Method Article

Zelltypspezifische Proteinreinigung und Identifizierung aus komplexen Geweben unter Verwendung einer mutierten Methionin-tRNA-Synthetase-Mauslinie

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.

Abstract

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Das Verständnis der Proteinhomöostase in vivo ist der Schlüssel zum Wissen, wie die Zellen sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen funktionieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt die In-vivo-Markierung und anschließende Reinigung neu synthetisierter Proteine unter Verwendung einer manipulierten Mauslinie, um die Proteinmarkierung an bestimmte Zellpopulationen zu richten. Es handelt sich um eine induzierbare Linie durch Cre-Rekombinase-Expression der L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die einen Einbau von Azidonorleucin (ANL) in die Proteine ermöglicht, der sonst nicht auftritt. Mit der hier beschriebenen Methode ist es möglich, zelltypspezifische Proteome, die in vivo markiert sind, zu reinigen und subtile Veränderungen des Proteingehalts aufgrund der Reduktion der Probenkomplexität zu erkennen.

Introduction

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Aberrante Proteinhomöostase wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Mehrere Krankheiten stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der Proteinhomöostase. Das Kennzeichen einiger Krankheiten ist das Vorhandensein von Aggregaten an verschiedenen subzellulären Orten und Gehirnbereichen. Die Proteinhomöostase ist nicht nur bei Krankheiten wichtig, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei der normalen Organ- und Zellfunktion1. Zum Beispiel ist die Proteinsynthese für viele Formen der neuronalen Plastizitätnotwendig 2,3, wie durch die Verwendung chemischer Inhibitoren bestimmt, die die Proteinsynthese blockieren4. Es ist jedoch weder klar, bei welchen Zelltypen das Proteom verändert wird, um Lernen und Gedächtnis zu unterstützen, noch ist bekannt, welche spezifischen Proteine in jedem Zelltyp ihre Synthese oder ihren Abbau erhöhen oder verringern. Daher erfordert eine umfassende Untersuchung der Proteinhomöostase die Fähigkeit, Proteome aus bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Tatsächlich war die Identifizierung zelltypspezifischer Proteome zur Untersuchung zellulärer Prozesse, die in einer mehrzelligen Umgebung ablaufen, eine wichtige Hürde in der Proteomik. Aus diesem Grund haben wir eine Technik entwickelt, die MetRS*-Expression in Kombination mit bioorthogonalen Methoden verwendet, die sich als effektiver Weg zur Identifizierung und Reinigung zelltypspezifischer Proteome erwiesen hat und diese Lücke füllt 5,6,7.

Die Expression eines mutierten MetRS* (MetRS L274G) ermöglicht das Laden des nicht-kanonischen Methionin-Analogons ANL in die entsprechende tRNA 8,9 und dessen anschließenden Einbau in Proteine. Wenn die MetRS*-Expression durch einen zelltypspezifischen Promotor reguliert wird, wird die nicht-kanonische Aminosäure zellselektiv in die Proteine eingebaut. Sobald ANL in die Proteine eingebaut ist, kann es selektiv durch Klickchemie funktionalisiert und anschließend entweder durch Bildgebung (FUNCAT) oder durch Western Immunoblot (BONCAT) sichtbar gemacht werden. Alternativ können Proteine selektiv gereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Mit dieser Technologie haben wir eine Mauslinie erstellt, die das MetRS*-Protein unter der Kontrolle der Cre-Rekombinase exprimiert. Angesichts der steigenden Anzahl verfügbarer Cre-Maus-Linien kann das MetRS*-System in jedem Bereich verwendet werden, um jeden Zelltyp aus jedem Gewebe zu untersuchen, für das es eine bestehende Cre-Linie gibt. Die Proteinmarkierung mit ANL ist in vitro oder in vivo möglich und verändert weder das Verhalten der Maus noch die Proteinintegrität6. Die Markierungszeit kann an die wissenschaftliche Fragestellung jedes Forschers angepasst werden, indem neu synthetisierte Proteine (kürzere Markierungszeiten) oder ganze Proteome (längere Markierungszeiten) markiert werden. Die Verwendung dieser Technik ist durch die Anzahl der Zellen des Typs begrenzt, den der Forscher zu untersuchen bereit ist; Daher ist eine Proteinisolierung aus Zelltypen mit geringer Anzahl oder niedrigen Stoffwechselraten mit dieser Methode nicht möglich. Ziel der vorgestellten Methode ist es, zelltypspezifische Proteine/Proteome zu identifizieren, die in vivo markiert sind. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zelltypspezifische Proteome mit ANL in lebenden Mäusen markiert und die markierten Proteine gereinigt werden. Nach der Reinigung können Proteine durch routinemäßige Massenspektrometrieprotokolle 5,10 identifiziert werden. Die Reduzierung der Probenkomplexität, die bei dieser Methode durch die selektive Reinigung von Proteinen aus bestimmten Zellpopulationen erreicht wird, ermöglicht es dem Experimentator, subtile Veränderungen in Proteomen zu erkennen, beispielsweise als Reaktion auf Umweltveränderungen. Die Reinigung der markierten Proteine kann in ~10 Tagen erreicht werden, ohne die MS-Analyse oder die Markierungsperiode. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur ANL-Verabreichung an MetRS*-exprimierende Mäuse, nämlich (1) Zugabe der Aminosäure im Trinkwasser und (2) Einführung von ANL durch intraperitoneale Injektionen. Unabhängig von der für die ANL-Verabreichung gewählten Methode sind die Isolations- und Reinigungsschritte die gleichen (ab Schritt 2).

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Protocol

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Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der lokalen Regierungsstellen in Deutschland (RP Darmstadt; Protokolle: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) oder Spanien (Ausschuss für Tierversuche an der UCM und Umweltberatung der Comunidad de Madrid, Protokollnummer: PROEX 005.0/21) durchgeführt und entsprechen den Regeln der Max-Planck-Gesellschaft und den spanischen Vorschriften sowie den EU-Richtlinien für den Tierschutz.

1. In vivo metabolische Markierung mit ANL

  1. Trinkwasser:
    1. Lösen Sie ANL und Maltose im normalen Trinkwasser der Mäuse auf. Die empfohlene Maltosekonzentration beträgt 0,7% (Gew./vol). Die maximale Menge an ANL, die dem Trinkwasser zugesetzt wird, beträgt 1% (Gew./Vol.). Sobald die Mischung fertig ist, sterilisieren Sie sie durch Filtration und lagern Sie sie bei 4 °C.
    2. Geben Sie die in Schritt 1.1 vorbereitete Mischung den Mäusen. Wechseln Sie die Flaschen häufig (z. B. alle 3 Tage), um Verunreinigungen zu vermeiden, und überprüfen Sie sie täglich, um nach möglichen Verunreinigungen oder Verstopfungen zu suchen. Überwachen Sie die Menge an getrunkenem Wasser täglich, indem Sie es wiegen, um die ANL-Aufnahme von Mäusen zu kennen.
      HINWEIS: Die hier bewertete maximale Kennzeichnungsdauer beträgt 3 Wochen bei einer ANL-Konzentration von 1% im Trinkwasser, was zu einer gut nachweisbaren Kennzeichnung im Gehirn führte. Eine gute Kennzeichnung kann auch in 2 Wochen erreicht werden. Weder kürzere Etikettierzeiten, noch längere Zeitpunkte, noch andere ANL-Mengen wurden von uns mit dieser Verabreichungsmethode untersucht, was nicht bedeutet, dass das Vorstehende nicht funktionieren würde. Die ANL-Inkorporationsraten können je nach untersuchtem Gewebe- oder Zelltyp variieren. Der Zeitpunkt der Kennzeichnung kann je nach wissenschaftlicher Fragestellung variieren; Wenn beispielsweise Proteome markiert werden sollen, sollte die Markierungszeit in Abhängigkeit von den durchschnittlichen Halbwertszeiten der Proteine im untersuchten Gewebe berechnet werden. Wenn das Interesse nur darin besteht, neu synthetisierte Proteine zu identifizieren, können die Zeiten verkürzt werden. Die Markierungszeiträume und ANL-Dosierungen müssen für jeden experimentellen Zustand und Zelltyp empirisch getestet werden.
  2. Intraperitoneale Verabreichung:
    1. ANL in physiologischer NaCl-Lösung zu 400 mM, Phosphatsalzlösungspuffer (PBS) oder Wasser auflösen.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität der Lösung im physiologischen Bereich liegt. Hier werden den Mäusen 10 ml/kg Körpergewicht ANL-Lösung verabreicht.
      HINWEIS: Eine gute Markierung in den erregenden Neuronen des Gehirns wird erfolgreich durch eine tägliche intraperitoneale Injektion (IP) mit 400 mM ANL für 1 Woche erreicht. Weder niedrigere ANL-Konzentrationen noch andere Markierungszeiträume durch IP-Injektionen wurden in dieser Studie getestet, was nicht bedeutet, dass sie nicht funktionieren würden. ANL wird von einigen Unternehmen als Hydrochlorid geliefert. In diesem Fall muss der pH-Wert der Lösungen auf den adäquaten pH-Wert eingestellt werden (abhängig vom Verabreichungsweg). ANL kann auch nach der von Link et al.11 veröffentlichten Methode mit einigen Modifikationen synthetisiert werden5. Die ANL-Kennzeichnung kann unter Verwendung anderer ANL-Konzentrationen, Zeitspannen und Verabreichungswege durchgeführt werden. Für Gewebe-/Zelltypen mit niedrigen Stoffwechselraten kann eine Methionin-Diät mit niedrigem Gehalt verwendet werden, die immer 1 Woche vor der ANL-Verabreichung beginnt. Wenn 400 mM ANL verwendet wird, kann es bei Lagerung bei 4 °C ausfallen; Eine Erwärmung auf 37 °C bringt ANL wieder in die Lösung. Lassen Sie es vor der Injektion Raumtemperatur erreichen. In den meisten Weltregionen ist die ANL-Verabreichung an Mäusen ein Tierversuch und muss von den zuständigen Behörden genehmigt werden.

2. Gewebegewinnung, Lyse und Proteinextraktion

  1. Gewebedissektion: Sezieren Sie den Bereich des Gewebes, der den interessierenden Zelltyp enthält, und notieren Sie das Gewicht des gesammelten Gewebestücks.
    HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). Im vorliegenden Protokoll wurden der Kortex und der Hippocampus der Mäuse seziert.
  2. Gewebelyse: Homogenisieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur durch Zugabe eines Volumens, das das 12-15-fache des Nassgewichts des Gewebes des Lysepuffers beträgt (PBS pH 7,4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), ein Proteaseinhibitor (PI) (EDTA-frei 1:4000)). Zum Beispiel fügen Sie für ein 20 mg Gewebestück 240-300 μL Lysepuffer hinzu. Trituieren Sie das Gewebe, bis es homogenisiert ist.
    HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). Für die direkte Homogenisierung in 1,5-ml-Röhrchen empfiehlt sich die Verwendung eines tragbaren, batteriebetriebenen Homogenisators, insbesondere wenn kleine Gewebestücke verarbeitet werden. Für größere Stücke kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden. Zu jedem Puffer, in dem Proteaseinhibitoren (PI) enthalten sind, sollten sie unmittelbar vor der Verwendung und nicht früher hinzugefügt werden.
  3. Proteindenaturierung: Das Homogenat 15 min auf 75 °C erhitzen und bei 17.000 x g 15 min bei 10 °C zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre.
  4. Messung des Proteingehalts: Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe und passen Sie alle Proben an, um sie mit derselben Proteinkonzentration zu vergleichen. Passen Sie die Konzentration durch Hinzufügen von Lysepuffer an. Ein optimaler Konzentrationsbereich liegt zwischen 2-4 μg/μL.
    HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt).
  5. Alkylierung
    1. Die homogenisierten Proben werden um das 2-3-fache in PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-frei 1:4000) verdünnt.
    2. Iodoacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 20 mM (Stammlösung 500 mM) zugeben.
    3. Die Proben 1-2 h bei 20 °C im Dunkeln stehen lassen. Führen Sie die Schritte 2.5.2-2.5.3 zweimal aus.
      HINWEIS: Wenn bei einigen Geweben der unspezifische Klick in der Negativkontrolle hoch bleibt, kann es notwendig sein, vor der Alkylierung einen Reduktionsschritt durchzuführen12. Bereiten Sie den IAA-Bestand frisch vor, bevor Sie ihn den Mustern hinzufügen. Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt).
  6. Pufferaustausch: Gleichgewichtspufferaustauschsäulen unter Verwendung des Klickchemie-Austauschpuffers (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:4000)). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Austauschen Sie alle alkylierten Proben.
    HINWEIS: Eluierte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). In diesem Schritt wird die IAA eliminiert und der Puffer durch den Klickchemiepuffer ausgetauscht. Das Protein kann nach dem Pufferaustauschschritt erneut gemessen werden, um sicherzustellen, dass die Proteine während des Pufferaustauschprozesses nicht verloren gegangen sind. Abhängig von der Art der Säulen, die für den Pufferaustausch verwendet werden, kann Protein massiv verloren gehen. Verwenden Sie die empfohlenen Säulen, um Proteinverlust zu vermeiden. Für die Probenlagerung wird die Herstellung von Aliquoten empfohlen.
  7. Klicken Sie auf die Reaktion, um die ANL-Einbeziehung in das Experiment zu bewerten
    1. Nehmen Sie 40 μL der eluierten Proben in Schritt 2.6 und geben Sie PBS (pH 7,8) zu einem Endvolumen von 120 μL.
    2. Um die Klickchemiereaktion einzurichten, fügen Sie die folgenden Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge und im Wirbel für 20 s nach jeder Zugabe hinzu: 1,5 μL Triazolligand (Stamm 40 mM), 1,5 μL Biotinalkinkinen (Stamm 5 mM) und 1 μL Cu(I)-bromid (Brühe 10 mg/ml, gelöst in DMSO durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab, nicht wirbeln). Fügen Sie die Reagenzien so schnell wie möglich hinzu.
    3. Die Proben über Nacht im Dunkeln bei 4 °C in kontinuierlicher Rotation inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C für 5 min bei 17.000 x g. Ein leicht türkisfarbenes Pellet wird sichtbar sein. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre.
      HINWEIS: Bereiten Sie Cu (I) -bromidbrühe unmittelbar vor Gebrauch vor, um Kupferoxidation zu vermeiden. Das Verhältnis der Volumina zwischen der lysierten Probe und PBS zwischen den Proben konstant zu halten, ist wichtig, um die gleiche Endreinigungsmittelkonzentration in jedem Röhrchen zu gewährleisten. Um den Aufbau der Klickchemiereaktion zu beschleunigen, wird ein Tischwirbel mit Racks für Rohre empfohlen. Lagern Sie die angeklickten Proben mehrere Monate bei -80 °C oder einige Wochen bei -20 °C bis zur Weiterverarbeitung (Stopppunkt).
  8. Western-Blot-Analyse zur Bewertung der ANL-Einbeziehung in das Experiment
    1. Führen Sie eine SDS-PAGE mit 20-40 μL des Überstands aus der Klickchemiereaktion durch (Schritt 2.7). Verwenden Sie 12% Acrylamidgele, laufen Sie in 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM Glycin. Laufen lassen, bis die Vorderseite aus dem Gel heraus ist.
    2. Übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran13.
    3. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit einem GFP-Antikörper (1:500, GFP-Protein wird mit MetRS*5 co-translatiert) und einem Biotin-Antikörper (1:1000) zum Nachweis von angeklicktem Alkin, das mit Biotin konjugiert ist.
    4. Waschen Sie den primären Antikörper 2 mal für 10 min und fügen Sie den sekundären Antikörper für 1,5 h hinzu.
    5. Waschen Sie den sekundären Antikörper 2-mal für 10 Minuten und scannen Sie (bei Verwendung von fluorophorkonjugierten Antikörpern) oder besetzen Sie ihn Filmen (bei Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpern).
    6. Quantifizieren Sie das Biotinsignal mit ImageJ oder einer ähnlichen Software, bewerten Sie die allgemeine Markierung jeder Probe des Experiments und erkennen Sie mögliche Ausreißer. Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (ANL-Probenmarkierung zum Hintergrund der Negativkontrollen) des Experiments und erkennen Sie mögliche Tiere, die ANL nicht aufgenommen / aufgenommen haben.
      HINWEIS: Für Proben mit hohem ANL-Einbau ist eine Proteinreinigung theoretisch mit nicht spaltbaren Alkinen möglich, wie sie in diesem Abschnitt zur Bewertung der ANL-Inkorporation verwendet werden. Unter Verwendung von Gehirnproben ist der Hintergrund, der in den Negativkontrollen von MS nach Proteinreinigung mit nicht spaltbaren Alkinen erhalten wird, zu hoch14. Daher wurden für eine erste allgemeine Proben- und Versuchsauswertung nur die leichter zu handhabenden, nicht spaltbaren Alkine verwendet. Unabhängig von der Art des Alkins, das für die Proteinreinigung bestimmt ist, ist es ratsam, die im folgenden Abschnitt beschriebenen Schritte zur Optimierung der Alkindosierung durchzuführen (Schritt 2.9).
  9. Klickreaktion zur Optimierung der spaltbaren Alkindosierung
    1. Vier Röhrchen mit 40 μL einer repräsentativen Probe (in Schritt 2.6 erhalten und in Schritt 2.8 bewertet) vorbereiten und PBS (pH 7,8) zu einem Endvolumen von 120 μL hinzufügen.
    2. Richten Sie die Klickchemiereaktion wie in Schritt 2.7 beschrieben ein, aber fügen Sie diesmal vier verschiedene Mengen des DST-Alkins hinzu. Für besagtes Alkin wird empfohlen, 5 μM, 15 μM, 30 μM und 60 μM zu testen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.8, um zu entscheiden, welche Alkindosierung für die spezifische experimentelle Fragestellung am besten geeignet ist, basierend auf der höchsten Markierungseffizienz mit dem niedrigsten Hintergrundsignal.
      HINWEIS: Bevor die restlichen Proben einer Klickreaktion unterzogen werden, muss die optimale Menge eines Alkins bestimmt werden. Es gibt mehrere Optionen von kommerziell erhältlichen Alkinen, die verwendet werden können. Sie unterscheiden sich in der Art der Spaltung (z.B. Licht oder Reduktionsmittel). Eine kupferfreie Klickchemie mit stammgeförderten Reagenzien (z.B. DBCO-Reagenzien) ist ebenfalls möglich. Winzige Änderungen in der Menge an Alkinen oder DBCO-Reagenzien erhöhen oft das Signal in der Negativkontrolle (Hintergrund) signifikant. Hierbei wird die Proteinreinigung unter Verwendung eines Alkins mit einer durch Reduktionsmittel spaltbaren Disulfidbrücke (Disulfidbiotinalkin oder DST-Alkin15) beschrieben. Wenn Sie das DST-Alkin verwenden, vermeiden Sie zum Ausführen der SDS-PAGE (Schritt 8.1) das Laden von Puffern mit starken Reduktionsmitteln wie DTT oder β-Mercaptoethanol, um eine Alkinspaltung zu verhindern. In dieser Studie hat das 5-minütige Erhitzen bei 72 °C unter Verwendung von 5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) im Ladepuffer keinen Einfluss auf die Stabilität der DST-Alkin. Schritt 2.9.2 kann wiederholt werden, wobei feinkörnigere Dosierungen im Bereich der besten beobachteten getestet werden.
  10. Präparative Klickreaktion zur Proteinreinigung
    1. Klicken Sie auf alle in Schritt 2.6 erhaltenen Proben mit der in Schritt 2.9 ermittelten optimalen Alkindosis und analysieren Sie eine Fraktion mittels SDS-PAGE und Western Blot (Schritt 2.8).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pipetten ordnungsgemäß kalibriert sind, um die Genauigkeit der Probenhochskalierung zu gewährleisten. Geklickte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt).

3. Proteinreinigung

  1. Pufferaustausch
    1. Alle angeklickten Proben einem Pufferaustauschverfahren wie in Schritt 2.6 beschrieben unterziehen, aber Neutravidin-Bindungspuffer als Gleichgewichtspuffer verwenden (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:2000)).
      HINWEIS: Eluierte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). In diesem Schritt wird das nicht angeklickte freie Alkin eliminiert und der Puffer durch den Neutravidin-Bindungspuffer ausgetauscht.
  2. Bindung an Neutravidin-Perlen
    1. Die Neutravidin-Hochleistungskügelchen werden mit dem Neutravidin-Bindungspuffer gewaschen (siehe Schritt 3.1); Mischen Sie die Perlen mit dem Puffer und zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 3000 x g und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dies dreimal.
    2. Bereiten Sie eine 1:1-Aufschlämmung aus Neutravidin-Perlen vor, indem Sie das gleiche Volumen an Trockenkügelchen und Neutravidin-Bindungspuffer hinzufügen.
    3. Von jeder Probe werden 20-40 μL als vorgereinigtes Lysat beiseite gelegt und bei -20 °C gelagert.
    4. Die Proteinkonzentration wird gemessen (siehe Schritt 2.4) und 100 μg Protein mit 4 μl der in Schritt 3.2.2 erhaltenen Aufschlämmung gemischt.
    5. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 4 °C in kontinuierlicher Rotation, damit markierte Proteine an die Beads binden können.
      HINWEIS: Wie bei der Klickchemiereaktion kann die in Schritt 3.2.4 beschriebene grundlegende Affinitätsreinigungsreaktion hochskaliert werden. Zum Beispiel wird zur Reinigung von Proteinen aus den exzitatorischen Neuronen des Hippocampus 1 mg Proteinlysat mit 40 μL Neutravidin-Perlen (1:1-Aufschlämmung) gemischt. Die Menge an Neutravidin-Perlen kann entsprechend der Menge der markierten Proteine pro mg Gesamtprotein nach oben oder unten skaliert werden, was vom gewählten Zelltyp und der Markierungsperiode abhängt und empirisch bestimmt werden muss.
  3. Neutravidin-Perlen waschen und Proteinelution
    1. Sammeln Sie die Überstände durch Zentrifugation (siehe Schritt 3.2.1). 20-40 μl Aliquot jedes Überstands für eine spätere Analyse beiseite legen und den Rest bei -80 °C einfrieren.
    2. Waschen Sie die Perlen mit gekühltem Neutravidin-Waschpuffer 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:2000)), indem Sie den Puffer hinzufügen, die Perlen sedimentieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    3. Dann fügen Sie den gleichen Puffer hinzu und inkubieren Sie die Perlen für 10 Minuten unter kontinuierlicher Rotation bei 4 °C, bevor Sie den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    4. Waschen Sie die Perlen wie in den Schritten 3.3.2-3.3.3 beschrieben, jedoch mit Neutravidin Waschpuffer 2 (1x PBS, pH 7,4 und PI 1:2000).
    5. Die Perlen werden wie im Schritt 3.3.2-3.3.3 erläutert, jedoch mit Neutravidin-Waschpuffer 3 (50 mM Ammoniumbicarbonat und PI 1:2000) gewaschen.
    6. Eluieren Sie die geklickten Proteine, indem Sie die Beads für 30 min bei 20 °C mit einem Volumen Neutravidin-Elutionspuffer (5% (vol/vol) β-Mercaptoethanol und 0,03% (wt/vol) SDS) entsprechend einem Volumen der verwendeten Trockenkügelchen inkubieren.
    7. Halten Sie die Perlen während der Elution durch kontinuierliches Rühren (1000 U/min) in einem Thermoblock-Shaker in Schwebe. Eluieren Sie zweimal und kombinieren Sie beide Eluate.
      ANMERKUNG: Die Zentrifugation zur Trennung des festen Anteils der Aufschlämmung (Perlen) und der wässrigen Phase (Überstand), wie in Schritt 3.2.1 erläutert, gilt für die Schritte 3.3.1-3.3.7. Die SDS-Menge kann erhöht werden, wenn die Proteinelution nicht vollständig ist. Bei Mengen über 0,08%-0,1% SDS beginnen jedoch Proteine, die unspezifisch an die Perlen gebunden sind, eluiert zu werden. β-Mercaptoethanol ist flüchtig und giftig; Die Verwendung einer Haube für die Schritte 3.3.6-3.3.7 ist ratsam. Die in den Schritten 3.2.3 und 3.3.1 gesammelten Proben sollten von SDS-PAGE durchgeführt und von Western Blot ausgewertet werden (siehe Schritt 2.8), um die Effizienz der Affinitätsreinigung zu bewerten (Schritt 3.3).
  4. Bewertung von eluierten Proteinen
    1. Laden Sie 1/3 der eluierten Samples auf eine SDS-PAGE (siehe Schritt 2.8.1).
    2. Färben Sie das Gel, um Proteine mit einer hochempfindlichen Methode wie Silberfärbung oder einer fluoreszierenden Methode sichtbar zu machen.
    3. Wenn die Proben die erwartete Qualität aufweisen, was bedeutet, dass in den ANL-markierten Proben im Vergleich zur Negativkontrolle 3-4-fach mehr Protein enthalten ist, können die eluierten Proteine durch routinemäßige massenspektrometrische Methoden wie die in Referenz5 erläuterte identifiziert werden.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemäß dem beschriebenen Protokoll (zusammengefasst in Abbildung 1) wurde ANL Mäusen entweder durch tägliche intraperitoneale Injektionen (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) für 7 Tage oder über Trinkwasser (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) für 21 Tage verabreicht. Nach der Markierung wurden die entsprechenden Hirnareale seziert, lysiert, alkyliert und angeklickt. Klickreaktionen wurden von SDS-PAGE und Western Immunoblot analysiert. Repräsentative Bilder...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die kritischen Aspekte des Protokolls sind: die Einbeziehung von Negativkontrollen, genügend biologische Replikate, ANL-Verabreichungsweg, Menge und Dauer, Alkylierung der Proben, Alkinkonzentration und β-Mercaptoethanol-Eliminierung bei Verwendung von DST-Alkin.

Es ist wichtig, Negativkontrollproben von ANL-markierten Tieren ohne Cre-Treiber und daher ohne MetRS*-Expression einzubeziehen. Diese Proben müssen jedem im Protokoll beschriebenen Schritt parallel zu den Proben von ANL-markierten Cr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C wird vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) und MICINN (PID2020-113270RA-I00) finanziert. R. A-P wird von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) finanziert. E.M.S. wird gefördert durch die Max-Planck-Gesellschaft, einen Advanced Investigator Award des Europäischen Forschungsrats (grant 743216), den DFG-SFB 1080: Molekulare und zelluläre Mechanismen der neuronalen Homöostase und den DFG-SFB 902: Molekulare Prinzipien der RNA-basierten Regulation. Wir danken D.C. Dieterich und P. Landgraf für ihre technische Beratung und die Synthese des DST-Alkin. Wir danken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast und der Tiereinrichtung des MPI für Hirnforschung für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Sandra Goebbels für das Teilen der Nex-Cre Mauslinie. Wir danken Antonio G. Carroggio für seine Hilfe bei der englischen Redaktion. B.A-C. entwarf, führte und analysierte Experimente. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. und S. t. D. führte Experimente durch und analysierte sie. B.A-C und E.M.S. entwarfen Experimente und überwachten das Projekt, B.A-C schrieb das Papier. Alle Autoren haben das Papier bearbeitet.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Acrylamid-GeleGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MercaptoethanolSigmaM6250Giftig; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug.
AmmoniumbicarbonatSigma9830Giftig; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug
ANLSynthetisiert wie zuvor für AHA beschrieben (siehe Referenzen 5 und 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotin AlkinThermo,B10185
Hühner-Antikörper Anti-GFPAves1020
Vollständiger EDTA-freier ProteasehemmerRoche4693132001Toxisch; verwenden Sie einen Laborkittel und Handschuhe.
Kupfer (I)-bromidSigma25418599,999 % (wt/wt)
Disulfid-Tag (DST)-AlkinSynthetisiert, wie in der Referenznummer 15 berichtet, in der es als Sonde 20 bezeichnet wird
DMSOSigma 276855
FiltersMerkSCGP00525
Jodoacetamid (IAA)SigmaI1149
IR Anti-Huhn 800LI-CORIRDye 800CWEsel Anti-Hühner Sekundärer Antikörper
IR Anti-Rabit 680LI-CORIRDye 680RDZiege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer Antikörper
MaltoseSigmaM9171
Manueller MischerBioSpec Products1083
NaClSigmaS9888
N-EthylmaleimidSigma4259Giftig; Verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und einen Abzug.
NeutrAvidin-KügelchenPierce29200
NitrozellulosemembranBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7,8Präparation beschrieben in Referenznummer 5
PD SpinTrap G-25 SäulenGE HealthcarePufferaustausch
Pierce BCA Protein Assay KitThermo,23225Reagenzien im Pierce BCA Protein Assay Kit sind giftig für Wasserorganismen.
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Biotin-AntikörperCell Signaling5597
PVDF-MembranMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  Laufpuffer MOPSGenScriptM00138
SYPRO RubinfleckSigmaS4942
Tisch automatisch VortexerEppendorfMixmate
Triazol LigandSigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WasserSigmaW4502Molekularbiologie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
  3. Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939(2020).
  4. Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
  5. Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
  6. Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
  7. Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
  8. Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
  9. Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
  10. Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
  11. Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
  12. Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
  13. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  14. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  15. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
  16. Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
  17. van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
  18. O'Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).
  19. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  20. Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
  21. tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
  22. McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
  23. Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377(2016).
  24. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
  25. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  26. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).

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