Innere Empfindlichkeit der mitochondrialen Membran gegenüber Na+ zeigt teilweise segmentierte funktionelle CoQ-Pools

Pablo Hernansanz-Agustín; José Antonio Enríquez

doi:10.3791/63729

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Innere Empfindlichkeit der mitochondrialen Membran gegenüber Na+ zeigt teilweise segmentierte funktionelle ^CoQ-Pools

1.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63729

⸱

20. Juli 2022

Pablo Hernansanz-Agustín¹ , José Antonio Enríquez¹^,²

¹Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, ²Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen vergleichenden Assay, der mitochondriale komplexe Aktivitäten CI+CIII und CII+CIII in Gegenwart oder Abwesenheit von Na⁺ verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu untersuchen.

Zusammenfassung

Ubichinon (CoQ) -Pools in der inneren mitochondrialen Membran (IMM) sind teilweise zu komplexen I- oder FAD-abhängigen Enzymen segmentiert. Eine solche Unterteilung kann leicht durch einen vergleichenden Assay mit NADH oder Succinat als Elektronendonatoren in gefroren-aufgetauten Mitochondrien beurteilt werden, in denen die Reduktion von Cytochrom c (Cyt c) gemessen wird. Der Assay stützt sich auf die Wirkung von Na⁺ auf das IMM und verringert seine Fließfähigkeit. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der NADH-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivität und der Succinat-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivitäten in Gegenwart von NaCl oder KCl vor. Die Reaktionen, die schrittweise auf die Mischung von Reagenzien in einer Küvette angewiesen sind, werden spektralphotometrisch während 4 min in Gegenwart von Na+ oder K⁺ gemessen. Die gleiche Mischung wird parallel in Gegenwart der spezifischen Enzyminhibitoren durchgeführt, um die unspezifische Absorptionsänderung abzuziehen. Die Aktivität der NADH-cyt-c-Oxidoreduktase nimmt in Gegenwart eines dieser Kationen nicht ab. Die Aktivität der Succinat-c-Oxidoreduktase nimmt jedoch in Gegenwart von NaCl ab. Dieses einfache Experiment hebt hervor: 1) die Wirkung von Na ⁺ bei der Verringerung der IMM-Fließfähigkeit und des CoQ-Transfers; 2) dass der Superkomplex I+III 2 den Ubichinon-Transfer (CoQ) davor schützt_, durch eine Verringerung der IMM-Fließfähigkeit beeinträchtigt zu werden; 3) dass sich die CoQ-Übertragung zwischen CI und CIII funktionell von der CoQ-Übertragung zwischen CII und CIII unterscheidet. Diese Tatsachen unterstützen die Existenz funktional differenzierter CoQ-Pools im IMM und zeigen, dass diese durch die sich verändernde Na^+-Umgebung der Mitochondrien reguliert werden können.

Einleitung

Das mitochondriale oxidative Phosphorylierungssystem (OXPHOS) ist der Hauptweg, der die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP), die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den Verbrauch von reduzierenden Äquivalenten wie Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) oder Succinat durch Mitochondrien antreibt. Das OXPHOS-System besteht aus fünf Proteinkomplexen: Komplex I (CI) oxidiert NADH und reduziert CoQ in Ubiquinol (CoQH₂). Komplex II (CII) oxidiert Succinat zu Fumarat und reduziert CoQ in CoQH₂. Komplex III (CIII) oxidiert_{CoQH 2} wieder zu CoQ und reduziert Cytochrom c (Cyt c). Schließlich oxidiert Komplex IV (CIV) Cyt c und re....