Methodenartikel

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

DOI:

10.3791/63718

⸱

8. Juni 2022

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Myosteatose wurde kürzlich auch als negativer prognostischer Faktor für mehrere andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs entdeckt. Übermäßige Lipidinfiltration verringert die Muskelmasse und Kraft. Es führt auch zu Lipotoxizität und Insulinresistenz in Abhängigkeit vom gesamten intramyozellulären Lipidgehalt, der Lipidtröpfchenmorphologie (LD) und der subzellulären Verteilung. Der Fasertyp (oxidativ vs. glykolytisch) ist ebenfalls wichtig, da oxidative Fasern eine größere Kapazität zur Nutzung von Lipiden haben. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Pathophysiologie sind eingehende Studien zur LD-Dynamik und -Funktion in einer fasertypspezifischen Weise gerechtfertigt.

Hierin wird ein vollständiges Protokoll für die Quantifizierung des intramyozellulären Lipidgehalts und die Analyse der LD-Morphologie und der subzellulären Verteilung in einer fasertypspezifischen Weise vorgestellt. Dazu wurden serielle Muskelkryosektionen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Bodipy und Antikörpern gegen Myosin-Schwerkettenisoformen angefärbt. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener Muskeln, spart Zeit und vermeidet mögliche Artefakte und dank eines personalisierten Makros, das in Fidschi erstellt wurde, ist auch die Automatisierung der LD-Analyse möglich.

Einleitung

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Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Die Myosteatose korreliert negativ mit Muskelmasse und Kraft und mit der Insulinsensitivität1. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass der Grad der Myosteatose als prognostischer Faktor für andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen2, nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen3 oder Krebs4 verwendet werden könnte. Lipide können sich in der Skelettmuskulatur zwischen Muskelfasern als extramyozelluläre Lipide oder innerhalb der Fasern, als intramyozelluläre Lipide (IMCLs), ansammeln. IMCLs werden überwiegend als Triglyceride in Lipidtröpfchen (LDs) gespeichert, die als Stoffwechselbrennstoff bei körperlicher Betätigung verwendet werden 5,6. Wenn jedoch das Lipidangebot die Nachfrage übersteigt oder wenn Mitochondrien dysfunktional werden, werden IMCLs an der Muskelinsulinresistenz beteiligt, wie sie bei metabolisch ungesunden, fettleibigen Personen und bei Typ-2-Diabetes-Patientenbeobachtet wird 7. Interessanterweise haben Ausdauersportler ähnliche, wenn nicht sogar höhere IMCLs-Spiegel wie bei adipösen Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus, während sie gleichzeitig eine hohe Insulinsensitivität beibehalten. Dieses Phänomen wird als "Athletenparadoxon"8,9 beschrieben und wird durch eine nuanciertere Bewertung der Muskel-LDs in Bezug auf ihre Größe, Dichte, Lokalisation, Dynamik und Zusammensetzung der Lipidspezies erklärt.

Erstens korreliert die LD-Größe umgekehrt mit der Insulinsensitivität und der körperlichen Fitness10,11. Tatsächlich weisen kleinere LDs eine relativ größere Oberfläche für die Lipasewirkung auf und haben daher möglicherweise eine größere Fähigkeit, Lipide zu mobilisieren12. Zweitens spielt die LD-Dichte (Anzahl/Oberfläche) eine umstrittene Rolle bei der Insulinwirkung 8,10; Dennoch scheint es bei Athleten erhöht zu sein. Drittens ist die subzelluläre Lokalisation von LDs wichtig, da LDs, die sich direkt unter der Oberflächenmembran (subsarkolemmal oder peripher) befinden, eine schädlichere Wirkung auf die Insulinsensitivität ausüben als zentrale 8,9,13. Letztere liefern Brennstoff für zentrale Mitochondrien, die eine größere Atmungsaktivität haben und spezialisierter sind, um den hohen Energiebedarf zu decken, der für die Kontraktionerforderlich ist 14. Im Gegensatz dazu liefern periphere LDs subsarkolämale Mitochondrien, die an membranbezogenen Prozessen beteiligt sind8. Schließlich können über Triglyceride hinaus spezifische komplexe Lipide im Muskel schädlicher sein als andere. Zum Beispiel können sich Diacylglycerin, langkettiges Acyl-CoA und Ceramide im Muskel ansammeln, wenn die Triglycerid-Umsatzrate niedrig ist, wodurch die Insulinsignalisierung 9,15 beeinträchtigt wird. Um auf das "Athletenparadoxon" zurückzukommen: Ausdauersportler haben eine hohe Anzahl kleinerer zentraler LDs mit erhöhten Fluktuationsraten in Typ I (oxidativen) Fasern, während adipöse und diabetische Patienten größere periphere LDs mit niedrigen Fluktuationsraten in Typ II (glykolytischen) Fasern haben 8,15,16. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Energiespeicherung und -freisetzung könnten LDs über abgeleitete Fettsäuren (FA) und ein Mantelprotein (Perilipin 5) auch als kritische Akteure fungieren, die an der transkriptionellen Regulation der FA-Oxidation und der mitochondrialen Biogenese beteiligt sind8. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Physiologie und Pathophysiologie sind eingehende Studien über die Dynamik und Funktionen von LDs gerechtfertigt.

Obwohl es mehrere Techniken gibt, um IMCLs zu untersuchen, sind sie nicht alle geeignet, LD-Größe, -Dichte und -Verteilung auf faserspezifische Weise genau zu quantifizieren. Zum Beispiel bietet die Bewertung von IMCLs durch Magnetresonanzspektroskopie zwar nicht-invasiv, bietet aber eine Auflösung, die nicht ausreicht, um die Größe und genaue Position von LDs innerhalb der Faser zu untersuchen, und sie ist nicht fasertypspezifisch17,18. Ebenso können biochemische Techniken, die an Ganzmuskelhomogenaten19 durchgeführt werden, die Lage und Größe von Lipiden nicht beurteilen. Folglich ist die am besten geeignete Methode zur Analyse der LD-Morphologie und -Ortung die quantitative elektronische Transmissionsmikroskopie13, aber diese Technik ist teuer und zeitaufwendig. Daher hat sich die konfokale Fluoreszenzbildgebung auf Präparaten mit Farbstoffen wie Oil Red O (ORO)20,21, Monodansylpentan (MDH)22 oder Bodipy23,24,25 als das beste Werkzeug für diese Studien herausgestellt.

Hier wird ein vollständiges Protokoll beschrieben, einschließlich Gewebeentnahme und -verarbeitung, Bodipy-Färbung und konfokaler Bildaufnahme und -analyse zur Quantifizierung der LD-Größe, -Anzahl und -Lokalisation in Mausmuskel-Kryosektionen. Da IMCLs nicht gleichmäßig auf oxidative und glykolytische Fasern verteilt sind und jeder Fasertyp die LD-Dynamik unterschiedlich reguliert, muss die Untersuchung von IMCLs fasertypspezifischsein 16,25,26,27. Daher verwendet dieses Protokoll Immunfluoreszenz auf seriellen Abschnitten, um Myosin Heavy Chain (MyHC) Isoform(en) zu identifizieren, die von jeder Faser exprimiert werden. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die gleichzeitige Verarbeitung eines glykolytischen (Extensor digitorum longus, EDL) und eines oxidativen (Soleus) Muskels, die vor dem Einfrieren nebeneinander angeordnet sind (Abbildung 1). Diese gleichzeitige Verarbeitung spart nicht nur Zeit, sondern vermeidet auch Variabilität durch die getrennte Verarbeitung der Proben.

Protokollschema für das Einfrieren von Gewebe und Kryosektionen; Diagramm mit Immunhistochemie und Mikroskopie.
Abbildung 1: Schematische Übersicht des Vorgehens. Nach der Muskeldissektion (1) werden ausgewählte Muskeln ähnlicher Größe vorbereitet und zusammen eingefroren (2). Serielle Querschnitte von 10 μm werden mit einem Kryostaten erhalten und direkt auf Adhäsionsobjektträgern montiert (3). Aus zwei seriellen Objektträgern ist der erste (4A) für Laminin immunmarkiert und mit Bodipy gefärbt, um LDs zu erkennen, und der zweite (4B) ist mit Antikörpern gegen MyHCs zur Erkennung von Muskelfasertypen immunresistent. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop für Bodipy (5A) und einem Epifluoreszenzmikroskop für Muskelfasertypen (5B) aufgenommen. Die Bilder werden in Fidschi analysiert, indem ein Schwellenwert angewendet und Partikel (6A) quantifiziert werden, um die Anzahl, die durchschnittliche Größe, die Dichte und den Prozentsatz der Gesamtfläche zu erhalten, die von LDs (7) oder Zählzellen (6B) eingenommen wird, um den Prozentsatz der Fasern jedes Typs im Abschnitt (7) zu erhalten. Abkürzungen: LDs = Lipidtröpfchen; EDL = Extensor digitorum longus; MyHCs = Myosin-Schwerkettenisoformen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

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Alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierversuche aus dem medizinischen Bereich der Université Catholique de Louvain genehmigt (2019/UCL/MD/013).

1. Sezierung und Vorbereitung der Proben zum Einfrieren

  1. Beschriften Sie ein 3 mm dickes Stück Kork für jedes Muskelpaar.
  2. Setzen Sie durch einen kleinen Einschnitt mit einer Klinge in der Mitte des Korkens senkrecht ein rechteckiges Stück starren Kunststoffs (0,5 cm W, 1 cm H) ein, das als Stütze dient (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Die Größe des rechteckigen Kunststoffstücks hängt von der Größe des Muskels ab. Hierbei werden die beschriebenen Maße an die Größe des Soleus (~9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) und EDL (~5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) einer 3 Monate alten C57BL/6J männlichen Maus angepasst.
  3. Entfernen Sie zum Zeitpunkt der Dissektion den Soleus und die EDL der Hintergliedmaße der Maus. Um zu verhindern, dass die Proben während der Dissektion austrocknen, legen Sie sie auf eine Kompresse, die leicht mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist, in einer auf Eis gelegten Petrischale.
    HINWEIS: Siehe Wang et al.28 für Erklärungen, wie man diese beiden Gliedmaßenmuskeln seziert.
  4. Legen Sie einen kleinen Tropfen Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) an die Kork-Kunststoff-Verbindung und vermeiden Sie Luftblasen.
  5. Beseitigen Sie überschüssige Feuchtigkeit aus den Proben, indem Sie sie vorsichtig mit einem Papiertuch trocknen (Abbildung 2A) und legen Sie beide Muskeln senkrecht zum Korken auf den Kunststoff (Abbildung 2C).
  6. Überprüfen Sie die Orientierung der Muskelmyofasern unter einem Stereomikroskop (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Es ist wichtig, den Muskel nicht mit OCT zu bedecken, da seine isolierende Wirkung ein schnelles Einfrieren verhindern und gefrierende Artefakte erzeugen würde.

2. Einfrieren von Skelettmuskelproben für die Kryosektion

ACHTUNG: Das Einfrieren des Muskels muss unter einer chemischen Haube unter geeigneter persönlicher Schutzausrüstung erfolgen (siehe Materialtabelle).

  1. Verwenden Sie einen Edelstahlbecher (~8 cm H, 6 cm Ø) mit zwei Seitengurten, die mindestens 25 cm lang sind (Abbildung 2F), und füllen Sie den Becher bis zu 2/3 seines Fassungsvermögens mit Isopentan.
  2. Nehmen Sie den Becher an den Bändern und tauchen Sie ihn vorsichtig in eine mit flüssigem Stickstoff gefüllte Styroporbox, so dass der Stickstoffgehalt außerhalb des Behälters über dem Isopentangehalt im Inneren liegt (Abbildung 2F, G).
    VORSICHT: Wenn der Becher mit dem Stickstoff in Berührung kommt, kann der Temperaturschock zu einem Verwirbeln führen. Stellen Sie sicher, dass der Becher ausreichend eingetaucht ist, vermeiden Sie jedoch das Eindringen von Stickstoff, da dies zu Isopentanausfällungen führen würde. Wenn dies geschieht, lassen Sie das Isopentan abkühlen, füllen Sie den Becher mit neuem Isopentan und beginnen Sie von vorne.
  3. Wenn das Innere des Bechers vollständig mit einer weißen festen Schicht Isopentan bedeckt ist, nehmen Sie es aus der Flüssigstickstoffbox (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Die Schmelztemperatur von Isopentan beträgt -159 ° C, die Ränder des Bechers werden weiß, wenn es kalt genug ist.
  4. Rühren Sie die festen Isopentanstücke vorsichtig mit einer Pinzette in das verbleibende flüssige Isopentan ein, bis das gesamte Volumen wieder flüssig wird.
  5. Tauchen Sie den Becher wieder in den flüssigen Stickstoff ein, bis Isopentan am Boden und an den Rändern des Bechers weiße Kieselsteine bildet (Abbildung 2G, H).
    HINWEIS: Dieser zweite Kühlschritt sorgt für die entsprechende Gefriertemperatur des Isopentans.
  6. Entfernen Sie den Becher aus dem flüssigen Stickstoff und tauchen Sie die Muskeln schnell in den Boden des Bechers, indem Sie den Korken mit einer Rattenzahnpinzette halten. Schwenken Sie den Korken für 15 s im Isopentan und lagern Sie ihn bis zur Verarbeitung bei -80 °C (Abbildung 2I).
    HINWEIS: Für die kurzfristige Lagerung können die Proben in einem Gefrierschrank von -20 °C aufbewahrt werden. Das vollständige Protokoll für das schnelle Einfrieren der Skelettmuskulatur wurde bereits an anderer Stelle veröffentlicht. Für detaillierte Referenzen und Fehlerbehebung siehe: Meng et al.29, Kumar et al.30 und Leiva-Cepas et al.31.

3. Kryosektion

  1. Bringen Sie die Proben in die Kammer eines Kryostaten, der zuvor auf -20 °C abgekühlt und die Klingentemperatur auf -25 °C eingestellt wurde.
    HINWEIS: Transportieren Sie die Proben aus dem Gefrierschrank von -20 °C/-80 °C zum Kryostaten in einer mit Trockeneis gefüllten Styroporbox und lassen Sie die Proben vor dem Schneiden mindestens 20-30 min auf die Kammertemperatur ausgleichen.
  2. Entfernen Sie den Kunststoff mit einer feinen Pinzette vom Korken und legen Sie die Kryostat-Probenscheibe zum Abkühlen auf die Schnellgefrierplatte. Sobald die Platte -50 °C erreicht hat, legen Sie etwas OCT auf die Disc und legen Sie den Korken schnell auf die Scheibe, wobei Sie fest drücken. Warten Sie, bis das OAT erstarrt und der Korken gut auf der Disc befestigt ist.
  3. Legen Sie die Bandscheibe auf den Objektkopf in der gewünschten Schnittausrichtung (Abbildung 2J,K) und trimmen Sie den Muskelblock über mindestens 1/3 der Länge der Muskeln hinaus und bis beide Querschnitte der Muskeln sichtbar sind.
  4. Stellen Sie die Schnittstärke auf 10 μm ein und legen Sie einen Abschnitt auf einen Haftobjektträger, um die korrekte Ausrichtung der Fasern auf einem Hellfeldmikroskop zu überprüfen.
    HINWEIS: Die Überprüfung der Querorientierung der Fasern ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Fasern nicht ausreichend ausgerichtet sind, passen Sie den Winkel des Objektkopfes an, schneiden Sie einen anderen Abschnitt ab und überprüfen Sie ihn erneut.
  5. Legen Sie zwei serielle Querschnitte auf zwei vorbeschriftete Haftobjektträger: einen Objektträger zur Bestimmung der Fasertypen, den anderen zur Quantifizierung des Lipidgehalts (Abbildung 2L).
    HINWEIS: Zusätzliche serielle Querschnitte können erhalten und für andere histologische Studien bei -80 °C gehalten werden. Um jedoch eine Veränderung des Lipidgehalts und der intrazellulären Morphologie24 zu vermeiden, ist es wichtig, die ersten beiden Objektträger unmittelbar nach dem Schneiden zu verarbeiten, um ein Austrocknen an der Luft zu verhindern. Das Einfrieren und Auftauen der Objektträger zur LD-Quantifizierung hätte den gleichen Effekt und ist daher höchst unratsam.

4. Fasertypisierung und Bodipy-Färbung

  1. Immunhistochemischer Nachweis des Muskelfasertyps
    HINWEIS: Für das folgende Protokoll reicht ein Gesamtlösungsvolumen von 250 μL aus, um den gesamten Muskelabschnitt zu bedecken, der von einem Kreis umgeben ist, der mit einem hydrophoben Stift von der ungefähren Größe einer 1-Cent-Münze gezeichnet wird.
    1. Umgeben Sie die Abschnitte mit einem Umriss, der mit einem hydrophoben Pen gezeichnet wurde, und spülen Sie sie mit eiskalter 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min bei Raumtemperatur (RT) ab. Legen Sie den Objektträger in eine feuchte Kammer und blockieren Sie ihn für 90 min bei 37 °C in Blockierlösung (10% normales Ziegenserum (NGS) und 1:30 Maus auf Maus (MOM) blockierendes Reagenz in PBS).
    2. Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Objektträger für 90 min bei 37 °C mit der Lösung, die die primären Antikörper (5% NGS, 1:30 MOM blockierendes Reagenz, die primären Mausantikörper zur Erkennung von Typ I (IgG2b, bei 1:10), Typ IIa (IgG1, bei 1:10) und Typ IIx (IgM, bei 1:5) Fasern und einem Ratten-Antilaminin (α2-Kette, 1:1.000) in PBS.
    3. Waschen Sie die Dias mit PBS 3 x 5 min bei RT.
    4. Die Objektträger werden bei RT 1 h lang im Dunkeln mit der Lösung inkubiert, die die sekundären Antikörper enthält (Ziegen-Anti-IgG2b AF405 (1:500), Ziegen-Anti-IgG1 AF488 (1:500), Ziegen-Anti-IgM AF568 (1:1.000) und Ziegen-Antilaminin AF647 (1:500) in PBS).
      VORSICHT: Achten Sie für den Rest des Protokolls darauf, die Schienen vom Licht fernzuhalten, um die Fluoreszenz zu erhalten.
    5. Noch einmal 3 x 5 min in PBS waschen, in doppelt destilliertem H2O abspülen, überschüssiges Wasser entfernen und mit einem Antifade-Reagenz montieren.
      HINWEIS: Lagern Sie die Dias bei 4 °C, lichtgeschützt, um die Fluoreszenz bis zur Bildaufnahme zu erhalten. Da die Objektträger nicht fixiert sind, wird empfohlen, für jedes Experiment frisch hergestellte Lösungen zu verwenden, das PBS zu autoklavieren und die Bilder so schnell wie möglich zu erfassen, um eine Kontamination der Abschnitte zu vermeiden.
  2. Färben von LDs mit Bodipy
    HINWEIS: Ähnlich wie bei Schritt 4.1. reicht ein Gesamtlösungsvolumen von 250 μL aus, um den gesamten Muskelabschnitt zu bedecken, der von einem Kreis umgeben ist, der mit einem hydrophoben Stift von der ungefähren Größe einer 1-Cent-Münze gezeichnet wird.
    1. Umgeben Sie die Abschnitte mit einem Umriss, der von einem hydrophoben Stift gezeichnet wird, und spülen Sie mit eiskalten 0,1 M PBS für 10 Minuten bei RT ab. Verwenden Sie eiskaltes PBS für alle Spülungen und Wäschen.
    2. Mit kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) ohne Methanol für 10 min bei RT fixieren. Nach einer ersten schnellen Spülung waschen Sie die Dias mit PBS 3 x 5 min bei RT.
      VORSICHT: Führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Haube durch.
    3. Legen Sie den Objektträger in eine feuchte Kammer und blockieren Sie ihn für 1 h bei RT mit 5% NGS in PBS.
    4. Die Objektträger werden 90 min bei 37 °C mit der Lösung des primären Antikörpers (2% NGS und Ratten-Antilaminin (α2-Kette, 1:1.000) in PBS) inkubiert. Waschen Sie die Dias mit PBS 3 x 5 min bei RT.
      VORSICHT: Achten Sie für den Rest des Protokolls darauf, die Schienen vom Licht fernzuhalten, um die Fluoreszenz zu erhalten.
    5. Inkubieren Sie für 1 h bei RT mit der sekundären Antikörperlösung, die den Ziegenanti-Ratten-AF647-Antikörper (1:500) in PBS enthält. Waschen Sie die Dias mit PBS 3 x 5 min bei RT.
    6. Für 20 min bei RT mit einer Lösung von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,5 μg/ml) und BODIPY (1 μg/ml) in PBS inkubieren.
      HINWEIS: Um BODIPY Stammlösung herzustellen, lösen Sie es in DMSO in einer Konzentration von 1 mg/ml auf. Für die LD-Färbung sind verschiedene Bodipy-Formulierungen im Handel erhältlich. Abhängig von der getroffenen Wahl ist die Färbemethode die gleiche (gleiche Schritte, Konzentration und Inkubationszeit); Die Erfassungsmethode wird jedoch etwas anders sein.
    7. Nach einer ersten schnellen Spülung die Objektträger mit PBS 3 x 5 min bei RT waschen, in doppelt destilliertem H2O abspülen, überschüssiges Wasser entfernen und mit einem Antifade-Reagenz montieren.
      HINWEIS: Lagern Sie die Dias bei 4 °C, geschützt vor Licht, um die Fluoreszenz bis zur Bildaufnahme zu erhalten.

5. Aufnahme von Bildern

HINWEIS: Sobald die Färbeprotokolle abgeschlossen sind, ist es wichtig, sofort mit der Bildaufnahme (innerhalb der folgenden 24 Stunden) fortzufahren, nicht nur, um eine Kontamination zu vermeiden, sondern auch, um die Morphologie, Größe und Anzahl der LDs zu erhalten.

  1. Aufnahme von Bildern zur Beurteilung der Fasertypen jedes untersuchten Muskels
    HINWEIS: Dieser Schritt könnte mit einem Fluoreszenz-Rastermikroskop für ganze Objektträger oder mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop erreicht werden. Bei letzterem muss ein manuelles oder automatisiertes Zusammenfügen der Bilder erfolgen, um den Ausschnitt zu rekonstruieren.
    1. Verwenden Sie für die Fasertyperkennung ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem 10x/0,3-Objektiv. Wählen Sie Anregungsfilter für DAPI (405 nm), FITC, TRITC und Cy5 aus, um Typ-I-, IIa-, IIx-Fasern bzw. Laminin zu erkennen.
      HINWEIS: Typ-IIb-Fasern werden nicht immunmarkiert. Sie werden als Fasern erkannt, die an den Grenzen des Sarkolemmas mit einem schwarzen Sarkoplasma mit Laminin gefärbt sind.
    2. Stellen Sie die entsprechende Belichtungszeit für jeden Kanal ein.
    3. Wenn Sie ein herkömmliches Epifluoreszenzmikroskop verwenden, erfassen Sie immer die Bilder des gesamten Muskels in der gleichen Reihenfolge, um den Muskelaufbau zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Fasern am rechten Rand eines Bildes auch am linken Rand des folgenden Bildes angezeigt werden. Gleiches gilt für den oberen und unteren Teil der Bilder (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Als Referenz decken für einen Abschnitt der EDL oder des Soleus, der von einer 3 Monate alten Maus seziert wurde, durchschnittlich sechs bzw. acht Bilder den gesamten Muskelquerschnitt ab.
    4. Nachdem der Muskel gescannt wurde, laden Sie die aufgenommenen digitalen Bilder in eine beliebige Bildverarbeitungssoftware zur Rekonstruktion (Stitching) hoch, basierend auf der Fasermorphologie (Laminin) und der Histologie des Muskelabschnitts, und speichern Sie sie als TIFF-, PNG- oder JPG-Datei, in der alle Kanäle (Farben) zusammengeführt werden (Abbildung 3A).
  2. Aufnahme von Bildern mit Laminin und Bodipy Co-Färbung
    HINWEIS: Um den Fasertyp zu erkennen und eine Schätzung der Anzahl der Fasern für jeden erfassten Typ zu erhalten, ist es wichtig, dass der Fasertypabschnitt bereits gescannt und die Muskeln rekonstruiert werden, bevor mit der Bildaufnahme von Bodipy-Laminin begonnen wird (Abbildung 3B).
    1. Verwenden Sie für die Beobachtung und Aufnahme von Bodipy-Bildern ein konfokales Mikroskop mit einem 40-fachen Öl-Tauchobjektiv mit einer numerischen Blende von 1,4.
    2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Pinhole bei 1 AE, 2.048 Pixel x 2.048 Pixel Auflösung, Pixelgröße bei 0,08 μm, unidirektionaler Modus, Scangeschwindigkeit bei 4 (~4 μs/Pixel), Zeilenmittelwert auf 4x eingestellt und digitaler Zoom auf 1 eingestellt.
    3. Um ein Übersprechen zwischen Bodipy-558/568 und Laminin-AF647 zu vermeiden, verwenden Sie den sequenziellen Scanmodus der konfokalen Software.
      HINWEIS: Wenn der gewählte Farbstoff Bodipy-493/503 ist, ist simultanes konfokales Laserscanning ohne Übersprechen zwischen dem Bodipy-Kanal und dem Laminin-AF647-Kanal möglich. Dies beschleunigt die Aufnahme von Bildern.
    4. Anregung von Bodipy-493/503 mit der 488-nm-Laserlinie oder Argon-Laserlinie und Anregung von Bodipy-555/568 mit der 561-nm-Diodenlaserlinie. Erkennen Sie schließlich Laminin-AF647 mit einer 640-nm-Diodenlaserlinie.
      VORSICHT: Denken Sie daran, dass Bodipy-Moleküle sehr empfindlich auf Photobleichen reagieren, vermeiden Sie daher unnötiges Laserscannen. Um Fasern zu erkennen, verwenden Sie nur den Laser für Laminin.
    5. Je nach gewähltem Farbstoff legen Sie die Emissionsbereiche auf 570-650 nm für Bodipy-493/503 24 und auf 565-620 nm für Bodipy-558/568 fest. Legen Sie den Emissionsbereich für Laminin auf 656-700 nm fest.
    6. Stellen Sie die Verstärkung und die digitale Verstärkung entsprechend ein, damit keine gesättigten Pixel auf der Bereichsanzeige erkannt werden. Korrigieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie den Versatz anpassen.
      HINWEIS: Die Filterauswahl und andere oben genannte Scanning-Parameter müssen für jedes konfokale Mikroskop optimiert werden. Es ist wichtig, dass alle oben genannten Einstellungen konstant gehalten werden, damit alle aus Proben aufgenommenen Bilder verglichen werden können.
    7. Um den Fasertyp unter den auf dem konfokalen Mikroskop visualisierten Fasern zu identifizieren, verwenden Sie einen persönlichen Laptop, auf dem das Bild des Abschnitts rekonstruiert wird, nachdem die Faserimmundetektion überprüft wurde (Abbildung 3B).
    8. Sobald eine Gruppe von Fasern korrekt identifiziert wurde, erfassen Sie das Bild mit den Bodipy- und Lamininkanälen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Bodipy-Laminin-Bildnamen in der Region des Muskels zu notieren, in der sich diese Fasern auf dem für die MyHC-Erkennung aufgenommenen Bild befinden, um die spätere faserspezifische Analyse von LDs zu erleichtern.

6. Analyse von Bildern

  1. Analyse der Fasertypen an jeder Muskelprobe
    1. Öffnen Sie in Fidschi (oder ImageJ)32 die TIFF-, PNG- oder JPG-Datei mit dem rekonstruierten Muskel, der aus der Zusammenführung aller Kanäle gewonnen wurde, die zum Nachweis der Faserisoformen verwendet werden.
    2. Um das Cell Counting Tool zu starten, klicken Sie auf Plugins | | analysieren | des Zellzählers Zellzähler.
    3. Klicken Sie im Fenster Zellzähler auf Aktionen | Initialisieren.
    4. Wählen Sie im selben Fenster unter Leistungsindikatoren die Option Typ 1 aus.
    5. Wählen Sie im Hauptfenster von Fidschi das Zauberstab-Werkzeug aus.
    6. Um die Anzahl der Verbindungslinien jedes Typs zu quantifizieren, klicken Sie auf jede Verbindungslinie desselben Typs, damit das Programm die Anzahl der angeklickten Verbindungslinien aufzeichnet.
    7. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie den nächsten Fasertyp aus und wiederholen Sie die gleichen Schritte.
    8. Wenn alle Verbindungslinien des Bildes einem bestimmten Verbindungslinientyp zugewiesen wurden, klicken Sie im Fenster Zellzähler auf Ergebnisse, um die Ergebnisse in einer Tabelle anzuzeigen.
    9. Speichern Sie diese Tabelle als Tabellentabelle, indem Sie auf Datei | klicken Speichern unter im Ergebnisfenster .
    10. Speichern und laden Sie die Auswahl jederzeit auf demselben Bild, indem Sie im Fenster Zellenzählung auf Markierungen speichern bzw. Lademarkierungen klicken.
  2. Analyse von Lipidtröpfchen faserabhängig
    1. Analysieren Sie die Bilder von Bodipy und Laminin, die auf dem konfokalen mit Fidschi für die Quantifizierung von LDs erhalten wurden.
      HINWEIS: Die Autoren haben ein benutzerdefiniertes Makro entworfen, um die Analyse zu automatisieren. Dieses Makro ist zusammen mit einer Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung als Ergänzungsdatei 1 bzw. Ergänzungsdatei 2 verfügbar.
    2. Öffnen Sie jedes Bild mit Hilfe des Bio-Formats Importers aus Fidschi. Wählen Sie unter der Option Stapel anzeigen mit die Option Hyperstack | aus. Farbmodus, Standard. Stellen Sie sicher, dass das Fenster Automatische Skalierung ausgewählt ist.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben das Protokoll für die Analyse einer Faser auf dem Bild, aber es muss so oft wiederholt werden, wie die Anzahl der gesamten Fasern auf dem Bild erscheint.
    3. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug , um das Sarkolemma der Faser basierend auf dem Lamininkanal manuell auszuwählen (Abbildung 4A), und drücken Sie T auf der Tastatur, um die Auswahl oder Region of Interest (ROI) im ROI-Fenster aufzuzeichnen.
    4. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf | analysieren Legen Sie die Maße fest und wählen Sie im Popup-Fenster Fläche und Durchmesser von Feret aus. Lassen Sie die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert und andere Parameter so, wie sie standardmäßig angezeigt werden.
    5. Klicken Sie im ROI-Fenster auf Messen, um die Fläche und den minimalen Feret-Durchmesser (MF) der ausgewählten Faser abzurufen und sie für die spätere Verwendung zu notieren.
      HINWEIS: Bei der Analyse von LDs ist es wichtig zu berücksichtigen, dass ihre Größe und Dichte zwischen dem Zentrum und der Peripherie (subsarkolemmale Region-SS) der Faser variieren. Daher muss die Analyse separat durchgeführt werden.
    6. Berechnen Sie den Wert von 1/6 des MF, um den zentralen Teil der Faser abzugrenzen.
      HINWEIS: Im Makro ist der Standard-MF-Wert auf 6 festgelegt, was bedeutet, dass die angewendete Reduktion als 1/6 der MF festgelegt wird. Dieser Wert wurde auf der Grundlage der empirischen Daten aus dem Soleus von Tieren gewählt, die mit einer fettreichen Ernährung gefüttert wurden. Jeder Forscher muss diese Zahl jedoch basierend auf den empirischen Daten und dem analysierten Muskel, der Art der Faser und dem Tierzustand ändern.
    7. Klicken Sie im ROI-Fenster auf Hinzufügen, um ein Duplikat des ersten ROI zu erhalten, und wählen Sie den zweiten ROI aus, der im Fenster angezeigt wird.
    8. Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf | bearbeiten Auswahl | Vergrößern und geben Sie den zuvor berechneten Wert (aus Schritt 6.2.6.) mit einem Minuszeichen vor der Zahl ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im ROI-Fenster auf Add[t] (ein dritter ROI muss erscheinen) und Löschen, um den zweiten ROI zu löschen.
      HINWEIS: Der Forscher kann die Ergebnisse überprüfen, indem er im ROI-Fenster auf das Feld Alle anzeigen klickt. An diesem Punkt müssen zwei ROIs angezeigt werden, einer, der den gesamten Umfang der Faser umgibt (Abbildung 4B) und ein anderer, der in der Mitte platziert ist (Abbildung 4C).
    9. Wählen Sie beide ROIs im ROI-Fenster aus und klicken Sie auf Weitere | XOR-| Hinzufügen[t]. Warten Sie, bis ein dritter ROI angezeigt wird, der der Peripherie der Faser entspricht (Abbildung 4D).
    10. Speichern Sie die ROIs, indem Sie auf Weitere | klicken Speichern Sie , um die ROIs zu sparen, falls eine spätere erneute Analyse der gleichen Fasern erforderlich ist.
    11. Wählen Sie den Bodipy-Kanal aus und öffnen Sie das Schwellenwert-Tool , indem Sie auf Image | klicken | anpassen Schwelle am Hauptfenster von Fidschi.
    12. Stellen Sie im Popup-Fenster Schwellenwert die Werte auf 70/255 ein und wählen Sie Yen | B & W-Methode, und klicken Sie auf Dark Hintergrund | Bewerben Sie sich.
      HINWEIS: Die auf den Schwellenwert angewendeten Werte können je nach den Bedingungen des Experiments variieren, und der Schwellenwert muss entsprechend eingestellt werden , um die Analyse zu optimieren. Ein Schwarz-Weiß-Fenster mit dem Bodipy-Signal oberhalb der in Weiß dargestellten Schwelle und der Hintergrund in Schwarz muss angezeigt werden (vergleichen Sie das ursprüngliche Bodipy-Bild in Abbildung 4E mit dem in Abbildung 4F).
    13. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf | analysieren Legen Sie Messungen fest, und wählen Sie im Popupfenster Fläche, Flächenanteil und Auf Schwellenwert begrenzen aus. Lassen Sie die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert und andere Parameter so, wie sie standardmäßig angezeigt werden.
      HINWEIS: Wenn der Forscher die "Zirkularität" von LDs analysieren möchte, bei der es sich um einen Index der sphärischen Morphologie handelt, der von 1 für eine perfekte Kugel bis 0 für eine Linie reicht, klicken Sie im Popup-Fenster Maße festlegen auf das Feld Formdeskriptoren.
    14. Gehen Sie zum ROI-Fenster und wählen Sie den ersten ROI aus. Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf | analysieren Werkzeug "Partikel analysieren".
      HINWEIS: Dieses Tool quantifiziert die Anzahl, Größe, abgedeckte Fläche und den Prozentsatz der gesamten Fläche, die bei jeder Auswahl von Partikeln bedeckt ist, und speichert die Ergebnisse als Tabellenkalkulationsdatei.
    15. Legen Sie die Werte im Fenster Partikel analysieren von 2 auf Unendlich (2-Unendlich) fest, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Pixel, behalten Sie die Standardkreiswerte bei, wählen Sie Zusammenfassen und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Um die Ergebnisse auf der Verbindungslinie zu überprüfen, wählen Sie unter der Option Anzeigen eine der verfügbaren Optionen aus. Damit die Informationen jeder LD in der Auswahl in einer Tabelle erkannt werden, aktivieren Sie die Option Ergebnisse anzeigen im Fenster Partikel analysieren . Die Ergebnisse der Analyse der Gesamtfläche der Faser werden gemittelt und in einer Tabelle mit mehreren Spalten zusammengefasst (Anzahl, Gesamtfläche, Durchschnittsgröße, % Fläche; diese entsprechen der Anzahl der Partikel [LDs], der von diesen Partikeln besetzten Fläche, ihrer durchschnittlichen Größe und dem Prozentsatz der Gesamtfläche der Selektion, die von Partikeln besetzt wird. b. Um die Dichte zu berechnen, dividieren Sie die Anzahl der Partikel durch die Gesamtfläche jeder Auswahl.
    16. Um die Werte des Mittelpunkts und der Peripherie der Verbindungslinie zu erhalten, wiederholen Sie die Schritte 6.2.14 und 6.2.15, wobei Sie jedes Mal den zweiten (Mitte) und den dritten ROI (Peripherie) auswählen.
    17. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Datei | klicken Speichern unter im Fenster Zusammenfassung .
      HINWEIS: Geben Sie den Typ der Verbindungslinie, die Bedingung und den Bildnamen in den zugewiesenen Namen der Ergebnisse ein, um eine spätere Vereinheitlichung und statistische Analyse der Daten zu erleichtern. Um den Rest der Verbindungslinien im selben Bild zu analysieren, wiederholen Sie die Schritte 6.2.3 bis 6.2.17. Für die statistische Analyse müssen mindestens 10-15 Fasern jedes Typs pro Tier analysiert werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hierin beschriebene Protokoll bietet eine effiziente Methode zur einfachen Quantifizierung von LDs in einer faserartigen und subzellularspezifischen Weise. Es zeigt, wie durch das Einfrieren von zwei Muskeln ähnlicher Größe, wie dem EDL und dem Soleus, die Zeit und die Ressourcen, die für die folgenden Schritte aufgewendet werden, um die Hälfte reduziert werden.

Es wird ein vollständiges Protokoll für die Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse der verschiedenen MyHC-Isoformen bereitgestell...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Quantifizierung von LDs, die mit Bodipy auf einer faser- und subzellularspezifischen Basis markiert sind. In den letzten Jahren wurden klassische Lipidfarbstoffe wie ORO oder Sudan Black B durch eine neue Reihe von zelldurchlässigen, lipophilen, fluoreszierenden Farbstoffen ersetzt, die an neutrale Lipide binden (z. B. Bodipy). Bodipy ist als verschiedene Konjugate erhältlich und hat sich als sehr effektiv bei der Markierung von LDs erwiesen, um ihre ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) und der Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care) unterstützt.C.M.S. erhält ein Ph.D.-Stipendium der FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. erhielt ein Stipendium des Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.

Die Autoren danken Alice Monnier für ihren Beitrag zur Entwicklung dieses Protokolls und Caroline Bouzin für ihre Expertise und technische Hilfe bei der Bildaufnahme. Wir danken auch der Bildgebungsplattform 2IP-IREC für den Zugang zum Kryostaten und den Mikroskopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Brüssel, Belgien). Abschließend möchten sich die Autoren bei Nicolas Dubuisson, Romain Versele und Michel Abou-Samra für ihre konstruktive Kritik am Manuskript bedanken. Einige der Figuren dieses Artikels wurden mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix KameraZeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD Kamera Zeiss
Chemical HoodPotteau LaboEN-14175
KonfokalmikroskopZeissLSM800
Korkscheiben (ø 20 mm, 3 mm dick) ElektronenmikroskopieSciences 63305
Kryo-HandschuheTempshield16072252
KryostatThermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
Präparier-Stereomikroskop SMZ745Nikon
Trockeneis
Dumont PinzetteF.S.T11295-10
EpifluoreszenzmikroskopZeissAxioImage-Apotome Z1
Extra feine Bonner SchereF.S.T14084-08
FisherBrand Einweg Basisformen (0,7 x 0,7 cm)ThermoFisher22-363-552Wird verwendet, um ein Stück zu schneiden, um den Muskel auf dem Korken zum Einfrieren zu halten
Petrischale aus Glas (H 25  mm, ø 150  mm)MARKE Petrischale, MERKBR455751Wird verwendet, um die Muskeln während der Dissektion auf Eis zu legen
ImmEdge Hydrophobe Barriere PAPPen Vector LabsH-4000Wird verwendet, um eine hidrophobische Barriere um die Muskelabschnitte
zu schaffen InkubatorMMM MedcenterIncucell 707 
Mikroskop-Deckgläser (24x50 mm)Assistent 
Objektträgerboxen Kartell278Wird als Feuchtkammer für die Immunhistochemie verwendet
HalshalterLinie zwoSB-035X-02Wird als Riemen zum Halten des Edelstahlbechers
verwendet Nr. 15 Steriler Skalpell aus KohlenstoffstahlKlinge Swann-Morton0205
PinselVan BleiswijckAmazon B07W7KJQ2XWird zur Handhabung von Kryosektionen
Permanent Marker Pen SchwarzKlinipath/VWR98307-RZur Beschriftung von Objektträgern
Pierce Fixation PinzetteF.S.T18155-13
Polystyrol-Box H 12 cm x L 25 cm x B 18 cm, wird als Behälter für flüssigen Stickstoff und zum Transport der Proben zum Kryostaten
Skalpellgriff, 125 mm (5"), Nr. 3AesculapBB073R
Edelstahlbecher 10oz EboxerB07GFCBPFHTumbler zum Befüllen mit Isopentene zum Einfrieren von Muskeln
Superfrost Ultra Plus ObjektträgerThermoFisherJ1800AMNZ
Chirurgische Pinzette 1/2 ZähneMedizinischer Fachhandel1303152Auch "Rattenzahnpinzette" genanntVannas
Federschere - 3 mm SchneideF.S.T15000-00
WägeschiffchenVWR international611-2249
Ganzobjektträger-Scanner für FluoreszenzZeissAxio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2bSigma-AldrichSAB4600477Wird bei einer Endkonzentration von 1:500
verwendet Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1ThermoFisherA-21121Wird bei einer Endkonzentration von 1:500
Alexa Fluor 568 Ziege Anti-MausIgM Abcamab175702Verwendet in einer Endkonzentration von 1:1.000
Alexa Fluor 647 Ziegen Anti-Ratten-IgG (H+L) SekundärantikörperThermoFisherA-21247Verwendet in einer Endkonzentration von 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-Difluor-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)ThermoFisherD3922Bei einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluor-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen-3-Dodecansäure)ThermoFisherD3835Verwendet in einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/mL
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)ThermoFisherD1306Verwendet in einer Endkonzentration von 0,5 &μ; g/mL
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD-8418Wird verwendet, um Bodipy für die 1 mg/mL Stammlösung zu lösen. VORSICHT: Giftig und brennbar. Dämpfe können zu Reizungen führen. Manipulieren Sie in einem Abzug. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Haut. Tragen Sie Gummihandschuhe und eine Schutzbrille.
Formaldehydlösung 4%, gepuffert, pH 6,9Sigma-Aldrich1004969011VORSICHT: Kann allergische Hautreaktionen hervorrufen. Im Verdacht, genetische Defekte zu verursachen. Kann Krebs verursachen. Manipulieren Sie in einem Abzug. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Haut. Tragen Sie Gummihandschuhe und eine Schutzbrille.
Isopentan GPR RectaPurVWR international24872.298<strong>VORSICHT: Flüssigkeit und Dampf extrem entzündlich. Kann tödlich sein, wenn es verschluckt wird und in die Atemwege gelangt. Kann Schläfrigkeit oder Benommenheit verursachen. Wiederholter Kontakt kann zu Hauttrockenheit oder Rissbildung führen. Tragen Sie Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz.
Flüssiger StickstoffVORSICHT:  Extrem kalt. Tragen Sie Handschuhe. Langsam handhaben, um Kochen und Spritzen zu minimieren, und in gut belüfteten Bereichen. Verwenden Sie Behälter, die für Flüssigkeiten mit niedriger Temperatur ausgelegt sind.
Maus auf Maus Blockierungsreagenz Vector LabsMKB-2213-1Verwendet in einer Konzentration von 1:30
Myosin-Schwerkette Typ I (BA-D5-s Primärer Antikörper) Gen: MYH7, monoklonale Rinder-Anti-Maus IgG2bDSHB University of IowaBA-D5-ÜberstandVerwendet in einer Endkonzentration von 1:10
Myosin-Schwerkette Typ IIA (SC-71-s Primärer Antikörper) Gen:  MYH2, monoklonaler boviner Anti-Maus-IgG1DSHB University of IowaSC-71-ÜberstandWird in einer Endkonzentration von 1:10
verwendet Myosin-Schwerkette Typ IIX (6H1-s Primärer Antikörper), Gen:  MYH1, monoklonales Kaninchen Anti-Maus IgMEntwicklungsstudien Hybridoma Bank, University of Iowa6H1-ÜberstandVerwendet in einer Endkonzentration von 1:5
Normales Ziegenserum (NGS)Vector LabsS-1000
PBS 0,1 MHäufig verwendet in Histologielabors
ProLong Gold Antifade EindeckmittelInvitrogen P36930
Ratten-Anti-Laminin-2 (α-2-Kette) Primärantikörper (monoklonal)Sigma-AldrichL0663Verwendet in einer Endkonzentration von 1:1.000
Tissue-Tek O.C.T. VerbindungSakura 4583
Software
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Wird verwendet, um die Figuren
zu gestalten: Adobe PhotoshopAdobe Inc.Konfokale Software
BioRenderhttps://biorender.com/Wird verwendet, um die Figuren
zu entwerfen Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/Wird verwendet, um die aufgenommenen Bilder zu analysieren
Microsoft PowerPointMicrosoftWird verwendet, um die Histologie des gesamten Muskels nach dem Scannen der Fasertypen zu rekonstruieren
Zen Blue 2.6ZeissWird verwendet, um die Histologie des gesamten Muskels nach dem Scannen der Fasertypen zu rekonstruieren
40990151 verwendet verwendet ,

Referenzen

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