. Etter å ha slått på pumpen, skriv inn følgende parametere: diameter: 19.129 mm; volum: 5 ml; hastighet 3 ml/t.
3. Elektrospinningsprosess
- Kjøring av motortest
MERK: Produksjon av oppsamleren ved hjelp av 3D-utskrift kan føre til at samleren beveger seg utenfor midten. Derfor anbefales en testkjøring med lavere omdreiningshastigheter, men uten høy spenning.- Åpne programvaren for motorstyring ved å dobbeltklikke ikonet på datamaskinen.
- Koble til motorstyringen ved å klikke på Koble til-knappen .
- Etter tilkobling velger du profilhastighetsoperasjonsmodus og klikker på Operasjon-fanen øverst til venstre på skjermen.
- Velg kategorien Profilhastighet under hurtigstoppknappen innrammet av en rød linje. Skriv inn følgende innstillinger: Målhastighet: 200 o/min; profil akselerasjon: 100; profil retardasjon: 200; hurtigstopp: 5000.
MERK: Rotasjonsretningen skal være oppover på nålesiden, som kan justeres ved å endre tegnet i "målhastighet" -feltet fra "+" til "-". - Start testkjøringen og kontroller samleren for ubalanse. Hvis samleren kjører jevnt, fortsett med protokollen. Ellers stopper du motoren og juster oppsamleren på nytt som beskrevet i trinn 2.1.9.
- Stopp motoren ved å klikke på knappen Slå på aktivert og endre målhastigheten til 2000 o/min.
- Produksjonsprosessen
MERK: Elektrospinning er en prosess med høy avhengighet av miljøparametere. Optimale elektrospinningsresultater ble oppnådd mellom 15-20% relativ fuktighet ved en temperatur mellom 21 og 24 °C.- Første lag
MERK: I installasjonsfasen kan det ha dannet seg en tørket dråpe PU på spissen av nålen. Fjern om nødvendig dråpen med et langt, ikke-konduktivt verktøy.- I programvaren for motorstyring klikker du på Aktiver drift-knappen for å slå på motoren.
- Slå på høyspennings strømforsyningen og juster spenningen for både anode og katode: minuspol (nål): 18 kV; pluss stang (samler): 1,5 kV.
- Start sprøytepumpen med en strømningshastighet på 3 ml/t.
- Sett en timer på 20 min.
- Vær oppmerksom på nålespissen for dannelsen av en skredderkjegle. Avhengig av formen på kjeglen på nålespissen, juster spenningen ved katoden i trinn på ±100 V til en stabil skredderkegle er etablert.
MERK: Hvis fallet henger, er spenningen for lav. Ustø strømning kan imidlertid indikere at spenningen er satt for høyt. - Vent i 20 min for at cusp-malene skal dekkes tilstrekkelig med fibre.
- Slå av sprøytepumpen.
- Slå av strømforsyningsenheten ved å dreie strømbryteren.
- Stopp motoren ved å klikke på knappen Slå på aktivert i programvaren for motorstyring.
FORSIKTIG: For å unngå at noen av delene i systemet beveger seg, må du vente til oppsamleren har stoppet helt for å åpne testkammeret.
- Andre lag
- I motorstyringsprogramvaren endrer du inngangsfeltet Målhastighet til 10 o/min.
- Gjenta trinn 3.2.1.1-3.2.1.9.
- Tredje lag
MERK: Før stillasene er helt tørre, er de ekstremt følsomme for mekanisk stress. Vær svært forsiktig når du utfører trinn 3.2.3.2-3.2.3.6. Unngå å berøre stillasene/fibrene i disse trinnene, da stillaset kan gjøres ubrukelig.- Åpne skruene som forbinder oppsamlingsflensene forsiktig med motoraksen, og fjern brosjyresamleren (figur 2B) fra elektrospinningsanordningen.
- Bruk en skalpell til å kutte elektrospunfibrene langs den ytre konturen til hver brosjyremal (figur 2C).
- Fjern flensen på den ene siden av oppsamleren.
- Trekk ut de 3D-trykte innsatsene og skill brosjyremalene fra de ikke-bindende trekantede holderne.
- Roter alle brosjyremalene med 90° og sett sammen oppsamleren igjen.
- Sett oppsamleren inn i elektrospinningsoppsettet og fest den godt.
- Igjen, se etter ubalanse før du fortsetter spinningprosessen.
- I programvaren for motorstyring endrer du inngangsfeltet Målhastighet til 2000 o/min.
- Gjenta trinn 3.2.1.1-3.2.1.9.
MERK: Etter at elektrospinningsprosessen er fullført, anbefales det på det sterkeste å skylle slangen og nålen med ren DMF for å forhindre tilstopping av slangen.
- Fluorescerende fargede stillaser (valgfritt)
MERK: Fluorescerende fargestoffer brukes til å gjøre fibrene synlige under et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Dette er bare nødvendig når du implementerer metoden og for kvalitetskontroll etter at nye innstillinger er brukt. Bruk av fluorescerende fargestoffer anbefales ikke ved produksjon av stillaser ved hjelp av etablerte innstillinger.- Del den roterende løsningen som er fremstilt i trinn 1.2, i tre like deler i separate flasker.
- Bruk en skala, mål 1 mg fluorescerende fargestoff for hvert gram (0,1 wt%) av polymeroppløsningen. Gjenta for alle tre fluorescerende fargestoffer (dvs. fluorescein, Texas Red, 4',6-diamidino-2-fenylindole [DAPI]).
- Tilsett fargestoffet til spinneløsningen, lukk flaskelokket og rør i 2-3 timer eller til homogenisering.
MERK: For å forhindre at fluorescerende fargestoffer falmer, må du beskytte den roterende løsningen mot lys så mye som mulig, det vil si ved å plassere et ugjennomsiktig deksel over den magnetiske omrøreren. Prosessen for fluorescerende fargede stillaser er svært lik standardprosessen beskrevet i trinn 3.2.1-3.2.3. - I trinn 3.2.1 erstatter du standardsprøyten med en sprøyte fylt med den roterende løsningen som inneholder det første fluorescerende fargestoffet.
- I trinn 3.2.2 bytter du ut den brukte slangen og nålen med nye eller rensede. Legg deretter en sprøyte med den roterende løsningen som inneholder det andre fluorescerende fargestoffet i sprøytepumpen.
- I trinn 3.2.3 igjen, erstatt slangen og kanylen med nye eller rensede og erstatt sprøyten med en som er fylt med spinnende løsning som inneholder det tredje fluorescerende fargestoffet.
MERK: For å unngå forsinkelse under produksjonsprosessen, er det gunstig å bruke tre sett med slanger og nåler. Alternativt kan røret og nålen skylles grundig med THF og DMF mellom produksjonen av lag til ingen spinnende løsning som inneholder fluorescerende fargestoff er igjen i systemet.
- Første lag
4. Etterbehandling og prøveanskaffelse
- Etterbehandling av stillaser
- Fjern oppsamleren fra elektrospinningsanordningen.
- Bruk en skalpell til å kutte hver mal gratis ved foten som beskrevet i trinn 3.2.3.2.
- Åpne samleren, som beskrevet ovenfor, og plasser malene, basen ned, på en skuff.
- Plasser brettet i et tørkeskap over natten ved 40 °C.
- Etter at prøvene er helt tørket, bruk en skalpell for å forsiktig kutte langs kantene på brosjyremalen for å fjerne overskuddsfibre.
- Etterpå skal du forsiktig skrelle brosjyren stillas av malen og plassere den på et brett for videre behandling.
Representative Results
Denne protokollen er rettet mot utviklingen av et trelags brosjyre stillas bestemt for bruk i kardiovaskulær vevsteknikk av hjerteklaffer. Det etterligner kollagenkonfigurasjonen av de tre lagene i den innfødte menneskelige hjerteventilen. Hvert lag består av fibre med en total diameter på 4,1 ± 1,6 μm (figur 1).
Figur 1: Fiberegenskaper. Analyse av fibre: Totalt fiberantall; Diameter i μm: gjennomsnitt, modus, standardavvik, minimal diameter, maksimal diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Brosjyremalene er konstruert for å passe til en Ø 24 mm aortaventilprotese (figur 2C). Etter tørking holdt brosjyren stillaser sin form av en 3D-hjerteklaff cusp (figur 3A).
Figur 2: Elektrospinningoppsett. (A) Montert 3D-trykt oppsamler i det roterende oppsettet; (B) CAD-gjengivelse av den 3D-utskrivbare samleren; (C) CAD-gjengivelse av hjerteklaffbrosjyren negativ vist i B; trekanten angir innzoomet del. Forkortelse: CAD = dataassistert design. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
SEM-avbildning ble brukt til å vurdere de justerte og ujusterte lagene (TEMP F3512-21). Fotografier ble tatt på 100x, 500x og 2000x forstørrelse på tre forskjellige steder på et stillas. Justerte fiberstillaser vises med en jevn overflate og streng orientering i omkretsretningen (figur 3B). Visuell analyse av 2000x-bildet med hensyn til fiberretningen bekrefter den primære justeringen av fibrene (figur 3C). Ujusterte fiberstillaser viser en tilsvarende glatt overflate sammenlignet med de justerte fibrene. Fiberorientering er uorden, med mange fremtredende skjæringspunkter mellom fibre (figur 3D). Etterfølgende visuell analyse bekrefter unalignment av fibre uten primær orientering synlig (figur 3E).
Figur 3: Elektrospunbrosjyre og SEM-avbildning. (A) Electrospun flerlags brosjyre og 3D-trykt brosjyresamler; (B) SEM bilde av ujusterte fibre (forstørrelse 1000x); (C) Fiber orientering analyse av ujusterte fibre; (D) SEM bilde av justerte fibre (forstørrelse 1000x); (E) Fiberorienteringsanalyse av justerte fibre. Skalastenger = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Forkortelse: SEM = skanning elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Avbildning av fluorescerende fargede flerlags stillaser avslørte tre individuelle lag med distinkte fiberretninger (figur 4D). Bunnlaget (figur 4A; blå) viser justerte fibre i horisontal orientering med svært lite skjæringspunkt mellom fibrene. Mellomlaget (figur 4B; grønn) viser ujusterte fibre uten primær fiberorientering. Det øverste laget (figur 4C; rød) viser justerte fibre i vinkelrett retning. Visuell analyse av topp- og bunnlagene viser en gjennomsnittlig vinkel mellom de to lagene på 89°, som er i samsvar med 90° rotasjonen av samleren under spinningprosessen (figur 4E).
Figur 4: Fluorescensmikroskopi av stillas med flere lag. (A) Fluorescensbilde av det første laget med primærretning fra nederst til venstre til øverst til høyre; (B) Fluorescensbilde av det andre laget med ujustert fiberretning; (C) Fluorescensbilde av det tredje laget med primærretning fra nederst til høyre til øverst til venstre; (D) Fluorescensbilde av alle tre lagene kombinert i ett stillas; (E) Fiber orientering analyse for alle tre lagene (Lag 1: blå; Lag 2: grønn; Lag 3: rød); forstørrelse = 400x (A-D); skalastenger = 100 μm (A-D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tykkelsesmåling ble utført på 21 prøver (figur 5A) (TEMP F3510-21). Alle prøver ble opprettet ved å bruke de samme parameterne. Temperatur og fuktighet kan variere mellom 20,3 °C og 26,1 °C og 35 % og 55 % fuktighet. Resultatene viste en relativt lineær økning i tykkelsen på ~ 2,65 μm per min.
Et annet eksperiment viste konsistensen av resultatene etter 60 min spinning under matchende parametere (figur 5B). Fuktighet og temperatur kan variere mellom 35% og 50% fuktighet og 20,3 °C til 26,1 °C. Resultatene var stillaser mellom 126 og 181 μm i tykkelse. Gjennomsnittlig tykkelse var 151,11 ± 13,17 μm. Økningen i tykkelse var i gjennomsnitt ~ 2,52 μm per min.
Figur 5: Tykkelsesmåling. (A) Tykkelse på stillaser per gang spunnet; n = 21; Korrelasjonskoeffisient (r) = 0,653; p** = 0,00132; (B) Tykkelse på prøver etter 60 min; n = 13; rød linje: middelverdi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Strekkprøver for justerte og ujusterte fiber stillaser ble utført i to retninger, langs omkretsretningen og vinkelrett på den. Hver fugemasse besto av 15 eksemplarer. Prøver ble tatt ut av fly stillaser i henhold til DIN 53504:2017-03. Tykkelsen ble målt til tre forskjellige flekker på hver prøve og brukes til å beregne de maksimale kraftverdiene per kvadrat mm.
Tykkelsesverdiene ligger mellom 0,03 og 0,2 mm. Sammenligningen av ultimate strekkfasthet viste en signifikant forskjell (p < 0,001) mellom orienteringer for de justerte fiberstillasene (figur 6A). Stillasene nådde en maksimal styrke på 12,26 ± 2,59 N/mm2 langs omkretsretningen. Strekkfasthet ble redusert til 3,86 ± 1,08 N/mm2 i vinkelrett retning.
Ujusterte fiberstillaser viser ingen forskjell i den ultimate strekkfasthet for de forskjellige orienteringene (F1: 7,19 ± 1,75 N/mm2, F2: 7,54 ± 1,59 N/mm2; p = 0,60). Den komparative analysen av forlengelsen ved pause for de justerte fiberstillasene viste signifikante forskjeller (p < 0,001) i distensibilitet mellom retningene (figur 6B). Utvidbarheten nådde 187,01 ± 39,37 % i omkretsretningen sammenlignet med 107,16 ± 30,04 % i vinkelrett retning.
Til sammenligning avslørte forlengelsen ved pause for de ujusterte fibermattene jevn utvidbarhet i begge retninger (F1: 269,74 ± 24,78 % ; F2: 285,01 ± 25,58 %; p = 0,69). Representative spenningsbelastningskurver viser store forskjeller i materialets oppførsel, avhengig av hvilken retning strekkkraften påføres. Ujusterte fibermatter viste lineær elastisk oppførsel, mens justerte fibermatter viste ikke-lineæritet i aksialretningen.
Figur 6: Strekkprøver av justerte og ujusterte fibre. (A) Ultimat strekkfasthet for justerte og ujusterte fibermatter i omkrets- og aksialretninger; n = 15; (B) Forlengelse ved pause for justerte og ujusterte fibermatter i omkrets- og aksialretninger; n = 15; (C) Representative spenningsstammekurver av justerte og ujusterte stillaser, trukket i henholdsvis aksiale og omkretsielle retninger. (***p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Produksjonsmålinger | |||||||||
| Navn | Materiale | Beløp | Total tid | Total vekt [g] | Kostnad [€ per kg] | Totalkostnad | |||
| 1 | Specimen_Mount_A | Vanlig PLA | 2 | 18:19 | 159 | 51.33 € | 8.16 € | ||
| 2 | Specimen_Mount_B | Vanlig PLA | 2 | 19:42 | 161 | 51.33 € | 8.26 € | ||
| 3 | Samlerflens | Ledende PLA | 2 | 10:40 | 95 | 99.98 € | 9.50 € | ||
| 4 | Leaflet_Inlet | Ledende PLA | 9 | 05:32 | 31 | 99.98 € | 3.10 € | ||
| Total | 29.02 € | ||||||||
Tabell 1: Produksjonsmålinger. Tabell som angir antall, produksjonstid, nødvendig materialmengde og kostnader for 3D-trykte deler. Forkortelse: PLA = polylaktisk syre.
Tilleggsfil 1: Tilpasningsdyktig samlerflens. Step-file for å tilpasse og skrive ut samlerflens. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Brosjyremal. STL-fil for å skrive ut brosjyremal. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Prøvemontering A. STL-fil for å skrive ut prøvemontering A. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Prøvemontering B. STL-fil for å skrive ut prøvemontering B. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Samlerflens. STL-fil for å skrive ut samlerflens. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Tilkobling av metallstang. Teknisk tegning for å konstruere sammenkoblede metallstenger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den beskrevne protokollen presenterer to innovasjoner innen (kardiovaskulær) vevsteknikk: rimelig produksjon av helt 3D-trykte fantomer for elektrospinning og bruk av en allsidig samler for å produsere tilpasningsdyktige, flerlags hjerteklaffbrosjyrer.
Nylig har 3D-printing blitt et verdifullt verktøy for produksjon av laboratorieutstyr, for eksempel bioreaktorer eller produksjons- og testoppsett11,12. Derfor var det mulig å produsere elektrospinningoppsettet som ble presentert i denne studien på kort tid og for et rimelig budsjett (tabell 1). Dette holder seg i tråd med tidligere funn for lavkostnadsproduksjon av elektrospinningoppsett ved hjelp av 3D-printing13.
Videre, så vidt forfatterne vet, er dette første gang et ledende 3D-utskriftsmateriale ble brukt til å lage en elektrospinningssamler for hjerteklaffbrosjyrer. Så langt ble 3D-trykte samlere enten fremstilt av metalllaser sintring14 eller ved hjelp av ikke-konduktiv polymerutskrift og påfølgende etterbehandling med et ledende belegg15. I motsetning til denne nye tilnærmingen har disse prosedyrene en betydelig ulempe, da de er dyrere, tar mye lengre tid eller krever mer manuell arbeidskraft.
Elektrospinning avhenger av en rekke variabler som påvirker morfologien til de opprettede fibrene. Selv om forskjellige kommersielle elektrospinningoppsett er tilgjengelige på markedet, bruker mange forskningsgrupper svært individualiserte oppsett for å matche deres spesifikke behov16. Med tanke på dette kan det hende at de beskrevne verdiene i denne protokollen (spenning, avstand og rotasjonshastighet) må tilpasses individuelle oppsett og bør ses på som et utgangspunkt i stedet for faste verdier. Videre er det kjent at miljøparametere kan ha en betydelig innvirkning på elektrospinning av resultater17,18. Derfor anbefales det på det sterkeste å kontrollere minst temperatur og fuktighet i elektrospinningsriggen. Optimale elektrospinningsresultater ble oppnådd mellom 15-20% relativ fuktighet ved en temperatur mellom 21 og 24 °C. For å følge denne protokollen er følgende utstyr viktig: en motor som er i stand til å akselerere en samler som veier ca. 300 g til en omdreiningshastighet på 2000 rpm, en sprøytepumpe egnet for små volumstrømningshastigheter på 1-3 ml / t, og en dobbeltpolet strømforsyningsenhet som er i stand til å ±20 kV likestrøm (DC).
I tråd med tidligere studier var det mulig å visualisere den fibrøse strukturen til elektrospunstillasene ved fluorescensmikroskopi19. Det var mulig å demonstrere stillasets flerlagsstruktur, inkludert de varierende fiberretningene. Spesielt når du arbeider med flere lag eller flere materialer, bør innføringen av fluorescerende fargestoffer betraktes som en standard prosedyre for streng kvalitetskontroll. Det kan forbedre den visuelle vurderingen av resultatene etter endringer i parametrene eller arbeidsflytprotokollen. Påføring av fargestoff i stillas som skal brukes til in vivo - eller in vitro-vurdering kan ikke anbefales. Dette er viktig for å unngå interferens med etablerte analysemetoder.
Etterligning av naturlig hjerteklaffmorfologi er av stor betydning for å produsere en vevskonstruert replikering som skal brukes som hjerteklaffprotese (figur 4B). Det har vist seg at den spesifikke ventilgeometrien har stor innvirkning på in vivo-ombygging 20. I denne sammenhengen er 3D-utskrift av brosjyregeometrien for elektrospinning en fordel, da iterasjoner er enkle og raske å implementere. Selv produksjon av personlige ventilgeometrier er tenkelig og etterfølgende utvikling av individuelle og personlige 3D-modeller av hjerteklaffavvik, for eksempel for undervisningsformål, er mulig.
Videre forbedring av vevskonstruerte hjerteklaffegenskaper står i sentrum for dagens forskningsinnsats, ettersom flere forskningsgrupper har jobbet med å utvikle flerlags stillaser med definert fiberorientering. Masoumi et al. fabrikkerte kompositt stillaser fra en støpt polyglyserol sebacate lag og elektrospun polycaprolactone (PCL) fibermatter21. Dermed kan et trippellag opprettes av to orienterte elektrospunlag skilt av et ark med mikrofabricated polyglyserol sebacate. Men i motsetning til stillasene på hånden, var de verken i 3D-form eller etterlignet tilstrekkelig mellomlaget (spongiosa). En annen tilnærming til å produsere en bioinspirert vevskonstruert hjerteklaff ble forfulgt av Jana et al.22,23. De produserte vellykket trelags stillaser med orienterte fibre ved hjelp av aluminiumsamlere for PCL-basert elektrospinning. Igjen presenterte disse stillasene også morfologiske ufullkommenheter, da de bare har et 2D-utseende, og det endelige stillaset er gjennomsyret av eiker.
Selv om protokollen gir detaljert informasjon om hvordan 3D, trelags hjerteklaffbrosjyrer produseres, er det flere trinn som trengs for å lage en faktisk hjerteklaffprotese. En stent med en diameter på 24 mm anbefales for brosjyrene som er beskrevet her. Komplementært til stenten som brukes, kan brosjyrene leveres med ekstra støttestrukturer for søm. For å gi maksimal fleksibilitet, er brosjyrene som vises her ikke individualisert til en bestemt stentdesign. Dette kan gjøres ved ganske enkelt å endre malen ved hjelp av CAD-programvare.
Selv om den brukes til hjerteklaffvevsteknikk, vil den presenterte metoden være lett anvendelig for elektrospinningoppsett i ortopedi24, urologi25, otolaryngologi26 og andre. Produksjon av sofistikerte og/eller individualiserte 3D-konstruksjoner er mulig ved implementering av andre 3D-trykte samlere. Selv om samlerens materiale har endret seg, forblir prinsippet om elektrospinning intakt27. Derfor er bruken av forskjellige polymerer teoretisk mulig, selv om justering av elektrospinningsparametrene kan være nødvendig.
Samlet sett beskriver den presenterte protokollen en enkel og kostnadseffektiv måte å produsere flerlags hjerteklaffbrosjyrer på. Anvendelsen av 3D-utskrift gir rask tilpasning og modifikasjoner av samleren og innsatsene. Dette gjør det mulig å produsere pasientspesifikke proteser uten en komplisert produksjonsprosess av for eksempel metallsamlere. Flere prøver kan opprettes i én kjøring under identiske betingelser. Derfor kan materialdestruktive tester utføres på prøvene med fordelen av å ha (nesten) identiske som gjenstår for å bygge den faktiske ventilen. Inkluderingen av utskriftsfilene som supplemental filer i denne studien er ment å støtte fremme av flerlags hjerteklaff stillaser. Denne nye elektrospinningsteknikken har også et stort potensial for andre områder av regenerativ medisin, da modifiserte samlere og andre 3D-trykte, spinnende maler er enkle å implementere.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), prosjektnummer MA 2186/14-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma - Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G.
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, Pt A 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -Z., Li, H. -P., Yang, J. -H., Wan, J., Yu, D. -G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
