Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

3.1K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/63720

⸱

11. April 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.

Zusammenfassung

RNA ist ein Biopolymer, das in allen Bereichen des Lebens vorkommt, und seine Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und/oder reaktiven Spezies, z. B. DNA, Proteinen, Ionen, Medikamenten und freien Radikalen, sind allgegenwärtig. Infolgedessen durchläuft RNA verschiedene Reaktionen, einschließlich ihrer Spaltung, ihres Abbaus oder ihrer Modifikation, was zu biologisch relevanten Spezies mit unterschiedlichen Funktionen und Implikationen führt. Ein Beispiel ist die Oxidation von Guanin zu 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), die in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auftreten kann. Insgesamt sind Verfahren, die solche Produkte und Transformationen charakterisieren, für die wissenschaftliche Gemeinschaft weitgehend wertvoll. Zu diesem Zweck ist die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) eine weit verbreitete Methode. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie RNA-Fragmente, die nach enzymatischer Behandlung gebildet werden, charakterisiert werden können. Das gewählte Modell verwendet eine Reaktion zwischen RNA und der Exoribonuklease Xrn-1, bei der die enzymatische Verdauung an oxidierten Stellen gestoppt wird. Zwei 20-Nukleotid lange RNA-Sequenzen [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] wurden durch Festphasensynthese erhalten, quantifiziert durch UV-Vis-Spektroskopie und charakterisiert durch MALDI-TOF. Die erhaltenen Stränge wurden dann (1) 5'-phosphoryliert und mittels MALDI-TOF charakterisiert; (2) mit Xrn-1 behandelt; (3) gefiltert und entsalzt; (4) analysiert über MALDI-TOF. Dieser Versuchsaufbau führte zur eindeutigen Identifizierung der Fragmente, die mit dem Abwürgen von Xrn-1 verbunden sind: [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-H2 PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Die beschriebenen Experimente wurden mit 200 Picomolen RNA (20 pmol für MALDI-Analysen) durchgeführt; Geringere Mengen können jedoch zu nachweisbaren Spitzen mit Spektrometern führen, die Laserquellen mit mehr Leistung als die in dieser Arbeit verwendete verwenden. Wichtig ist, dass die beschriebene Methodik verallgemeinert und möglicherweise auf die Produktidentifizierung für andere Prozesse mit RNA und DNA ausgedehnt werden kann und bei der Charakterisierung / Aufklärung anderer biochemischer Signalwege helfen kann.

Einleitung

MALDI-TOF 1,2,3 ist eine weit verbreitete Technik zur Charakterisierung und/oder Detektion von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften. Einige seiner Anwendungen umfassen verschiedene Anwendungen wie den Nachweis von Tanninen aus natürlichen Ressourcen4, die Bildgebung von Metaboliten in Lebensmitteln5, die Entdeckung oder Überwachung von zellulären Wirkstoffzielen oder Markern6 und die klinische Diagnostik7, um nur einige zu nennen. Von Relevanz für die vorliegende Arbeit ist die Verwendung von MALDI-TOF mit DNA oder RNA, wobei seine Verwendung auf Oligonukleotiden auf über drei Jahrzehnte zurückgeht8, wo mehrere Einschränkungen festgestellt wurden. Diese Technik hat sich nun zu einem zuverlässigen, häufig verwendeten Mittel entwickelt, um sowohlBiopolymere 9 zu charakterisieren als auch chemische und biochemische Reaktionen zu identifizieren/verstehen, z. B. die Charakterisierung platinierter Stellen in RNA10, die Identifizierung von RNA-Fragmenten nach der Strangspaltung 11,12 oder die Bildung von Protein-DNA-Querverbindungen 13 . Daher ist es wertvoll, wichtige Aspekte der Verwendung dieser Technik zu veranschaulichen und hervorzuheben. Die Grundlagen von MALDI-TOF wurden auch im Videoformat14 beschrieben und werden hier nicht weiter ausgeführt. Darüber hinaus wurde seine Anwendung in einem DNA- oder Proteinkontext zuvor in dem genannten Format15,16,17 beschrieben und veranschaulicht.

Das Protokoll zum Nachweis von RNA-Fragmenten, die nach enzymatischer Hydrolyse gebildet werden, wird hierin berichtet. Das experimentelle Modell wurde auf der Grundlage eines kürzlich von unserer Gruppe18 veröffentlichten Ergebnisses ausgewählt, bei dem MALDI-TOF verwendet wurde, um die einzigartige Reaktivität zwischen der Exoribonuklease Xrn-1 und Oligonukleotiden von RNA zu bestimmen, die die oxidative Läsion 8-OxoG enthalten. Die 20-Nukleotid-Langstränge wurden durch Festphasensynthese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] erhalten, während Xrn-1 nach dem zuvor beschriebenen Bericht20 exprimiert und gereinigt wurde. Kurz gesagt, Xrn-121 ist eine 5'-3'-Exoribonuklease mit verschiedenen biologischen Schlüsselrollen, die mehrere Arten von RNA, einschließlich oxidierter RNA22, abbauen. Es wurde festgestellt, dass die Prozessivität des Enzyms bei der Begegnung mit 8-OxoG zum Stillstand kommt, was zu RNA-Fragmenten führte, die 5'-phosphorylierte Enden [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 enthielten.

Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Massenspektrometrie eine leistungsfähige Methode ist, die durch verschiedene Methoden an andere Zwecke angepasst werden kann23,24; Daher ist die Wahl der richtigen Ionisationsmethode sowie anderer Versuchsaufbauten von größter Bedeutung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurde RNase-freies Reinstwasser (Tabelle 1) verwendet.

1. Konzentrationsbestimmung von RNA-Lösung

  1. Bereiten Sie die RNA-Probe gemäß den folgenden Schritten vor.
    1. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml), um eine RNA-Lösung herzustellen, indem Sie 1 μL Stammlösung (erhalten durch Festphasensynthese)19 in 159 μLRNase-freies H2Overdünnen. Mischen Sie die Lösung, indem Sie die Mischung wiederholt (10x) auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Da eine große Auswahl an Küvetten im Handel erhältlich ist, können die benötigten Volumina abweichen. Bei dieser Arbeit wurden Küvetten mit einer Weglänge von 1 cm und reduziertem Volumen (150 μL) verwendet.
    2. Spülen Sie die UV-Vis-Küvette mit Methanol (2x), gefolgt von Wasser (ultrareines H2O, 3x, siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Stickstoffgasstrom, um die Küvette gründlich zu trocknen.
    3. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung (Schritt 1.1.1) in die Küvette zu übertragen, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen. Verschließen Sie die Küvette und legen Sie sie zur Seite, bis sie benötigt wird.
  2. Bestimmen Sie die Konzentration der hergestellten RNA-Lösung mit dem UV-Vis-Spektralphotometer.
    1. Schalten Sie das UV-Vis-Spektralphotometer ein, indem Sie den Schalter auf der Rückseite des Instruments umlegen. Lassen Sie das Gerät den Startvorgang abschließen und klicken Sie auf das UV WinLab-Symbol , um das Bedien-/Steuerungsfenster des Geräts zu öffnen.
    2. Schalten Sie das Spektralphotometer Peltier Temperature Controller mit dem Schalter rechts vom Gerät ein.
    3. Klicken Sie unter Basismethoden auf Scan - Lambda 365. Ein weiterer Bildschirm wird geöffnet und der Benutzer wird aufgefordert, sicherzustellen, dass die Zellenhalter leer sind. Klicken Sie auf OK und lassen Sie das Gerät seine Systemprüfungen durchführen. Das System zeigt dann eine Liste von Prüfungen an, stellt sicher, dass alle "Pass" und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Schritte 1.2.1-1.2.3 in der angegebenen Reihenfolge auszuführen. Das Ändern dieser Abfolge von Ereignissen kann zu einer Fehlfunktion der Software führen.
    4. Passen Sie die Scanparameter an, indem Sie Datenerfassung auswählen. Ändern Sie im neuen Fenster unter Scaneinstellungen den Start auf 350 nm und das Ende auf 215 nm.
    5. Aktivieren Sie das Peltier , indem Sie das + links neben dem Zubehör auswählen. Klicken Sie auf Multiple Cell Peltier, ändern Sie die Temperatur °C auf 25 und klicken Sie auf Peltier On.
    6. Navigieren Sie zur Registerkarte Beispielinformationen , und geben Sie die Anzahl der Stichproben, Namen und Zellenpositionen wie gewünscht ein.
    7. Klicken Sie auf AutoNull und legen Sie die Küvette ein, die die Hintergrundlösung enthält. Stellen Sie sicher, dass diese Küvette im selben Schlitz positioniert ist, in dem Messungen durchgeführt werden.
    8. Klicken Sie auf Start und setzen Sie die Küvette (Schritt 1.1.3) in die gewünschte Zelle ein. Stellen Sie sicher, dass das Küvettenfenster parallel zur Vorderseite des Instruments ausgerichtet ist. Klicken Sie auf OK, um den ersten Scan bei 25 °C zu starten.
    9. Bei Messungen bei höheren Temperaturen sind die Schritte 1.2.5-1.2.8 zu wiederholen und die Temperatur auf die gewünschte Probentemperatur (im vorliegenden Fall 90 °C) zu ändern.
    10. Klicken Sie auf Datei > Exportieren und wählen Sie den gewünschten Dateispeicherort aus. Wählen Sie XY-Daten aus, um eine .txt Datei zu erhalten.
      HINWEIS: Eine anschauliche Hilfe zu Schritt 1.2 finden Sie in der Ergänzungsdatei 1 (S1-S7).
  3. Führen Sie eine Datenerfassung zur Bestimmung der RNA-Konzentration durch.
    1. Suchen Sie die Datei für jedes Spektrum auf der Registerkarte Ergebnisse . Um die Absorption zu erhalten, bewegen Sie den Mauszeiger über die Linie, navigieren Sie zu 260 nm und zeichnen Sie die angezeigten Absorptionen auf. Alternativ können Sie die Daten über die Kaskade File > Export als .txt Datei exportieren, um sie mit einer anderen Plotsoftware weiter grafisch zu analysieren.
      HINWEIS: Wenn 0,1 < A ≥ 1 ist, muss die Konzentration der in Schritt 1.1.1 hergestellten RNA-Probe entweder verdünnt oder erhöht werden.
    2. Verwenden Sie das Beer-Lambert-Gesetz, um die Konzentration der Lösung zu berechnen.
      HINWEIS: Biergesetz: A = εcl, wobei:
      A: Absorption (in diesem Fall bei 260 nm, ab Schritt 1.3.1)
      ε: Extinktionskoeffizient. Für die hierin verwendete Sequenz ist 208.000 L mol-1 cm-1der Wert, der von einem OligoAnalyzer-Tool erhalten wird.
      l: Weglänge, 1 cm
      C: Konzentration der Probe
    3. Verwenden Sie diese Berechnungen, um die gewünschte RNA-Lösung für nachfolgende Experimente vorzubereiten. In der vorliegenden Studie wurden Lösungen mit [RNA] = 200 μM verwendet.

2. Hydrolyse von Oligonukleotiden der RNA durch Xrn-1

  1. Führen Sie eine 5'-Phosphorylierung der RNA durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Verwenden Sie ein 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen, um die folgende Lösung (50 μL Gesamtvolumen) vorzubereiten.
      1. Zugabe von RNase-freiemH2O(33,5 μL); Das Volumen kann je nach [RNA] variieren.
      2. Fügen Sie dann Lösung A hinzu (5 L, Tabelle 1).
      3. Fügen Sie eine wässrige Lösung von Adenosintriphosphat (ATP, siehe Materialtabelle) hinzu (6 l, 10 mM, 60 nmol).
      4. Wässrige RNA-Lösung (1 μL, 200 μM, 200 pmol) hinzufügen.
      5. Polynukleotidkinase (PNK-Enzym, siehe Materialtabelle) (4,5 l, 45 Einheiten) zugeben. Vorsichtig mischen, indem Sie die Mischung nach oben und unten pipettieren (10x).
    2. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 45 Minuten, indem Sie es in ein Wasserbad geben.
    3. Inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie das Reaktionsrohr in einen vorgewärmten Wärmeblock (65 °C) geben und die Lösung für 10 min inkubieren.
    4. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen (die RNA-Phosphorylierung wurde mittels MALDI-TOF-Analyse charakterisiert, siehe Repräsentative Ergebnisse), um eine endgültige 5'-phosphorylierte RNA-Lösung (4 μM, 50 μL) zu erhalten.
  2. Führen Sie eine RNA-Hydrolyse mit Xrn-1 durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Führen Sie mit der Lösung (50 μL) aus Schritt 2.1.4 die folgenden Schritte aus.
      1. Fügen Sie Lösung B hinzu (5 L, Tabelle 1).
      2. Eine Lösung von Xrn-1 (0,5 l, 1 ng, 30 fmol) wird zugegeben. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren (10x).
      3. Inkubieren Sie das Reaktionsrohr bei Raumtemperatur für 2 h.
    2. Das Reaktionsgemisch (Schritt 2.2.1.3) wird in eine porengroße 10-kDa-Zentrifugalvorrichtung (siehe Materialtabelle) überführt und die Enzyme durch Zentrifugieren (700 x g für 10 min bei Raumtemperatur) filtriert.
    3. Das Filtrat in ein 0,6 ml Zentrifugenröhrchen geben.
    4. Die Rest-RNA wird auf dem Zentrifugalröhrchen (Schritt 2.2.2.) unter Zugabe von RNase-freiemH2O(20 L) gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation (700 x g für 10 min bei Raumtemperatur).
    5. Das Filtrat wird mit dem Filtrat aus Schritt 2.2.3 kombiniert.
    6. Lagern Sie das Röhrchen mit der resultierenden Lösung in einem Gefrierschrank (0 °C) oder versenden Sie es zur Analyse.

3. Entsalzung von RNA-Lösung, MALDI-TOF-Plattenflecken

  1. Entsalzen und konzentrieren Sie die Probe mit handelsüblichen C18-Pipettenspitzen des Kationenaustauschs (siehe Materialtabelle).
    1. Positionieren Sie eine 10-Liter-C18-Pipettenspitze (Pipettenspitze, die mit einem Bett aus C18-Chromatographiemedien beladen ist, das an ihrem Ende befestigt ist) auf einer 10-μL-Pipette und fahren Sie dann mit Folgendem fort:
      1. Waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit 50% wässriger Acetonitrillösung (10 μL). Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.
      2. Die C18-Spitze zweimal mit einer wässrigen Trifluoressigsäurelösung (0,1% TFA, 10 μL) ausgleichen. Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.
      3. Entfernen Sie die C18-Spitze manuell aus der Pipette und befestigen Sie sie auf einer 200-μL-Pipette, die eine P200-Pipettenspitze enthält (die C18-Spitze wird nun an der P200-Pipettenspitze befestigt).
      4. Tauchen Sie die C18-Spitze in die Lösung ein (Schritt 2.2.6) und geben Sie die Lösung zehnmal über die C18-Spitze ab.
        HINWEIS: Die RNA-Probe wird an das Kationenaustauscherharz in der Spitze gebunden.
      5. Lösen Sie die C18-Spitze von der P200-Pipette und positionieren Sie sie auf einer 10-μL-Pipette.
      6. Waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit einer wässrigen Lösung von 0,1% TFA (10 μL). Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.
      7. Waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit RNasefreiem Wasser (10 μL). Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.
  2. Platzieren Sie die MALDI-Platte, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Das RNA-Oligonukleotid wird aus der C18-Spitze eluiert (Schritt 3.1.1.7), indem die Probe in die gewünschte Matrix (10 μL, 1:1-Lösung von C und D, Tabelle 1) eingetaucht wird, gefolgt von der Abgabe der Lösung zurück in die Tube. Wiederholen Sie diesen Vorgang zehnmal.
    2. Die Lösung aus 3.2.1 wird auf zwei getrennte Stellen auf der Platte pipettiert (je 1 μl, 20 pmol). Lassen Sie die Spots an der Luft trocknen (Abbildung 1A und Video 1).
      HINWEIS: Dieser Vorgang kann an derselben Stelle wiederholt werden, um die Probenkonzentration an jeder Stelle zu erhöhen.
    3. Pipettenwunschkalibrant (1 L) an zwei getrennten Stellen physikalisch in der Nähe des Probenortes und an der Luft trocknen lassen.
      ANMERKUNG: Der in der vorliegenden Studie verwendete Prüfstandard stammt aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle).
    4. Überlagern Sie das [vollständig getrocknete] Kalibrant mit der gewünschten Matrix (1 L). An der Luft trocknen lassen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Position zu verfolgen, an der die Proben und Kalibranten vor dem Einsetzen in das Instrument entdeckt werden. Notieren Sie sich dies mit dem Plattenkoordinatensystem, z. B. befindet sich Probe 1 an Position (C,3)

4. Datenerhebung und -verarbeitung

HINWEIS: Im Allgemeinen benötigt THAP eine höhere Laserleistung, um eine Ionisation zu erreichen. Darüber hinaus können Oligos ohne Fragmentierung schwer ionisierbar sein. Daher ist es in der Regel notwendig, eine möglichst geringe Laserleistung zu verwenden und die Detektorgewinne und/oder die Laserfrequenz zu erhöhen, um die Erkennung zu maximieren und die Fragmentierung zu minimieren.

  1. Führen Sie die Datenerfassung mit den folgenden Schritten durch.
    HINWEIS: Molekulargewichtsmessungen wurden mit einem Massenspektrometer durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien) im positiven Ionenmodus, linearer Modus mit einer Ionenquellenspannung von 20 kV, einer Detektorverstärkung von ~2,8 kV und einer Laserfrequenz von 20 Hz. Die Scanbereiche wurden basierend auf den erwarteten Molekulargewichten festgelegt. Diese wurden berechnet und als Masse über Ladung (m/z) ausgedrückt, wobei die Ladung 1 war. Die externe Kalibrierung erfolgte unter Verwendung einer Proteinkalibrierungsmischung (Bacterial Test Standard, siehe Tabelle der Materialien) an einer Stelle neben der Stichprobe. Die Rohdaten wurden dann in der Software flexAnalysis verarbeitet (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Öffnen Sie "Flexcontrol-Software" für die Bedienung. Drücken Sie die grüne Ein- /Aus-Taste des Instruments, warten Sie, bis sich die Zielstufe bewegt hat, und saugen Sie ab, um die Entlüftung zu entlüften. Öffnen Sie den Deckel, legen Sie die vollständig getrocknete Zielplatte in das Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung in der richtigen Ausrichtung erfolgt (Abbildung 1B).
    2. Senken Sie den Deckel vorsichtig ab und drücken Sie dann die grüne Ein-/Aus-Taste . Warten Sie, bis die Platte eingefahren und das Instrument wieder abgepumpt ist. Sobald die Statusleiste (untere rechte Ecke des Softwarefensters) "Bereit" anzeigt, fahren Sie mit der Kalibrierung fort.
    3. Um die Instrumente mit der Software zu kalibrieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Wählen Sie die gewünschte Methode aus, indem Sie auf die > Methode auswählen klicken oder die Schaltfläche Auswählen neben der geladenen Methode drücken. Klicken Sie auf die Koordinate für den kalibranten Punkt. Navigieren Sie zur Registerkarte Kalibrierung und vergewissern Sie sich, dass das richtige Kalibrant ausgewählt ist. Stellen Sie sicher, dass Random Walk deaktiviert ist (auf der Registerkarte Sample Carrier ).
      2. Drücken Sie Start und richten Sie den Laser manuell entlang eines Kristalls (Klicken Sie mit dem Mauspfeil an die gewünschte Stelle in der Kameraansicht). Stellen Sie bei Bedarf die Laserleistung ein. Sobald Sie mit den Einstellungen zufrieden sind, drücken Sie Start , um Spektren zu sammeln und sie dem Summenpuffer hinzuzufügen.
      3. Fügen Sie der Summe Spektren hinzu, bis eine ausreichende Intensität erreicht ist. Umschalten, um nur den Summenpuffer anzuzeigen, subtrahieren Sie die Baseline, und glätten Sie sie. Klicken Sie dann auf Automatische Zuweisung. Überprüfen Sie jeden zugewiesenen Peak und notieren Sie sich den ppm-Fehler. Wenn Sie mit Zuordnungen und Fehlern zufrieden sind, klicken Sie auf Übernehmen.
      4. Löschen Sie den Summenpuffer, und navigieren Sie zur Position der ersten Probe.
      5. Bestätigen Sie den gewünschten Scanbereich (Registerkarte 'Erkennung'). Passen Sie die Balken im "Massenbereich" so an, dass der grüne Bereich repräsentativ für die erwartete(n) Masse(n) ist.
      6. Klicken Sie direkt auf das Vergrößerungsfenster , so dass das Fadenkreuz auf das gewünschte kristallisierte Fragment ausgerichtet ist (größere Kristalle liefern oft die besten Ergebnisse, Abbildung 2).
      7. Sammeln Sie ein paar Spektren entlang der großen Kristalle und passen Sie die Laserleistung nach Bedarf an. Die richtige Einstellung liegt 5% -10% über der Leistung, bei der Spitzen auftreten.
    4. Gehen Sie wie folgt vor, um Spektren zu erhalten.
      1. Klicken Sie auf Start , um den Laserblitz zusammen mit zunehmender spektraler Intensität zu beobachten (siehe Fenster oben rechts). Bewegen Sie den Laser entlang der Länge des Kristalls, indem Sie mit dem Mauspfeil auf und ab des Kristalls klicken (Video 2).
      2. Klicken Sie direkt unter Start auf Hinzufügen.
      3. Wiederholen Sie dies mehrmals, bis die gewünschte Intensität/Anzahl der Aufnahmen erreicht ist (reflektiert auf der y-Achse des Spektralfensters)
      4. Stellen Sie die Laserleistung und/oder -geschwindigkeit und/oder die Detektorgewinne ein, wenn die ersten Scans nicht zufriedenstellend sind. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.4.1-4.1.4.3 nach Bedarf.
      5. Wenn Sie mit dem Spektrum zufrieden sind, klicken Sie auf Speichern unter, um das Spektrum unter einem angegebenen Namen zu speichern. Wenn dann andere Beispiele benötigt werden, klicken Sie auf Summe löschen und wiederholen Sie die Schritte unter Schritt 4.1.4.
  2. Datenverarbeitung durchführen.
    HINWEIS: Schritt 4.2 beschreibt eine Möglichkeit, die Daten mit der Software flexAnalysis zu analysieren.
    1. Öffnen Sie die gewünschte Software. Öffnen Sie dann Spektrum (a), indem Sie Datei auswählen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Öffnen aus.
    2. Es wird ein neues Fenster angezeigt. Klicken Sie auf Durchsuchen , um die aus Schritt 4.1.4 gespeicherten Dateien zu finden. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die gewünschten Dateien und klicken Sie dann links auf Öffnen . Wenn nur ein einzelnes Spektrum analysiert werden muss, ziehen Sie die Datei einfach per Drag & Drop in das Softwarefenster.
    3. Markieren Sie die geladene(n) Datei(en) für die Massenanalyse. Navigieren Sie auf der Symbolleiste zur Registerkarte Prozess . Wählen Sie in der Dropdownliste die Option Basislinie des Massenspektrums subtrahieren aus.
      HINWEIS: Der für die Subtraktion verwendete Algorithmus wird durch die in Schritt 4.1.3 ausgewählte Methode bestimmt.
    4. Navigieren Sie auf der Symbolleiste zur Registerkarte Prozess . Wählen Sie in der Dropdown-Liste Smooth Mass Spectrum aus.
      HINWEIS: Der für die Glättung verwendete Algorithmus wird durch die in Schritt 4.1.3 ausgewählte Methode bestimmt.
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte Massenliste . Wählen Sie in der Dropdownliste Suchen aus. Mit diesem Befehl werden Spitzen automatisch mit ihren Massen gekennzeichnet. Eine Liste der Massen wird auf dem Bildschirm auf der rechten Seite angezeigt.
    6. Um Spitzen hinzuzufügen oder zu löschen, fahren Sie mit der Registerkarte Massenliste fort. Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Bearbeiten.
    7. Bewegen Sie den Mauszeiger über die x-Achse des Spektrums; Eine vertikale Linie stellt die Position des Spektrums dar, an der sich der Cursor befindet.
      HINWEIS: Ein Symbol mit einem Diagramm und einem Cursor wird angezeigt, wenn durch Klicken eine neue Masse hinzugefügt werden kann. Dieses Symbol wird angezeigt, wenn Sie mit der Maus über Spitzen fahren, die durch Klicken gelöscht werden können (siehe Schritt 4.2.7 in der Zusatzdatei 1).
    8. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.3-4.1.7 für zusätzliche Spektren. Exportieren Sie die Massenliste für alle Spektren durch Klicken und Ziehen zur Hervorhebung der Dateien auf der linken Seite und führen Sie die folgende Menükaskade aus: Datei > Exportieren > Massenliste nach Excel.
    9. Um Spektren wie auf dem Bildschirm gezeigt zu exportieren, erstellen Sie entweder einen Screenshot oder exportieren Sie ihn als Bericht. Navigieren Sie für Letzteres zum Menü Bericht . Wählen Sie in der Dropdownliste Als PDF speichern aus.
      HINWEIS: Man kann die Darstellung der Spektren ändern, indem man die drei Registerkarten unter den Spektren verwendet und/oder die hervorgehobenen Dateien variiert. Ein Bildschirm wird angezeigt. Benennen Sie das PDF-Dokument wie gewünscht, passen Sie die Einstellungen / das Layout an und klicken Sie auf Speichern , um ein Bild des Spektrums zu erstellen.
    10. Das erzeugte Bild spiegelt die Spektralansicht im Softwareprogramm wider. Gehen Sie wie folgt vor, um die Ansicht zu bearbeiten.
      1. Vergrößern: Klicken Sie in der Symbolleiste auf die Schaltfläche Vergrößern.
      2. Bewegen Sie den Mauszeiger über die x-Achse und klicken Sie, bis der gewünschte Bereich erreicht ist.
      3. Verkleinern/Rückgängigmachen: Klicken Sie auf die Schaltfläche Verkleinern und klicken Sie auf eine beliebige Stelle im Spektrum, um zur Vollansicht zurückzukehren.
        HINWEIS: Eine anschauliche Hilfe für die Schritte 4.1 und 4.2 finden Sie in der Ergänzungsdatei 1 (S. S8-S23 bzw. S24-S30).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden vor der Verwendung synthetisiert, charakterisiert und quantifiziert. Die Konzentration aller Oligonukleotide wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie bei 90 °C bestimmt, um fehlerhafte Messwerte zu vermeiden, die sich aus der möglichen Bildung der Sekundärstrukturen ergeben. Abbildung 3 zeigt die Spektren der in dieser Arbeit verwendeten Modelloligonukleotide der RNA, die bei Raumtemperatur und nach Anwendung von Wärme aufgenommen wu...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die größte Herausforderung in diesem Arbeitsablauf bestand zwischen dem Abschluss der Experimente und der Durchführung der massenspektrometrischen Analysen. Die Experimente wurden an der University of Colorado Denver durchgeführt und abgeschlossen und (über Nacht) an die Einrichtungen der Colorado State University verschifft. Die Datenerfassung erfolgte nach Erhalt nach Bequemlichkeit. Mehrere unerwartete Umstände führten zu Zeitverzögerungen im Prozess. In einem Fall erforderten unerwartete Fehlfunktionen des Instrument...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Arbeit eine gemeinsame Anstrengung zwischen drei Institutionen, zwei Forschungsgruppen und einer Kerneinrichtung war. Die Verteilung und der Arbeitsaufwand wurden wie folgt durchgeführt: Die Proteinexpression (Xrn-1) wurde an der Universität von Denver (Denver, CO) durchgeführt. Oligonukleotidsynthese, Quantifizierung und Experimente (hauptsächlich enzymatischer Abbau) wurden an der University of Colorado Denver (Denver, CO) durchgeführt. Dort wurde auch eine Optimierung durchgeführt. MALDI-TOF-Spotting, Akquisition und Analyse wurden in der Analytical Resources Core Facility der Colorado State University durchgeführt. (Fort Collins, CO). SS möchte einen UROP Award (CU Denver) und Eureca Grants (CU Denver) für die Unterstützung anerkennen. E. G.C. bestätigt die Unterstützung von NIGMS über R00GM115757. MJER dankt der Unterstützung von NIGMS über 1R15GM132816. K.B. bestätigt die Ressourcen-ID: SCR_021758. Die Arbeit wurde auch durch einen Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, der Henry Dreyfus Foundation unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,6 mL MCT Graduiertes ViolettFisher Scientific05-408-127
6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat 98%Sigma Aldrich480-66-0
Acetonitril 99,9%, HPLC-QualitätFisher Scientific75-05-8
Adenosintriphosphat, 10 mMNew Englang BioscienceP0756S
Ammoniumcitrat, zweibasisch 98% Sigma Aldrich3012-65-5
Ammoniumfluorid 98,0 %, ACS-QualitätAlfa Aesar12125-01-8
Bruker BakterienteststandardBruker Daltonics8255343
Kommerzielle Quelle für Xrn-1New England BioLabsM0338S
Diethylpyrocarbonat, 97 %ACROS OrganicsA0368487
Flex-Analyse SoftwareBruker DaltonicsFlexAnalysis Software Version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-Vis-SpektralphotometerPerkin Elmer
MALDI Platte: MSP 96 geschliffenes StahltargetBruker Daltonics280799
MassenspektrometerBrukerMicroflex LRFTOF Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000Milipore SigmaA Mili-Q System wurde verwendet, um das gesamte in dieser Arbeit verwendete Wasser zu reinigen
Nanosep Zentrifugalgeräte mit OmegaTM Membran 10 K, blau (24/Packung)Pall CorporationOD010C33Filtermedien, Omega (modifiziertes Polyethersulfon) 10 K Porengröße
NEBuffer 3New England BiolabsB7003SDies ist Lösung B
Oligo Analyzer ToolIDT-DNAhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipettenspitzen P10Fisher Scientific02-707-441
Pipettenspitzen P200Fisher Scientific02-707-419
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
T4 PolynukleotidkinaseNew England BioLabsM0201S
T4 Polynukleotidkinase ReaktionspufferNeu England BioLabsB0201SDies ist die Lösung A
TrifluoressigsäureAlfa Aesar76-05-1
Xrn-1 ExoribonukleaseIm Haus exprimiertSiehe Ref. 20
ZipTip Pipettenspitzen für die ProbenvorbereitungMilliporeZTC 18S 09610 µ L-Pipettenspitzen mit einem C18-Standard 0,6 & Mikro; L-Bett

Referenzen

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73(2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516(2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521(2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

RNA Oxidation8 OxoguaninXrn 1 VerdauFestphasensyntheseUV Vis SpektroskopieC18 Chromatographie
Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.