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Methodenartikel

Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

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DOI:

10.3791/63684

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23. März 2022

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1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.

Zusammenfassung

Das Fehlen eines robusten In-vitro-Modells des menschlichen respiratorischen Epithels behindert das Verständnis der Biologie und Pathologie des Atmungssystems. Wir beschreiben ein definiertes Protokoll, um menschliche Lungenorganoide aus adulten Stammzellen im Lungengewebe abzuleiten und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um reife Atemwegsorganoide zu erzeugen. Die Lungenorganoide werden dann nacheinander für über 1 Jahr mit hoher Stabilität expandiert, während die differenzierten Atemwegsorganoide verwendet werden, um das menschliche Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau zu simulieren. Damit etablieren wir ein robustes Organoidmodell des menschlichen Atemwegsepithels. Die langfristige Expansion von Lungenorganoiden und differenzierten Atemwegsorganoiden erzeugt eine stabile und erneuerbare Quelle, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die menschlichen Atemwegsepithelzellen in Kulturschalen zu rekonstruieren und zu erweitern. Das Organoidsystem der menschlichen Lunge bietet ein einzigartiges und physiologisch aktives In-vitro-Modell für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Virus-Wirt-Interaktion, der Arzneimitteltests und der Krankheitsmodellierung.

Einleitung

Organoide sind zu einem robusten und universellen Werkzeug für die In-vitro-Modellierung der Organentwicklung und das Studium von Biologie und Krankheit geworden. Bei der Kultivierung in einem wachstumsfaktordefinierten Kulturmedium können adulte Stammzellen (ASC) aus einer Vielzahl von Organen in 3-dimensionalen (3D) erweitert und selbst zu organähnlichen Zellclustern zusammengesetzt werden, die aus mehreren Zelltypen, sogenannten Organoiden, bestehen. Das Labor von Clevers berichtete 2009 über die Ableitung des ersten von ASC abgeleiteten Organoids, des menschlichen Darmorganoids, 1,2. Danach wurden ASC-abgeleitete Organoide für eine Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben etabliert, darunter Prostata 3,4, Leber5,6, Magen 7,8,9, Bauchspeicheldrüse 10, Brustdrüse 11 und Lunge 12,13 . Diese ASC-abgeleiteten Organoide behielten die kritischen zellulären, strukturellen und funktionellen Eigenschaften des nativen Organs bei und bewahrten die genetische und phänotypische Stabilität in der Langzeitexpansionskultur14,15.

Organoide können auch aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS)16. Während PSC-abgeleitete Organoide die Mechanismen der Organentwicklung für ihre Etablierung ausnutzen, können ASCs gezwungen werden, Organoide zu bilden, indem Bedingungen wieder aufgebaut werden, die die Stammzellnische während der physiologischen Gewebeselbsterneuerung oder Gewebereparatur nachahmen. PSC-abgeleitete Organoide sind günstige Modelle, um die Entwicklung und Organogenese zu erforschen, obwohl sie nicht in der Lage sind, den vergleichbaren Reifegrad von ASC-abgeleiteten Organoiden zu erreichen. Der fetale Reifungsstatus von PSC-abgeleiteten Organoiden und die Komplexität bei der Etablierung dieser Organoide verhindern im Wesentlichen ihre breiten Anwendungen für das Studium der Biologie und Pathologie in reifen Geweben.

Die menschlichen Atemwege, von der Nase bis zur terminalen Bronchiole, sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, auch pseudostratifiziertes Flimmerepithel genannt, das aus vier Hauptzelltypen besteht, d.h. Flimmerzelle, Kelchzelle, Basalzelle und Keulenzelle. Wir haben das von ASC abgeleitete humane Lungenorganoid aus menschlichem Lungengewebe in Zusammenarbeit mit dem Labor12,13 von Clevers etabliert. Diese Lungenorganoide werden im Expansionsmedium über ein Jahr lang nacheinander expandiert; Die genaue Dauer variiert zwischen verschiedenen Organoidlinien, die von verschiedenen Spendern erhalten wurden. Im Vergleich zum nativen Atemwegsepithel sind diese langfristig expandierbaren Lungenorganoide jedoch nicht reif genug, da Flimmerzellen, die Hauptzellpopulation in den menschlichen Atemwegen, in diesen Lungenorganoiden unterrepräsentiert sind. Daher entwickelten wir ein proximales Differenzierungsprotokoll und erzeugten 3D- und 2D-Atemwegsorganoide, die das Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau phänokopieren.

Hier stellen wir ein Videoprotokoll zur Verfügung, um menschliche Lungenorganoide aus dem primären Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Experimente mit menschlichem Gewebe wurden vom Institutional Review Board der University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 und UW21-695) genehmigt. Vor der Gewebeentnahme wurde von den Patienten eine Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.

1. Ableitung des menschlichen Lungenorganoids

  1. Aufbereitung von Versuchsmaterialien
    1. Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie das fortgeschrittene DMEM/F12-Medium mit 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzen.
    2. Herstellung des humanen Lungenorganoid-Expansionsmediums durch Ergänzung des basalen Mediums mit 10% R-Spondin 1 konditioniertem Medium, 10% Noggin-konditioniertem Medium, 1x B27-Ergänzung, 1,25 mM N-Acetylcystein, 10 mM Nicotinamid, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng/ml Fibroblstwachstumsfaktor (FGF)-7, 20 ng/ml FGF-10 und 100 μg/ml Primocin (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Das konditionierte Medium R-Spondin 1 und Noggin kann durch kommerzielles rekombinantes R-Spondin 1 (500 ng/ml) und Noggin (100 ng/ml) ersetzt werden.
    3. Vorwärmen Sie eine 24-Well-Suspensionskulturplatte in einem Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie einen Standard-Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2 und befeuchteter Atmosphäre bei 37 °C. Kellermatrix in einem 4 °C Kühlschrank auftauen. Halten Sie die Kellermatrix und das Kulturmedium während des Experimentierens auf Eis.
  2. Zellisolierung aus menschlichem Lungengewebe für 3D-Organoidkultur
    1. Beschaffen Sie frisch reseziertes menschliches Lungengewebe mit einer Größe von etwa 0,5 cm von Patienten, die sich aufgrund verschiedener Krankheiten einer chirurgischen Resektion unterziehen. Transportieren Sie das Lungengewebe in 30 ml Basalmedium bei Raumtemperatur und verarbeiten Sie es so schnell wie möglich in einer Biosicherheitshaube.
    2. Lungengewebe in kleine Stücke (0,5-1 mm) mit einem sterilen Skalpell in einer 10 cm Zellkulturschale zerkleinern. Waschen Sie Gewebestücke mit 10 ml kaltem Basalmedium in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
    3. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 8 ml basalem Medium, ergänzt mit Kollagenase in einer Endkonzentration von 2 mg/ml. Verdauen Sie die Gewebestücke, indem Sie das Rohr bei 120 U / min für 30-40 min bei 37 ° C schütteln.
    4. Pipette 20x auf und ab, um die verdauten Gewebestücke mit einer serologischen 10-ml-Pipette zu scheren. Stapeln Sie ein 100-μm-Sieb auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und filtern Sie die Suspension.
    5. Gewebestücke auf dem Sieb mit dem Basalmedium bergen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen, gefolgt von einer zweiten Runde Scheren und Filtern. Eine zusätzliche Scherfilterung kann 1x-2x durchgeführt werden, um mehr Zellen zu isolieren, insbesondere wenn ein kleines Stück Gewebe (z. B. <0,5 cm) beschafft wird.
    6. Fügen Sie dem Durchfluss FBS mit einer Endkonzentration von 2% hinzu, um die Verdauung zu beenden, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
    7. Resuspendiert das Zellpellet in 10 ml Basalmedium, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    8. (Optional) Wenn viele Erythrozyten im Pellet zu sehen sind (geschätzt durch die Farbe des Pellets), suspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min. Dann 10 ml Basalmedium in das Röhrchen geben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    9. Schwebe das Pellet in kalter Kellermatrix und halte es auf Eis. Fügen Sie 80-160 μL Kellermatrix für Zellen hinzu, die aus einem Lungengewebe von einer Größe von etwa 0,5 cm gewonnen werden; Die Menge reicht aus, um 2-4 Tröpfchen zu säen.
    10. Geben Sie 40 μL Suspension auf jede Vertiefung einer vorerwärmten 24-Well-Suspensionskulturplatte ab. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren, um ein Tröpfchen zu bilden.
    11. Fügen Sie 500 μL humanes Lungenorganoid-Expansionsmedium, ergänzt mit 5 nM Heregulin beta-1, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator.
    12. Aktualisieren Sie das Medium alle 3 Tage. Entfernen Sie das alte Medium, während Sie das Tröpfchen intakt halten, und fügen Sie mit Vorsicht frisches Medium hinzu. Passage der Organoide nach der Inkubation für 10-14 Tage. Verwenden Sie Heregulin beta-1 nur in der Anfangskultur vor der ersten Passage.
    13. Beobachten Sie die Organoide unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Organoide nicht mit einer sehr hohen Zelldichte eingebettet sind. Wenn ein Tröpfchen aufgrund einer zu hohen Zelldichte zerfällt, erholen Sie sich und betten Sie die Organoide und Zellen mit einem höheren Volumen der Kellermatrix wieder ein, um mehr Tröpfchen mit einer niedrigeren und wünschenswerten Zelldichte herzustellen.

2. Expansion menschlicher Lungenorganoide

  1. Bereiten Sie eine Pasteur-Pipette vor, indem Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette auf eine Flamme, z. B. einen Bunsenbrenner, brennen, um die Öffnung von 1,5 mm auf etwa 1,0 mm Durchmesser zu verengen. Kühlen Sie die Pipetten ab, gefolgt von Autoklavieren zum Sterilisieren. Befeuchten Sie die Pipetten mit dem basalen Medium, um Zellanlagerungen und -verluste beim mechanischen Scheren zu vermeiden.
  2. Passage von Lungenorganoiden mit mechanischer Scherung
    1. Verwenden Sie eine 1-ml-Spitze und eine Pipette auf und ab, um die oben erhaltenen Tröpfchen zu brechen. Übertragen Sie dann die Organoide zusammen mit dem Medium auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen mit kaltem Basalmedium auf 10 ml ein. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C
    2. Waschen Sie die Organoide noch einmal mit 10 ml kaltem Basalmedium. Resuspendieren Sie die Organoide in 2 ml kaltem Basalmedium. Pipette auf und ab, um die Organoide mit einer Pasteur-Pipette in kleine Stücke zu scheren.
    3. Ergänzung mit basalem Medium auf ein Gesamtvolumen von 10 ml, gefolgt von Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Suspendieren Sie die Organoidfragmente mit einer kalten Basalmatrix, die ausreicht, um eine 1:3- bis 1:5-Expansion zu ermöglichen. Bleiben Sie auf Eis.
    4. Legen Sie 40 μL Organoidsuspension in jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren.
    5. Fügen Sie 500 μL Lungenorganoid-Expansionsmedium zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Aktualisieren Sie das Medium alle 3 Tage. Passage der Organoide alle 2 Wochen mit einem Verhältnis von 1:3 bis 1:5.
  3. Passage von Lungenorganoiden mit Trypsinisierung
    HINWEIS: Die Trypsinisierung wird bevorzugt, wenn es schwierig ist, das Lungenorganoid mit einem Pasteur-Pipett in kleine Stücke zu scheren, oder wenn die Größe der Organoide sehr variabel ist oder die nachfolgenden Experimente Organoide von gleichmäßigerer Größe erfordern.
    1. Die Lungenorganoide werden wie in Schritt 2.2.1 gezeigt geerntet. Resuspendieren Sie das Organoid in 1 ml Dissoziationsenzym und inkubieren Sie es in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 3-5 min.
    2. Fügen Sie 1 ml Basalmedium in die Röhre hinzu. Scheren Sie die Organoide mechanisch, indem Sie die Organoide mit einem Pasteur-Pipett in kleine Stücke auf und ab pipettieren. Überprüfen Sie die Größe der Organoidstücke unter einem Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Fügen Sie dann 40 μL FBS hinzu, um die Verdauung zu beenden.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Größe der Organoidfragmente unter dem Mikroskop entsprechend der Versuchsanordnung. Wenn ein Experiment mehr Organoide oder Organoide von gleichmäßigerer Größe benötigt, scheren Sie Organoide in kleinere Stücke oder sogar einzelne Zellen. Dann dauert es länger, wahrscheinlich 3 Wochen, bis die Organoide zum Experimentieren bereit sind.
    3. Mit basalem Medium auf ein Endvolumen von 10 ml auffüllen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Suspendieren Sie die Organoidstücke in kalter Kellermatrix mit einem Volumen, das ausreicht, um mit einem Verhältnis von 1: 5-1: 10 zu passieren. Bleiben Sie auf Eis.
    4. Legen Sie 40 μL Organoidsuspension in jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren.
    5. Ergänzen Sie mit 500 μL Lungenorganoid-Expansionsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Aktualisieren Sie das Erweiterungsmedium alle 3 Tage. Passage der Organoide nach 2-3 Wochen.
      HINWEIS: Etwa 100 Organoide sind in einem 40-μL-Tropfen der Kellermatrix montiert. Die Lungenorganoide wachsen normalerweise besser mit einer relativ hohen Zelldichte. Betten Sie die Organoide mit einer geringeren Zelldichte wieder ein, wenn Tröpfchen zerfallen oder die wachsenden Organoide aufgrund der zu hohen Zelldichte aneinander anhaften.

3. Proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

  1. Bereiten Sie das proximale Differenzierungsmedium (TE-Medium) vor, indem Sie das basale Medium der Luft-Flüssigkeitsschnittstelle mit 1x Luftflüssigkeitsschnittstellenergänzung, 1x Luftflüssigkeitsschnittstellen-Erhaltungsergänzung, 4 μg / ml Heparin, 1 μM Hydrocortison, 10 μM Y-27632 und 10 μM DAPT (siehe Materialtabelle) ergänzen.
  2. 3D-Atemwegsorganoide
    1. Inkubieren Sie Lungenorganoide im Expansionsmedium für 7-10 Tage nach dem Passieren durch mechanische Scherung. Ersetzen Sie das Expansionsmedium durch das PD-Medium. Inkubieren Sie die Organoide im PD-Medium für 14 Tage in einem Zellkultur-Inkubator.
    2. Verwerfen Sie das PD-Medium in jedem Bohrloch. Fügen Sie Zelllysatpuffer hinzu, um das differenzierte Atemwegsorganoid für die RNA-Extraktion und den Nachweis der zellulären Genexpression durch RT-qPCR-Assay zu ernten.
    3. Alternativ können die Organoide bei 37 °C für 60 min nach Zugabe von 10 mM EDTA inkubiert werden, um die Organoide in einzelne Zellen zu zerlegen, gefolgt von einer Durchflusszytometrie-Analyse, um die Zellpopulationen zu untersuchen. Die Organoide sind bereit für verschiedene experimentelle Manipulationen.
  3. 2D-Atemwegsorganoid
    1. Bereiten Sie ausreichend 3D-Lungenorganoide für die 2D-Differenzierungskultur vor. Insgesamt werden 1,3 x 10 5 und 4,5 x 105 Zellen für einen 24-Well-Permeable-Stützeinsatz bzw. einen 12-Well-Permeable-Stützeinsatz benötigt.
    2. Nachdem 3D-Lungenorganoide 2 Wochen lang im Expansionsmedium gewachsen sind, verdauen Sie die Organoide in einzelne Zellen und kernen Sie sie in die 24-Well- und 12-Well-Einsätze, um 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.
    3. Die Einsätze mit dem basalen Medium über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator vorbrüten. Fügen Sie 250 μL bzw. 500 μL Basalmedium in die obere und untere Kammer einer 24-Well-Platte hinzu. Für eine 12-Well-Platte fügen Sie 500 μL bzw. 1.000 μL Basalmedium in der oberen bzw. unteren Kammer hinzu.
    4. 3D-Lungenorganoide wie in Schritt 2.2.1 beschrieben ernten. Resuspendieren Sie die Organoide mit 1 ml Dissoziationsenzym und inkubieren Sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 3-5 min.
    5. Fügen Sie 1 ml Basalmedium in die Röhre hinzu. Pipettieren Sie nach oben und unten, um die Organoide mit einer Pasteur-Pipette in einzelne Zellen zu scheren, und überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Fügen Sie dann 40 μL FBS hinzu, um die Verdauung zu beenden.
    6. Filtern Sie die Zellen durch ein 40 μm Sieb in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die gefilterte Zellsuspension in eine 15-ml-Röhre. Nachfüllen mit basalem Medium auf ein Gesamtvolumen von 10 ml, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
    7. Resuspendiert das Pellet, das aus 24 Tröpfchen (40 μL) gesammelt wird, in 1-2,5 ml Lungenorganoid-Expansionsmedium, abhängig von der Zelldichte in den Tröpfchen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler unter einem Mikroskop. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,3 x 106/ml (für 24-Well-Einsätze) oder 9 x 105/mL (für 12-Well-Einsätze) ein.
    8. Entfernen Sie das Basalmedium aus der oberen und unteren Kammer. Fügen Sie 500 μL bzw. 1.000 μL Expansionsmedium in der unteren Kammer des 24-Well-Einsatzes bzw. des 12-Well-Einsatzes hinzu. Seed 100 μL und 500 μL Zellsuspension in Schritt 3.3.7 auf die apikale Kammer des 24-Well-Inserts bzw. des 12-Well-Inserts.
    9. Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator für 2 Tage. Ersetzen Sie das Expansionsmedium durch das PD-Medium sowohl in der apikalen als auch in der unteren Kammer der Platten. Inkubieren Sie die Organoide im Zellkultur-Inkubator für 14 Tage und erfrischen Sie das PD-Medium alle 3 Tage.
      HINWEIS: Mobile Zilien sind in den 3D- und 2D-Organoiden unter dem Mikroskop ab Tag 7 nach der Inkubation im PD-Medium erkennbar. Nach 14 Tagen Differenzierungskultur im PD-Medium sind die Atemwegsorganoide reif für verschiedene experimentelle Manipulationen.
    10. Messen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) jeden zweiten Tag mit einem elektrischen Widerstandsmesssystem gemäß einem in17 beschriebenen Standardprotokoll.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung menschlicher Lungenorganoide mit hoher Erfolgsquote. Frisches menschliches Lungengewebe wird in kleine Stücke zerkleinert und dann mit Kollagenase zersetzt. Die resultierenden Einzelzellen werden in die Basalmatrix eingebettet und im Lungenorganoid-Expansionsmedium inkubiert, ergänzt durch einen Cocktail von Nischenfaktoren für das Auswachsen von epithelialen Stammzellen (Schritt 1.1.2). Abbildung 1 zeigt die Mikrofotografie von frisch isolierten Lun...

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Diskussion

Die menschlichen Atemwege sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, das auch als pseudostratifiziertes Flimmerepithel bekannt ist. Die Hauptzelltypen des Epithels der oberen Atemwege sind Flimmerzellen, die die koordinierte Bewegung ihrer apikalen Zilien ermöglichen, um Schleim und eingeatmete Partikel aus den Atemwegen auszustoßen, Becherzellen, die Schleim produzieren und absondern, und Basalzellen, die die Basalmembran auskleiden und an der Regeneration beteiligt sind. In den kleinen Atemwegen wie den Bronchiolen ent...

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Offenlegungen

J. Z., C.L. und M.C.C. sind als Erfinder des Patents der Atemwegsorganoide aufgeführt (Publikationsnummer: US-2021-0207081-A1). Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken dem Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus dem Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) des Food and Health Bureau unterstützt; General Research Fund (GRF, 17105420) des Research Grants Council; und Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, die Regierung der Sonderverwaltungszone Hongkong.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien für die Organoidkultur der Lunge
Advanced DMEM/F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 SupplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basal Membrane Matrix, Typ 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/ml
FGF-7Peprotech100-195 ng/ml
GlutaMAX (Glutamin)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetylcysteinSigma-AldrichA91651,25 mM
NicotinamidSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (bedingtes Medium)hausgemacht-10x
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µ g/mL
Rspondin1 (bedingtes Medium)hausgemacht-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µ M
Y-27632Tocris12545 & Mikro; M
Proximale Differenzierung medium
DAPTTocris263410 µ M
Heparin SolutionStemCell Technology79804 µ g/mL
Hydrocortison StammlösungStemCell Technology79251 µ M
PneumaCult-ALI 10X SupplementLuft-Flüssigkeits-Grenzflächenergänzung
PneumaCult-ALI BasalmediumStemCell Technology05001Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche Basalmedium
PneumaCult-ALI ErhaltungsergänzungLuft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Erhaltungsergänzung
Y-27632Tocris125410 & micro; M
Equipment
Biologische SicherheitswerkbankBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 oder 800ZeissKonfokalmikroskop
CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific42093483
StereomikroskopOlympus CorporationCKX31SF
ZentrifugeEppendorf5418BG040397
Serologische PipetteEppendorf
MikropipetteEppendorf
ZEN schwarz oder ZEN blau SoftwareZeissAnalysesoftware
Verbrauchsmaterialien
12mm Transwell-StemCell-Technologie#38023
12-Well-ZellkulturplatteCellstar665970
15- und 50 ml konische RöhrchenThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-Well-ZellkulturplatteCellstar662160
6,5 mm Trans-Well-StemCell-Technologie#38024
Medizinische Spritzenfiltereinheit, 0,22 & Mikro; mSigma-AldrichSLGPR33RB
MikropipettenröhrchenEppendorf
MikropipettenspitzenThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pasteur PipettenglasThermo Fisher Scientific22-378893
Serologische Pipetten (5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Ziege Anti-Ratte Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Maus Anti-Cytokeratin 5Abcamab128190
Maus Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Maus Anti-Mucin 5ACAbcamab3649
Maus Anti-Β-Tubulin 4SigmaT7941
Kaninchen Anti-p63Abcamab124762
Ratten-Anti-Uteroglobin/CC-10R& D SystemsMAB4218-SP
Sonstiges Reagenz
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701Dissoziationsenzym

Referenzen

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