Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Shawn W. Schowe; Conner J. Langeberg; Erich G. Chapman; Kitty Brown; Marino  J. E. Resendiz

doi:10.3791/63720

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Methodenartikel

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

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DOI:

10.3791/63720

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11. April 2022

Shawn W. Schowe¹ , Conner J. Langeberg² , Erich G. Chapman² , Kitty Brown³ , Marino J. E. Resendiz¹

¹Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, ²Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, ³Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.

Zusammenfassung

RNA ist ein Biopolymer, das in allen Bereichen des Lebens vorkommt, und seine Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und/oder reaktiven Spezies, z. B. DNA, Proteinen, Ionen, Medikamenten und freien Radikalen, sind allgegenwärtig. Infolgedessen durchläuft RNA verschiedene Reaktionen, einschließlich ihrer Spaltung, ihres Abbaus oder ihrer Modifikation, was zu biologisch relevanten Spezies mit unterschiedlichen Funktionen und Implikationen führt. Ein Beispiel ist die Oxidation von Guanin zu 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), die in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auftreten kann. Insgesamt sind Verfahren, die solche Produkte und Transformationen charakterisieren, für die wissenschaftliche Gemeinschaft weitgehend wertvoll. Zu diesem Zweck ist die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) eine weit verbreitete Methode. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie RNA-Fragmente, die nach enzymatischer Behandlung gebildet werden, charakterisiert werden können. Das gewählte Modell verwendet eine Reaktion zwischen RNA und der Exoribonuklease Xrn-1, bei der die enzymatische Verdauung an oxidierten Stellen gestoppt wird. Zwei 20-Nukleotid lange RNA-Sequenzen [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] wurden durch Festphasensynthese erhalten, quantifiziert durch UV-Vis-Spektroskopie und charakterisiert durch MALDI-TOF. Die erhaltenen Stränge wurden dann (1) 5'-phosphoryliert und mittels MALDI-TOF charakterisiert; (2) mit Xrn-1 behandelt; (3) gefiltert und entsalzt; (4) analysiert über MALDI-TOF. Dieser Versuchsaufbau führte zur eindeutigen Identifizierung der Fragmente, die mit dem Abwürgen von Xrn-1 verbunden sind: [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-_{H2 PO} ₄-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Die beschriebenen Experimente wurden mit 200 Picomolen RNA (20 pmol für MALDI-Analysen) durchgeführt; Geringere Mengen können jedoch zu nachweisbaren Spitzen mit Spektrometern führen, die Laserquellen mit mehr Leistung als die in dieser Arbeit verwendete verwenden. Wichtig ist, dass die beschriebene Methodik verallgemeinert und möglicherweise auf die Produktidentifizierung für andere Prozesse mit RNA und DNA ausgedehnt werden kann und bei der Charakterisierung / Aufklärung anderer biochemischer Signalwege helfen kann.

Einleitung

MALDI-TOF ^1,2,3 ist eine weit verbreitete Technik zur Charakterisierung und/oder Detektion von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften. Einige seiner Anwendungen umfassen verschiedene Anwendungen wie den Nachweis von Tanninen aus natürlichen Ressourcen⁴, die Bildgebung von Metaboliten in Lebensmitteln⁵, die Entdeckung oder Überwachung von zellulären Wirkstoffzielen oder Markern⁶ und die klinische Diagnostik⁷, um nur einige zu nennen. Von Relevanz für die vorliegende Arb....