Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.
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Methodenartikel
CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
MicroRNAs (miRNAs) haben sich als wichtige zelluläre Regulatoren (Tumorsuppressoren, pro-onkogene Faktoren) von Krebs und Metastasen herausgestellt. Die meisten veröffentlichten Studien konzentrieren sich auf eine einzelne miRNA, wenn es darum geht, die Rolle kleiner RNAs bei Krebs zu charakterisieren. ~ 30% der menschlichen miRNA-Gene sind jedoch in geclusterten Einheiten organisiert, die oft co-exprimiert werden, was auf ein komplexes und koordiniertes System der nicht-kodierenden RNA-Regulation hinweist. Eine klarere Untertreibung der Art und Weise, wie geclusterte miRNA-Netzwerke kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Krebsaggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, ist erforderlich, bevor nicht-kodierende kleine RNAs in die Klinik übersetzt werden.
Die Verwendung eines CRISPR-vermittelten Gen-Editing-Verfahrens (High-Throughput-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde eingesetzt, um die onkogene Rolle eines genomischen Clusters von sieben miRNA-Genen zu untersuchen, die sich in einem Locus mit einer Länge von ~ 35.000 bp im Zusammenhang mit Prostatakrebs befinden. Für diesen Ansatz wurden humane Krebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor für Doxycyclin (DOX)-induzierbare Cas9-Nuklease infiziert, der 48 h lang in DOX-haltigem Medium gezüchtet wurde. Die Zellen wurden anschließend mit synthetischer transaktivierender CRISPR-RNA (tracrRNA) ko-transfiziert, die mit genomischen ortsspezifischen CRISPR-RNA (crRNA)-Oligonukleotiden komplexiert wurde, um die schnelle Erzeugung von Krebszelllinien zu ermöglichen, die die gesamte miRNA-Clusterdeletion und einzelne oder kombinierte miRNA-Gencluster-Deletionen innerhalb eines einzigen Experiments tragen.
Die Vorteile dieses Hochdurchsatz-Gen-Editing-Systems sind die Möglichkeit, zeitaufwändiges Subklonen von DNA-Vektoren zu vermeiden, die Flexibilität bei der Transfektion von Zellen mit einzigartigen Guide-RNA-Kombinationen in einem 24-Well-Format und die kostengünstigere PCR-Genotypisierung mit Rohzelllysaten. Studien, die diesen optimierten Ansatz verwenden, versprechen, funktionelle Redundanzen und synergistische/antagonistische Interaktionen zwischen miRNA-Clustermitgliedern aufzudecken, was dazu beitragen wird, die komplexen kleinen nicht-kodierenden RNA-Netzwerke zu charakterisieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, und das zukünftige therapeutische Design besser zu informieren.
Einleitung
Bessere Forschungsinstrumente sind erforderlich, um den Beitrag nicht-kodierender RNAs bei menschlichen Krankheiten zu untersuchen. MiRNA-Dysregulation wird häufig bei menschlichen Erkrankungen wie Krebs beobachtet, wenn die Expressionsprofile dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Geweben und Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin) von Krebspatienten mit Nicht-Krebspatienten, gesunden Personen, unter Verwendung von Microarrays, quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und Tiefensequenzierungstechnologien der nächsten Generation verglichenwerden 1,2 . Jüngste Arbeiten haben eine große Teilmenge dieser miRNAs ....
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Protokoll
1. Vorbereitung für die CRISPR-Genbearbeitung und das RNA-Leitdesign zur Generierung von miRNA-Cluster-Knockout-Zelllinien
- Erstellen Sie eine DNA-Datei, die die vollständige genomische Sequenz der interessierenden miRNA-Clusterregion (intergen, intronic) und mindestens 1 kB der umgebenden genomischen Regionen enthält, indem Sie eine DNA-Sequenz-Annotationssoftware19 verwenden.
- Verwenden Sie ein Feature-Editing-Tool in der erstellten DNA-Datei, um den Ziel-miRNA-Cluster-Locus (intergen, intronic) und jede einzelne miRNA-Haarnadelsequenz, die zum miRNA-Cluster gehört, zu markieren und andere nah....
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Ergebnisse
Dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Deletionsprotokoll wurde erfolgreich unter Verwendung der Transfektion von Cas9-induzierbaren LNCaP- und PC3-ML-Zelllinien für den menschlichen Krebs mit synthetischen Oligonukleotid-Guide-RNAs eingesetzt, die auf den miR-888-Cluster abzielen und im Zusammenhang mit Prostatakrebs untersucht wurden. Der miR-888-Cluster wurde zunächst in einem Expressionsprofilierungsbildschirm als erhöht bei Prostatakrebspatienten mit hochgradiger Erkrankung im Vergleich zu Patienten mit niedrigem Grad und Nich.......
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Diskussion
Dieses CRISPR-Gen-Editing-Verfahren ermöglicht es dem Forscher, schnell ein ganzes Panel von Zelllinien zu generieren, die einzigartige miRNA-Cluster-Deletionskombinationen tragen. Die Transfektion von synthetischen Leit-RNAs, die aus 5'- und 3'-genomischen stellenspezifischen crRNAs bestehen, die mit synthetischer TracrRNA (1:1-Molverhältnis) in diesem Protokoll geglüht sind, vermeidet zeitaufwändiges Plasmidvektor-Subklonen und ermöglicht ein flexibleres und hochdurchsatzorientiertes experimentelles Design mit einem 24.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
PC3-ML-Zelllinien wurden freundlicherweise von Mark Stearn (Drexel University College of Medicine) zur Verfügung gestellt. Justin Toxey half bei der PCR-Genotypisierung. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Breedan Adams Foundation, einen Ryan Translational Research Fund und einen Zuschuss des Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) an AE-K unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 mL PCR-Röhrchen, flache Kappe | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Puffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR-Reagenz, Genotypisierung |
| 6-Well-Gewebekulturplatte | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-Well-Gewebekulturplatte | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9-Antikörper [7A9-3A3], monoklonales | Maus-AbCam | ab191468 | Western-Blot-Reagenz; 160 kDa; Verdünnung 1:200 |
| Antibiotikum-Antimykotikum (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue Kulturreagenz |
| BLAST Nukleotid Suchmaschine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; Webseite: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochlorid, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR Reagenz; Chemikalie, Arbeitsmaterial = 1 mg/ml in Wasser |
| Countess 3 Automatisierter Zellzähler | Invitrogen | A50298 | Ausrüstung; Zellzähler |
| Kryogene Röhrchen | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; Webseite: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagenz #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Reagenz für Transfektionen; LNCaP- und PC3-ML-Zelllinien |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue Kulturreagenz |
| DMEM Medium mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und Natriumpyruvat | Corning | MT10013CV | Tisuue Kulturreagenz; Medien für PC3-ML-Zellen |
| Doxycyclinhydrochlorid, fertige Lösung | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR-Reagenz; Chemisch, Arbeitsmaterial = 1 mg/ml Vorrat in Wasser |
| DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue Kulturreagenz |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetische tracrRNA, 20 nmol, entwickelt | von Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR-Reagenz; Universelle tracrRNA-Oligonukleotide |
| Edit-R modifizierte synthetische crRNA, entsalzt/entschützt, 2 nmol | Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR-Reagenz; Entwickelte crRNA-Oligonukleotide |
| EditR Induzierbare lentivirale hEF1aBlastCas9-Nuklease-Partikel, 50 μm; L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR-Reagenz; Lenti-iCas9; Doxycyclin-induzierbarer lentiviraler Streptococcus pyogenes Cas9-Vektorsystem |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; Webseite: [ensembl.org] Verwendung: Genombrowser zur Identifizierung eines Nukleotid-Seuqnces, das den miRNA-Cluster und die umgebenden Gen-/regulatorischen Sequenzen enthält. |
| GAPDH Antikörper (FL-335), polyklonales Kaninchen | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western-Blot-Reagenz; 37 kDa; Verdünnung 1:500 |
| Gel/PCR DNA-Fragment-Extraktionskit | IBI Scientific | IB47010 | Nukleinsäure-Gelelektrophorese-Reagenz |
| Gibco Fetal Rinderserum, zertifiziert | Gibco | 16000044 | Tisuue Kulturreagenz |
| Hexadimethrinbromid | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR-Reagenz; Chemikalie, Arbeitsmaterial = 0,8 mg/ml |
| Immobilon-FL PVDF-Membran | MilliporeSigma | Western-Blot-Reagenz; Nitrocellulose | |
| Intercept (TBS) Blockierungspuffer | LI-COR | 927-60001 | Western-Blot-Reagenz |
| IRDye 680RD Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper | LI-COR | 926-68070 | Western-Blot-Reagenz |
| IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper | LI-COR | 926-32211 | Western-Blot-Reagenz |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; Webseite: [mirbase.org] Verwendung: Borowser listet alle annotierten miRNA-Haarnadeln, reifen miRNA-Sequenzen und assoziierten geclusterten miRNAs auf, die innerhalb von 10 kb kartiert werden. |
| NuPAGE 4 bis 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini-Protein-Gel, 10-Well-Invitrogen | NP0321BOX | Western-Blot-Reagenz | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Geräte; Western-Blot-Bildgebung |
| Opti-MEM Reduced Serum | Gibco | 31985062 | Transfektionsreagenz |
| Eule D2 Breitgel-Elektrophoresesystem | Eule | D2-BP | Ausrüstung; Nukleinsäure-Gelelektrophorese-System |
| PCR-Primer, entwickelt (einzelsträngige DNA-Oligonukleotide) | Integrierte DNA-Technologie | NA | PCR-Reagenz, Genotypisierung |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase (2 U/µ L) | Thermo Scientific | F530S | PCR-Reagenz, Genotypisierung |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western Blot Reagenz |
| Proteinase K Lösung (20 mg/ml), | Invitrogen | 25530049 PCR-Reagenz | , Genotypisierung |
| RNase A, DNase und proteasefrei (10 mg/ml) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR-Reagenz, Genotypisierung |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue Kulturreagenz; Medien für LNCaP-Zellen |
| SnapGene Viewer | Snap Gene NA | Freeware; Webseite: [snapgene.com] Verwendung: Softwareprogramm zur Annotation von DNA-Sequenzen, um eine DNA-Datei für das gRNA-Design zu erstellen, und die hebt den miRNA-Cluster-Locus (intergen, intronisch), jede einzelne miRNA-Haarnadelsequenz, die zum miRNA-Cluster gehört, und andere in der Nähe befindliche kodierende und nicht-kodierende Gene und/oder regulatorische Merkmale hervor | |
| TrypLE Select Enzym (1x), kein phenolrotes | Gibco | - 12563029 | Tisuue-Kulturreagenz; Rekombinantes Trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nukleinsäure-Gelelektrophorese-Reagenz |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Ausrüstung |
| XCell SureLock Mini-Zellelektrophorese-System | Invitrogen | EI0001 | Ausrüstung; Protein-Gel-Elektrophorese-System |
Referenzen
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
