Zelltypspezifische Proteinreinigung und Identifizierung aus komplexen Geweben unter Verwendung einer mutierten Methionin-tRNA-Synthetase-Mauslinie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.

Abstract

Das Verständnis der Proteinhomöostase in vivo ist der Schlüssel zum Wissen, wie die Zellen sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen funktionieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt die In-vivo-Markierung und anschließende Reinigung neu synthetisierter Proteine unter Verwendung einer manipulierten Mauslinie, um die Proteinmarkierung an bestimmte Zellpopulationen zu richten. Es handelt sich um eine induzierbare Linie durch Cre-Rekombinase-Expression der L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die einen Einbau von Azidonorleucin (ANL) in die Proteine ermöglicht, der sonst nicht auftritt. Mit der hier beschriebenen Methode ist es möglich, zelltypspezifische Proteome, die in vivo markiert sind, zu reinigen und subtile Veränderungen des Proteingehalts aufgrund der Reduktion der Probenkomplexität zu erkennen.

Introduction

Aberrante Proteinhomöostase wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Mehrere Krankheiten stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der Proteinhomöostase. Das Kennzeichen einiger Krankheiten ist das Vorhandensein von Aggregaten an verschiedenen subzellulären Orten und Gehirnbereichen. Die Proteinhomöostase ist nicht nur bei Krankheiten wichtig, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei der normalen Organ- und Zellfunktion¹. Zum Beispiel ist die Proteinsynthese für viele Formen der neuronalen Plastizität^{notwendig 2,3,} wie durch die Verwendung chem....

Protocol

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der lokalen Regierungsstellen in Deutschland (RP Darmstadt; Protokolle: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) oder Spanien (Ausschuss für Tierversuche an der UCM und Umweltberatung der Comunidad de Madrid, Protokollnummer: PROEX 005.0/21) durchgeführt und entsprechen den Regeln der Max-Planck-Gesellschaft und den spanischen Vorschriften sowie den EU-Richtlinien für den Tierschutz.

1. In vivo metabolische Markierung mit ANL

1. Trinkwasser:
   1. Lösen Sie ANL und Maltose im normalen Trinkwasser der Mäuse auf. Die empfohlene Maltosekonzentration beträgt 0,7% (G....

Results

Gemäß dem beschriebenen Protokoll (zusammengefasst in Abbildung 1) wurde ANL Mäusen entweder durch tägliche intraperitoneale Injektionen (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) für 7 Tage oder über Trinkwasser (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) für 21 Tage verabreicht. Nach der Markierung wurden die entsprechenden Hirnareale seziert, lysiert, alkyliert und angeklickt. Klickreaktionen wurden von SDS-PAGE und Western Immunoblot analysiert. Repräsentative Bilder.......

Discussion

Die kritischen Aspekte des Protokolls sind: die Einbeziehung von Negativkontrollen, genügend biologische Replikate, ANL-Verabreichungsweg, Menge und Dauer, Alkylierung der Proben, Alkinkonzentration und β-Mercaptoethanol-Eliminierung bei Verwendung von DST-Alkin.

Es ist wichtig, Negativkontrollproben von ANL-markierten Tieren ohne Cre-Treiber und daher ohne MetRS*-Expression einzubeziehen. Diese Proben müssen jedem im Protokoll beschriebenen Schritt parallel zu den Proben von ANL-markierten Cr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Acrylamid-Gele	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Giftig; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug.
Ammoniumbicarbonat	Sigma	9830	Giftig; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug
ANL			Synthetisiert wie zuvor für AHA beschrieben (siehe Referenzen 5 und 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonase	Sigma	E1014
Biotin Alkin	Thermo,B10185
Hühner-Antikörper Anti-GFP	Aves	1020
Vollständiger EDTA-freier Proteasehemmer	Roche	4693132001	Toxisch; verwenden Sie einen Laborkittel und Handschuhe.
Kupfer (I)-bromid	Sigma	254185	99,999 % (wt/wt)
Disulfid-Tag (DST)-Alkin			Synthetisiert, wie in der Referenznummer 15 berichtet, in der es als Sonde 20 bezeichnet wird
DMSO	Sigma 276855
Filters	Merk	SCGP00525
Jodoacetamid (IAA)	Sigma	I1149
IR Anti-Huhn 800	LI-COR	IRDye 800CW	Esel Anti-Hühner Sekundärer Antikörper
IR Anti-Rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer Antikörper
Maltose	Sigma	M9171
Manueller Mischer	BioSpec Products	1083
NaCl	Sigma	S9888
N-Ethylmaleimid	Sigma	4259	Giftig; Verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug.
NeutrAvidin-Kügelchen	Pierce	29200
Nitrozellulosemembran	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7,8			Präparation beschrieben in Referenznummer 5
PD SpinTrap G-25 Säulen	GE Healthcare		Pufferaustausch
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo,	23225	Reagenzien im Pierce BCA Protein Assay Kit sind giftig für Wasserorganismen.
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Biotin-Antikörper	Cell Signaling	5597
PVDF-Membran	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Laufpuffer MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Rubinfleck	Sigma	S4942
Tisch automatisch Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Triazol Ligand	Sigma	678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Wasser	Sigma	W4502	Molekularbiologie