Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Zusammenfassung

Als transparente Oberfläche des Auges ist die Hornhaut für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Aufgrund seiner Lage ist dieses Gewebe anfällig für Umweltbeleidigungen. In der Tat sind die Augenverletzungen, die klinisch am häufigsten auftreten, die der Hornhaut. Während die Wundheilung der Hornhaut bei kleinen Säugetieren (dh Mäusen, Ratten und Kaninchen) ausführlich untersucht wurde, haben Studien zur Hornhautphysiologie andere Arten, einschließlich Zebrafische, vernachlässigt, obwohl Zebrafische ein klassisches Forschungsmodell sind.

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Durchführung eines Hornhautabriebs an Zebrafischen. Die Wunde wird in vivo an betäubten Fischen mit einem Augengrat durchgeführt. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Epithelwunde, wobei der Rest des Auges intakt bleibt. Nach dem Abrieb wird der Wundverschluss im Laufe von 3 h überwacht, danach wird die Wunde reepithelialisiert. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von der Bildverarbeitung, können die Epithelzellform und apikale Vorsprünge untersucht werden, um die verschiedenen Schritte während des Hornhautepithel-Wundverschlusses zu untersuchen.

Die Eigenschaften des Zebrafischmodells erlauben es, die Epithelgewebephysiologie und das kollektive Verhalten der Epithelzellen zu untersuchen, wenn das Gewebe herausgefordert wird. Darüber hinaus kann die Verwendung eines Modells, das des Einflusses des Tränenfilms beraubt ist, neue Antworten auf die Reaktion der Hornhaut auf Stress liefern. Schließlich ermöglicht dieses Modell auch die Abgrenzung der zellulären und molekularen Ereignisse, die an jedem Epithelgewebe beteiligt sind, das einer physischen Wunde ausgesetzt ist. Diese Methode kann auf die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in präklinischen Tests angewendet werden.

Einleitung

Da die meisten Epithel in Kontakt mit der äußeren Umgebung stehen, sind sie anfällig für körperliche Verletzungen, was sie gut für das Studium von Wundheilungsprozessen geeignet macht. Unter den gut untersuchten Geweben ist die Hornhaut ein äußerst nützliches Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Aspekte der Wundheilung. Als transparente Außenfläche schützt es das Auge physisch und ist das erste Element, das das Licht auf die Netzhaut fokussiert. Während sich die Struktur und die Zellzusammensetzung der Netzhaut zwischen Spezies¹ unterscheiden, sind diese Elemente der Hornhaut im Allgemeinen in allen kameraartigen Augen ähn....

Protokoll

Alle Experimente wurden vom nationalen Tierversuchsausschuss genehmigt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie die für die Anästhesie verwendete Tricain-Stammlösung²⁶ im Voraus vor (0,4% ige Stammlösung, die in diesem Protokoll verwendet wird). Verwenden Sie Handschuhe und bewahren Sie die Materialien wann immer möglich in einem Abzug auf.
   1. Für 50 ml einer 0,4% igen Lösung wiegen Sie 200 mg Tricainpulver in ein 50-ml-Röhrchen. Lösen Sie das Pulver in ca. 45 ml doppelt destilliertem Wasser auf.
   2. Stellen Sie den pH-Wert der Tricain-Stammlösung mit 1 M Tris (pH 8,8, ~ 1,25 ml) auf 7 e....

Ergebnisse

Diese Studie beschreibt eine Methode mit einem ophthalmologischen Grat in Zebrafisch-Hornhaut-Wundheilungsexperimenten. Die Methode ist modifiziert gegenüber früheren Studien an Mäusen, bei denen gezeigt wurde, dass der Grat die Epithelzellschichten effizient¹³ entfernt. Zu den Herausforderungen bei der Hornhautverletzung von Zebrafischen gehören die relativ geringe Größe des Auges und im Falle zeitaufwendiger Experimente die Notwendigkeit, einen konstanten Wasserfluss durch die Kiemen aufrechtzue.......

Diskussion

Hornhautverletzungen sind die häufigste Ursache für ophthalmologische Patientenbesuche im Krankenhaus. Daher ist es wichtig, relevante Modelle für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Pathophysiologie der Hornhaut zu erstellen. Bisher ist die Maus das am häufigsten verwendete Modell für das Studium der Hornhautwundheilung. Das Hinzufügen von Augentropfen auf murinen verwundeten Augen, um die Auswirkungen bestimmter Medikamente auf die Wundheilung der Hornhaut zu validieren, kann jedoch schwierig sein. In dieser Hin.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,1 M Na-PO4 (Natriumphosphatpuffer), pH 7,4	hauseigene		Lösung wird aus 1 M Natriumphosphatpuffer (1 M Na2 HPO4 hergestellt und auf pH 7,4 mit 1 M NaH2 PO4 eingestellt.
0,2 M Na-PO4 (Natriumphosphatpuffer), pH 7,4	hauseigene		Lösung wird aus 1 M Natriumphosphatpuffer (1 M Na2 HPO4 auf pH 7,4 mit 1 M NaH2 PO4 hergestellt.
0,5mm Gratspitzen	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8,8	hauseigene
Klebelaschen	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush Grat, Komplettinstrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Präparierplatte	hauseigene
Präparierwerkzeuge	Fine Science Tools
doppelt destilliertes Wasser	hauseigene
Eppedorf-Tuben, 2ml	beliebiger Anbieter
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat-Salz	Sigma	A5040	Achtung: verursacht Reizungen.
Glutaraldehyd, 50%ige wässrige Lösung, Grade I	Sigma	G7651	Achtung: giftig.
Lidocainhydrochlorid	Sigma	L5647	Achtung: giftig.
	Halterungen Agar Scientific	G301P
Petrischale	Thermo Scientific	101VR20
pH-Indikatorstreifen	Macherey-Nagel	92110
Plastiklöffel	beliebiger Anbieter
Kunststofftuben, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Kunststofftuben, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Rasterelektronenmikroskop	FEI	Quanta 250 FEG
Soft Schwamm	beliebig Anbieter
Sputter Coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomikroskop	Leica