Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

Zusammenfassung

Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.

Zusammenfassung

Der murine Schneidezahn ist ein Organ, das während der gesamten Lebensdauer der Maus kontinuierlich wächst. Die epithelialen und mesenchymalen Stammzellen, die sich im proximalen Gewebe der Schneidezähne befinden, führen zu Nachkommen, die sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Pulpa-Fibroblasten differenzieren. Diese Zellen sind entscheidend für die Unterstützung des anhaltenden Umsatzes von Schneidezähnengewebe, was den murinen Schneidezahn zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der Homöostase adulter Stammzellen macht. Es wird angenommen, dass Stammzellen langlebige ruhende Zellen enthalten, die durch Nukleotidanaloga wie 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) markiert werden können. Die Zellen behalten diese Markierung im Laufe der Zeit bei und werden dementsprechend als Markierungszellen (LRCs) bezeichnet. Ansätze zur Visualisierung von LRCs in vivo bieten ein robustes Werkzeug zur Überwachung der Stammzellhomöostase. In dieser Studie haben wir eine Methode zur Visualisierung und Analyse von LRCs beschrieben. Unser innovativer Ansatz umfasst LRCs in Mausschneidezähnen nach Gewebereinigung und EdU-Färbung mit ganzer Mount, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und einer 3-dimensionalen (3D) Rekonstruktion mit der Bildgebungssoftware. Diese Methode ermöglicht eine 3D-Bildgebung und eine unverzerrte Quantifizierung im Vergleich zur herkömmlichen LRC-Analyse auf Schnittobjektträgern.

Einleitung

Der kontinuierlich wachsende Schneidezahn der Maus ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung adulter Stammzellen¹. Die epithelialen (labiale und linguale zervikale Schleife) und mesenchymalen Stammzellen (zwischen der labialen und lingualen zervikalen Schleife), die sich auf der proximalen Seite des Schneidezahns befinden, differenzieren sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Zahnpulpazellen. Dieser einzigartige Prozess bietet eine Zellquelle zur Kompensation von Gewebeverlust und -umsatz². Obwohl mehrere Stammzellmarker wie Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 usw. in vivo für die Untergruppen adulter Stammzel....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für das Texas A&M University College of Dentistry genehmigt.

1. Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails

1. Bereiten Sie die Cocktailstocklösungen wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
2. Bereiten Sie den EdU-Etikettierungscocktail wie in Tabelle 1 beschrieben vor.

2. Vorbereitung der Mäuse und EdU-Lösung

1. Bereiten Sie die EdU-Lösung vor. EdU in DMSO mit 20 mg/ml auflösen und in einem Gefrierschrank von -20 °C lagern.
   ACHTUNG....

Ergebnisse

Nach der EdU-Markierung und dem PEGASOS-Gewebereinigungsprozess (Abbildung 2) wurde der transparente Unterkiefer erhalten, wie in unserem Bild gezeigt (Abbildung 3B). Wir verglichen die modifizierte Probe mit einem normalen Unterkiefer ohne Gewebereinigungsprozess (Abbildung 3A). Der transparente Unterkiefer (Abbildung 3B) mit EdU-Markierung wurde einer konfokalen Bildgebung unterzogen. Wir konzentriert.......

Diskussion

Mehrfachdosen von Injektionen (BrdU, EdU) werden normalerweise bei wachsenden neugeborenen Mäusen verwendet, um proliferierende Zellen so weit wie möglich zu markieren ^1,6,13. Die Chasing-Periode gilt als kritischer Schritt in Bezug auf die Erneuerungsrate von Geweben ^6,13. Der Schneidezahn der Maus erneuert sich etwa jeden Monat. Diese Eigenschaft ermöglicht es Forscher.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 & mal; Objektiv/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Zentrifugenröhrchen	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Nadel	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND Kavitätenobjektträger	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratory Strain	#:000664
Umwälzpumpe	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Bildgebungssystem	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereomikroskop	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Natriumascorbat	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanin 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Konfokalmikroskop	Leica
tert-Butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100