Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Abstract

Für die direkte Visualisierung von zytoskelettalen Filamenten und ihren assoziierten Proteinen wurden mehrere Techniken eingesetzt. Die TIRF-Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie hat ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis, leidet jedoch unter Photobleichen und Photoschäden der fluoreszierenden Proteine. Markierungsfreie Techniken wie die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) und die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT) umgehen das Problem der Photobleiche, können aber einzelne Moleküle nicht ohne weiteres visualisieren. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Kombination von IRM mit einem kommerziellen TIRF-Mikroskop für die gleichzeitige Bildgebung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) und dynamischen Mikrotubuli in vitro vor. Dieses Protokoll ermöglicht die Hochgeschwindigkeitsbeobachtung von MAPs, die mit dynamischen Mikrotubuli interagieren. Dies verbessert bestehende zweifarbige TIRF-Setups, da sowohl die Mikrotubuli-Markierung als auch die Notwendigkeit mehrerer zusätzlicher optischer Komponenten, wie z. B. eines zweiten Anregungslasers, entfallen. Beide Kanäle werden auf demselben Kamerachip abgebildet, um Bildregistrierungs- und Bildsynchronisationsprobleme zu vermeiden. Dieser Aufbau wird durch die Visualisierung einzelner Kinesinmoleküle demonstriert, die auf dynamischen Mikrotubuli laufen.

Introduction

Die TIRF-Mikroskopie (Total-Internal-Reflection-Fluorescence) wird häufig zur Visualisierung einzelner fluoreszierender Moleküle eingesetzt. Im Vergleich zur Epifluoreszenzbildgebung erreicht TIRF eine überlegene Hintergrundausblendung, die eine hochauflösende Lokalisierung und Verfolgung einzelner Fluorophore ermöglicht. Aus diesem Grund ist TIRF die bevorzugte Methode zur Visualisierung fluoreszenzmarkierter Mikrotubuli-assoziierter Proteine und wird häufig zur Abbildung von Mikrotubuli ^1,2 verwendet.

Um die Regulation der Mikrotubulidynamik durch MAPs zu untersuchen, ist es oft notwendig, sowohl Mikrotubuli als auch MAPs gleichzeitig abzubilden. Die meisten bestehenden Methoden für diesen Zweck sind teuer oder leiden unter technischen Nachteilen. Simultane Zweifarben-TIRF benötigt beispielsweise zwei Anregungslaser und zwei Kameras. Zusätzlich zu den hohen Kosten wirft die Notwendigkeit separater Kameras Probleme bei der Bildsynchronisation und Bildregistrierung auf. Diese Notwendigkeit kann umgangen werden, wenn ein rotierender Filterwürfel verwendet wird, um physisch zwischen Anregungslasern in aufeinanderfolgenden Bildern zu wechseln³. In einem solchen Setup kann ein einzelner Kamerachip verwendet werden, und die Rahmen wechseln zwischen Bildern von Mikrotubuli und MAPs. Diese Technik ist jedoch durch die Geschwindigkeit des Filterwechsels begrenzt, die die Bildrate typischerweise auf weniger als 0,5 Bilder pro Sekunde³ (fps) beschränkt. Eine solche Bildrate reicht nicht aus, um schnelle dynamische Prozesse aufzulösen, wie z.B. die Schrumpfung eines Mikrotubuli mit einer Geschwindigkeit von bis zu 500 nm/s, das Gehen eines Kinesins mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung von 800 nm/s oder die Diffusion eines MAP mit Diffusionskoeffizienten von mehr als 0,3 μm²/s⁴. Dies ist besonders problematisch, wenn die relativen Positionen von zwei sich bewegenden Zielen in jedem Kanal verfolgt werden, z. B. die Position eines MAP relativ zur Position einer sich bewegenden Mikrotubulispitze⁵.

Zusätzlich zu diesen optischen Einschränkungen erfordert die Zwei-Farben-TIRF-Mikroskopie, dass MAPs und Mikrotubuli mit verschiedenen Fluorophoren markiert werden, deren Emissionsspektren ausreichend getrennt sind. Die fluoreszierende Markierung von Tubulin kann die Mikrotubulidynamik^{verändern 6}, und das Photobleichen von Fluorophoren begrenzt die Bildgebungsgeschwindigkeit⁷. Aufgrund dieser Probleme wurden markierungsfreie Bildgebungstechniken entwickelt, um Mikrotubuli sichtbar zu machen. Dazu gehören die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT) ^8,9, die rotierend-kohärente Streumikroskopie (ROCS)10, die räumliche Lichtinterferenzmikroskopie (SLIM)11 und die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) ^12,13. Diese Techniken ermöglichen eine schnelle markierungsfreie Bildgebung von Mikrotubuli ohne die Nachteile der Fluoreszenzbildgebung, aber sie können nicht zur Visualisierung einzelner MAPs verwendet werden.

Von diesen labelfreien Techniken zeichnet sich IRM durch seine niedrigen Kosten und seine bescheidenen Anforderungen an die Instrumentierung aus. Wir haben kürzlich ein Protokoll zur Kombination von IRM mit einem kommerziellen TIRF-Mikroskop vorgestellt, mit dem Mikroskope und fluoreszierende MAPs in abwechselnden Frames ^3,13 abgebildet werden^können. In diesem Dokument wird ein Protokoll zum Ändern dieses Setups vorgestellt, um gleichzeitig TIRF- und IRM-Bilder auf einem einzigen Kamerachip zu erfassen. Dabei wird ein kostengünstiger Strahlteiler in den Anregungspfad aufgenommen, um die Probe gleichzeitig mit einem TIRF-Laser und einer IRM-LED-Lichtquelle zu beleuchten. Ein modifizierter kommerzieller Bildsplitter wird verwendet, um die TIRF- und IRM-Signale spektral zu trennen und auf separate Hälften desselben Kamerachips zu projizieren. Wir verwenden auch ein mikrofluidisches System, das den schnellen Austausch von Reagenzien während der Bildgebung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt, wie dieses Setup verwendet werden kann, um dynamische Mikrotubuli und MAPs abzubilden. Die Leistungsfähigkeit der Apparatur wird durch die Präsentation der ersten Visualisierung von Kinesin-1-Proteinen demonstriert, die auf schrumpfenden Mikrotubuli laufen, die mit einer Bildrate von 10 ^s-1 erfasst werden.

Protocol

1. Vorbereitung von Durchflusskammern

HINWEIS: Mikrofluidische Durchflusskammern werden durch Anhaften von Polydimethylsiloxan (PDMS) -Mikrokanälen an ein gereinigtes und funktionalisiertes Deckglas hergestellt. Die Mikrokanäle werden in einer Masterform gegossen.

1. Vorbereitung von PDMS-Kanälen
   1. Bereiten Sie gereinigte und/oder funktionalisierte Deckgläser mit Oberflächenchemie vor, die für den spezifischen abgebildeten Assay geeignet ist.
      HINWEIS: Für Kinesin-Motilitätsassays werden piranha-gereinigte silanisierte Deckgläser verwendet. Diese werden wie in Gell et beschrieben vorbereitet. ^al.1 Alternativ ist es einfacher, Deckgläser in Isopropanol zu beschallen, gefolgt von Methanol für 3x 20 min Zyklen.
   2. Um eine Masterform vorzubereiten, schneiden Sie Streifen aus einseitigem stationärem Band auf die gewünschte Strömungskanalgröße. Kleben Sie die Streifen auf den Boden einer 10 cm großen Petrischale und ordnen Sie sie Seite an Seite mit mindestens 1 cm Abstand zwischen den Streifen an.
      HINWEIS: Wenn genaue Kanalabmessungen erforderlich sind, kann die Form auf Siliziumwafern mittels Photolithographie¹⁴ hergestellt werden.
   3. Um das PDMS-Polymer herzustellen, kombinieren Sie das Härter und das Basiselastomer in einem Massenverhältnis von 1:10. 2 min mixen.
      HINWEIS: Dieses Mischungsverhältnis kann variiert werden, um die Steifigkeit des Polymers abzustimmen. Ein höheres Verhältnis von Base zu Härter führt zu einem weicheren Polymer.
   4. Entgasen Sie das Gemisch in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen verschwinden.
   5. Gießen Sie die Mischung in einer ~ 0,5 cm dicken Schicht auf die Master-Form und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
   6. Die Mischung im vorgeheizten Backofen bei 70 °C 40 min backen.
      HINWEIS: Eine längere Aushärtungszeit kann erforderlich sein, wenn der PDMS-Block dick ist (>1 cm). Heizen Sie in 5-Minuten-Schritten weiter, bis es vollständig ausgehärtet ist.
   7. Schneiden Sie die strukturierten Bereiche des Polymers aus. Stanzen Sie Löcher an jedem Ende des Kanals mit einem PDMS-Puncher.
      HINWEIS: In diesem Protokoll ist der Lochdurchmesser auf 0,75 mm eingestellt und kann entsprechend den erforderlichen Durchflussraten eingestellt werden. PDMS-Kanäle können über einen längeren Zeitraum in trockenen Umgebungen gelagert werden, sollten jedoch vor der Verwendung gereinigt werden.
   8. Bereinigen Sie die strukturierte Seite des PDMS-Blocks. Verwenden Sie stationäres Band, um große Partikel zu entfernen. Mit Isopropanol und dann mit Methanol abspülen. Wiederholen Sie diese Spülungen 3x, spülen Sie sie mit Reinstwasser ab und föhnen Sie die Oberfläche.
   9. Plasmareinigen Sie das PDMS mit Sauerstoff oder Luftplasma.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird 18 W Luftplasma verwendet.
   10. Das plasmagereinigte PDMS auf ein entsprechend gereinigtes Deckglas legen und 15 min bei 80 °C auf einer Kochplatte erhitzen.
       HINWEIS: Epoxidharz kann auf die Seiten des PDMS-Blocks aufgetragen werden, um ihn besser am Deckglas zu haften.
   11. Führen Sie entsprechend dimensionierte Schlauch aus Polyethylen niedriger Dichte (LDPE) in die Löcher ein. Schließen Sie den Auslassschlauch an eine 0,5-ml-Spritze an.
       HINWEIS: In diesem Protokoll werden Rohre mit einem Innendurchmesser von 0,023 Zoll über einen Metalladapter mit einem Außendurchmesser von 0,025 an das PDMS angeschlossen.
   12. Lassen Sie Lösungen in die Mikrokanäle fließen, indem Sie das Einlassrohr in die Lösung eintauchen und das erforderliche Volumen mit der Spritze ziehen.

2. Optischer Aufbau

1. Modifikation des Mikroskops (Abbildung 1)
   1. Ändern Sie ein TIRF-Mikroskop, um die IRM-Bildgebung^{zu aktivieren 13}. Ersetzen Sie den im Filterrad des Mikroskops verwendeten Strahlteiler 50/50 (Reflexion (R)/Transmission (T)) durch einen 10/90 (R/T) Strahlteiler.
   2. Setzen Sie einen Bildteiler zwischen die Kamera und das Mikroskop ein.
   3. Setzen Sie in den Filterwürfel des Bildteilers einen 10/90 (R/T) Strahlteiler ein. Platzieren Sie einen 600 nm langen Passfilter vor dem reflektierten Strahl und einen geeigneten Fluoreszenzemissionsfilter vor dem durchgelassenen Strahl.
      HINWEIS: Strahlteiler mit unterschiedlichen R / T-Verhältnissen können verwendet werden, um die Fraktionen des IRM- und TIRF-Emissionslichts, die gesammelt werden, abzustimmen.
   4. Richten Sie den Bildteiler gemäß den Herstellerangaben aus, um die TIRF- und IRM-Signale auf dem Kamerachip räumlich zu trennen.
      HINWEIS: Eine räumliche Trennung der Signale ist erforderlich, da das TIRF-Signal typischer Fluorophore viel schwächer ist als das IRM-Signal eines Mikrotubuli und nicht nachweisbar wäre, wenn die beiden Signale überlagert würden.

3. Abbildung dynamischer Mikrotubuli und einzelner Kinesin-Moleküle

1. Oberflächenfunktionalisierung und Passivierung
   1. Gießen Sie den BRB80-Puffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, titriert auf pH 7,8 mit NaOH) in die Reaktionskammer.
   2. Antibiotinlösung in BRB80 auf 0,025 mg/ml verdünnt und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
   3. Waschen Sie den Kanal mit BRB80.
   4. Fließen Sie in F-127-Lösung (1% Pluronic F-127 (w/v) gelöst in BRB80 über Nacht) und inkubieren Sie für mindestens 20 min zur Oberflächenpassivierung.
      HINWEIS: Wenn leicht zu reinigende Deckgläser anstelle von silanisierten Deckgläsern verwendet werden, passivieren Sie mit 2 mg / ml Kasein in BRB80 für > 20 min bei Raumtemperatur.
   5. Waschen Sie den Kanal mit BRB80.
2. Vorbereitung für die Bildgebung
   1. Wenn eine Temperaturregelung erforderlich ist, verwenden Sie eine Objektivheizung und stellen Sie sie auf die richtige Temperatur ein.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden alle Experimente bei 28 °C durchgeführt.
   2. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und schalten Sie die Epibeleuchtungslichtquelle (>600 nm) für die IRM-Bildgebung ein.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird eine weiße LED-Lichtquelle mit einem 600-nm-Longpassfilter verwendet.
   3. Fokussieren Sie das Mikroskop auf die Probenoberfläche. Suchen Sie nach der richtigen Brennebene in der Nähe der PDMS-Lösungsschnittstelle.
      HINWEIS: In IRM sollte das wässrige Innere des Kanals viel heller erscheinen als das PDMS-Polymer.
   4. Wählen Sie ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Kanals aus.
   5. Es wird eine Lösung von 0,1 μm fluoreszierenden Mikrokügelchen in BRB80 hergestellt (Dichte: 10⁹ Perlen/ml, entsprechend einer 200-fachen Verdünnung für die in diesem Protokoll verwendeten Perlen).
   6. Fließen Sie in mindestens einem Kanalvolumen der Mikroperlenlösung.
   7. Überwachen Sie die Reaktion über IRM. Warten Sie, bis die Mikrokügelchen allmählich auf der Oberfläche "landen". Wenn die gewünschte Dichte der Mikrokügelchen erreicht ist, waschen Sie den Überschuss mit BRB80 aus.
3. Züchtung von biotinylierten Guanyl 5'-α,β-methylendiphosphonat (GMPCPP)-stabilisierten Mikrotubuli-Samen
   1. In einem 0,6 ml Zentrifugenröhrchen werden 50 μL einer Lösung hergestellt, die 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl 2 und₂ μM biotinyliertes Tubulin (5-10% Markierungsstöchiometrie) in BRB80 enthält.
      HINWEIS: Die korrekte Markierungsstöchiometrie kann durch die Kombination von biotinyliertem Tubulin mit hoher Dichte mit unmarkiertem Rindertubuliin im richtigen Verhältnis erreicht werden.
   2. Die Lösung 5 min auf Eis inkubieren und dann 12,5 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Länge der Samen kann durch Abstimmung der Polymerisationszeit gesteuert werden.
   3. Stoppen Sie die Polymerisation durch Zugabe von 100 μL Raumtemperatur BRB80.
   4. Drehen Sie die Lösung in einer Ultrazentrifuge bei Raumtemperatur (126.000 x g, 5 min) aus. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie eine Pipette verwenden, um unpolymerisiertes Tubulin zu entfernen.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird eine luftbetriebene Ultrazentrifuge verwendet.
   5. 200 μL Raumtemperatur BRB80 in das Pellet geben. Suspendiert das Pellet durch sanftes, aber gründliches Pipettieren. Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette mit einer Schnittspitze, um die Scherung der Mikrotubuli zu reduzieren.
4. Wachsende dynamische Guanosindiphosphat (GDP)-Tubulin-"Erweiterungen"
   HINWEIS: Die Samen werden auf der Antibiotin-Oberfläche des Strömungskanals immobilisiert. Dynamische GTP/GDP-"Erweiterungen" werden aus den Enden der immobilisierten Samen gezüchtet.
   1. Verdünnen Sie die Samen 20x in BRB80. Gießen Sie die verdünnten Samen in die Reaktionskammer.
   2. Überwachen Sie die Reaktion über IRM. Warten Sie, bis die Samen allmählich auf der Oberfläche "landen" und sich an sie binden. Wenn die gewünschte Dichte der Samen erreicht ist, waschen Sie den Überschuss mit BRB80 aus.
   3. Bereiten Sie eine Mikrotubuli-Verlängerungsmischung vor: 12 μM unmarkiertes Tubulin, 1 mM GTP, 5 mM Dithiothreitol (DTT) im BRB80-Puffer.
   4. Fließen Sie in mindestens einem Kanalvolumen der Verlängerungsmischung. Stellen Sie sicher, dass die Reaktionstemperatur 28 °C beträgt.
   5. Warten Sie, bis die Mikrotubuli-Erweiterungen im Laufe der Zeit aus den Samen wachsen.
      HINWEIS: Die stationäre Länge wird normalerweise in weniger als 20 min erreicht.
   6. Verwenden Sie die dynamischen Mikrotubuli für die Bildgebung. Fügen Sie fluoreszierende MAPs auf den Mikrotubuli hinzu und visualisieren Sie sie, wie in Schritt 3.5 für Kinesin-1 beschrieben.
      HINWEIS: Da die Mikrotubuli oberflächengebunden sind, sind sie für TIRF leicht sichtbar.
5. Kinesin-Motilitäts-Assay
   HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung von mit beweglichem grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiertem Kinesin-1 auf schrumpfenden Mikrotubuli. Ein abgeschnittenes Rattenkinesin-1-Konstrukt, das mit eGFP verschmolzen ist (rKin430-eGFP), wurde exprimiert und gereinigt, wie zuvor^{beschrieben 15,16}.
   1. Bereiten Sie den Motilitätspuffer vor: 1 mM ATP und 0,2 mg/ml Casein in BRB80.
   2. Verdünnen Sie Kinesin-eGFP im Motilitätspuffer auf 10 nM.
   3. Bereiten Sie eine 2-fache Sauerstofffängerlösung vor, um oxidativem Photobleichen entgegenzuwirken (80 mM Glukose, 80 mg/ml Glukoseoxidase, 32 mg/ml Katalase, 0,2 mg/ml Casein, 20 mM DTT), ergänzt mit 2 mM ATP.
   4. Kombinieren Sie 10 Teile Sauerstofffänger, 9 Teile BRB80 und 1 Teil 10 nM Kinesin-eGFP für eine endgültige Kinesinkonzentration von 0,5 nM.
      HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte mindestens 1,5-mal größer sein als das Kanalvolumen.
   5. Stellen Sie die Bildgebungseinstellungen in der Mikroskopsoftware ein.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden Videos mit 10 fps mit 100 ms Belichtungszeit aufgenommen. Die Laserintensität beträgt ~0,05 kW/cm².
   6. Beginnen Sie mit der Bildgebung und lassen Sie die Kinesin-Lösung in die Kammer fließen.
   7. Nehmen Sie nach Abschluss der Messung ein kurzes (~ 5 s) Video auf, in dem die Stufe langsam in einer kreisförmigen oder lateralen Bewegung gedreht wird. Verwenden Sie die Medianprojektion dieses Videos als Hintergrundbild und subtrahieren Sie es von den Rohmessungen.

4. Bildverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Die Bildverarbeitung wurde mit NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/) durchgeführt. Ein Makro wurde entwickelt, um die Aufteilung und Ausrichtung der TIRF- und IRM-Kanäle zu automatisieren. Für dieses Makro muss das GaussFit_OnSpot-Plugin installiert sein (verfügbar im ImageJ-Plugins-Repository).

1. Erstellen Sie aus der Hintergrundaufnahme eine mittlere Projektion in ImageJ, indem Sie auf Image | klicken Stapel | Z-Projekt.
2. Subtrahieren Sie die mittlere Hintergrundprojektion von den Rohbilddaten, indem Sie auf Process | klicken Bildrechner.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Option "32-Bit-Ergebnis (float)" aktivieren.
3. Wählen Sie für die Bildregistrierung eine Sammlung von Mikrokügelchen in der Nähe des interessierenden Mikrotubuli aus und verwenden Sie sie, um die TIRF- und IRM-Bilder auszurichten.
4. Verwenden Sie für jede Perle in dieser Sammlung das Mehrpunktauswahlwerkzeug , um die ungefähre Position im TIRF-Kanal und dann die entsprechende Position im IRM-Kanal zu markieren.
   HINWEIS: Wenn es beispielsweise zwei Perlen (1 und 2) gibt, hätte die Multipoint-Auswahl vier Punkte in der folgenden Reihenfolge: (1) Perle 1 in TIRF, (2) Perle 1 in IRM, (3) Perle 2 in TIRF, (4) Perle 2 in IRM.
5. Führen Sie das bereitgestellte ImageJ-Makro (ImageSplitterRegistration.ijm) aus.
   HINWEIS: Dadurch werden die folgenden Schritte automatisiert: i) Schätzung der mittleren Position jeder Perle durch Anpassung an einen Gauß-Wert; ii) für jede Perle Berechnung des Verschiebungsvektors, der das Zentrum im TIRF-Kanal vom Zentrum im IRM-Kanal trennt; iii) Mittelung dieses Verdrängungsvektors über alle Perlen; iv) Aufteilung der TIRF- und IRM-Kanäle in separate Bilder; v) Übersetzung des TIRF-Bildes mit dem in iii berechneten durchschnittlichen Verschiebungsvektor; vi) Überlagerung der TIRF- und IRM-Bilder in einer Mehrkanal-.tiff-Datei.

Results

Der optische Aufbau ist in Abbildung 1 schematisiert. Sowohl die IRM-Beleuchtung als auch das TIRF-Anregungslicht werden über einen 10/90 (R/T) Strahlteiler (BS1) auf die hintere Blende des Objektivs (100x, NA: 1.49) gerichtet. Das emittierte Signal durchläuft den gleichen Strahlteiler (BS1) und wird über einen Spiegel (M1) zum Bildteiler reflektiert. Die Komponenten des Bildteilers (in Abbildung 1 mit gestrichelten Linien eingeschlossen) trennen die IRM- und TIRF-Signale über einen 90/10 (R/T) Strahlteiler (BS2) zusammen mit entsprechenden Spektralfiltern. Abschließend werden die geteilten Bilder zur Visualisierung auf den Kamerachip projiziert. Die Ausrichtung des Bildteilers ist so, dass die TIRF- und IRM-Signale auf separate Hälften des Chips projiziert werden.

In einem gut ausgerichteten Mikroskop sollte das Kamerabild ein halbwegs geteiltes Bild anzeigen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Oberflächengebundene Mikrotubuli sollten im IRM-Kanal¹³ gut sichtbar sein, und fluoreszierendes Kinesin sollte im TIRF-Kanal sichtbar sein.

Die Mikrokügelchen, die zum Ausrichten und Registrieren der beiden Kanäle verwendet werden, erscheinen als helle Flecken in den TIRF-Bildern und als dunkle Flecken in den IRM-Bildern. Obwohl die Perlen in den Rohdaten sichtbar sind, verbessert die Hintergrundsubtraktion den Kontrast signifikant (Abbildung 2). Das für die Subtraktion verwendete Hintergrundbild ist der zeitliche Median eines Videos, das mit einer beweglichen Bühne aufgenommen wurde. Wie im Protokoll beschrieben, wurde die Bildausrichtung durchgeführt, indem eine Sammlung von Perlen in der Nähe des interessierenden Bereichs ausgewählt und das bereitgestellte Makro (imageSplitterRegistration.ijm) ausgeführt wurde. Das Makro passt die Punkte an Gauß an und richtet die Bilder aus, indem es den durchschnittlichen Abstand zwischen den Mittelpunkten der Anpassungen in jedem Kanal minimiert. Dieser Prozess ist in Abbildung 2 dargestellt, die eine gute Ausrichtung der fluoreszierenden Mikrokügelchen zeigt (grün im TIRF-Kanal, schwarz im IRM-Kanal).

Schließlich werden die Fähigkeiten dieses simultanen Bildgebungsaufbaus demonstriert, indem einzelne Kinesinmoleküle beobachtet werden, die auf die schrumpfenden Enden von Mikrotubuli zugehen. Abbildung 3 zeigt einen Kymographen von eGFP-markierten Kinesinmolekülen (grün), die auf einem schrumpfenden Mikrotubuli (grau) laufen. Ebenfalls vorgestellt wird eine Reihe von Schnappschüssen aus der Aufnahme, aus der der Kymograph generiert wurde.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des optischen Aufbaus für die gleichzeitige IRM- und TIRF-Bildgebung der Kinesin-Motilität. Die Epiillumination einer LED-Lichtquelle durchläuft die Blendenmembran und erreicht den 10/90 (R/T) Strahlteiler (BS1). Der Strahlteiler reflektiert teilweise das rote IRM-Beleuchtungslicht und das 488 nm TIRF-Anregungslicht bis zum Objektiv, um die Probe zu beleuchten. Das Signal von der Probe wird vom selben Objektiv gesammelt und an die Bildaufteilungsbaugruppe geleitet, wo IRM- und TIRF-Bilder durch den 90/10 (R/T) Strahlteiler (BS2) räumlich getrennt sind. Die Signale werden dann spektral gefiltert, bevor sie den Kamerachip erreichen. Abkürzungen: IRM = Interferenzreflexionsmikroskopie; TIRF = total-internal-reflection-fluorescence; LED = Leuchtdiode; I TIRF =_{TIRF-Beleuchtung}; I GFP = GFP-Fluoreszenz; I_{inc = IRM-Beleuchtung}; I_ref = Streulicht an der Glas/Wasser-Grenzfläche; I_scat = Streulicht aus dem Mikrotubuli; I_{IRM = IRM-Signal} (Interferenz von I_ref und I_scat); R/T = reflektiert/übertragen; LP600: Langpassfilter (600 nm); DM = dichroitischer Spiegel; BS1 und BS2 = Strahlteiler 1 und 2; M1, M2, M3, M4 = Spiegel; BP535/50 = Bandpass (535/50 nm); GFP = grün fluoreszierendes Protein; GMPCPP = Guanylyl-5'-α,β-methylendiphosphonat; BIP = Guanosindiphosphat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Hintergrundsubtraktion und Bildausrichtung. Die TIRF- (linke Hälfte) und IRM-Bilder (rechte Hälfte) erscheinen gleichzeitig auf zwei Hälften desselben Kamerachips (Kamerabild). Die zeitliche mediane Hintergrundsubtraktion erhöht den Kontrast der Perlen (hintergrundsubtrahiertes Bild), die in IRM-Bildern dunkel und in TIRF-Bildern hell erscheinen. IRM- und TIRF-Bilder werden durch Übersetzung (rechts) basierend auf der Lokalisierung ausgewählter Perlen (weiße Rechtecke) ausgerichtet. Maßstabsstäbe = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Kymograph und Momentaufnahmen der Bewegung von Kinesins während der Schrumpfung der Mikrotubuli. Der Kymograph (links) zeigt eGFP-Kinesin-1 (grün), das zum oberen Ende des Mikrotubuli (dunkelgrau) geht. Schnappschüsse aus den entsprechenden Zeitreihen werden angezeigt (rechts). Weiße Pfeile zeigen einzelne Kinesin-1-Moleküle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

ImageSplitterRegistration File: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Untersuchung der Regulation der Mikrotubulidynamik durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) erfordert häufig die gleichzeitige Abbildung von Mikrotubuli und MAPs. Fluoreszenzmikroskopie-Techniken wie TIRF werden typischerweise für diesen Zweck eingesetzt. Sie sind jedoch durch die Nachteile der Fluoreszenzbildgebung begrenzt, zu denen Photobleichen, Lichtschäden und die Notwendigkeit einer Fluorophormarkierung gehören. Markierungsfreie Methoden wie IRM eignen sich für die Visualisierung von Mikrotubuli, sind jedoch nicht in der Lage, einzelne Fluorophore abzubilden. Dieses Protokoll kombiniert markierungsfreie IRM-Bildgebung und TIRF-Mikroskopie für die gleichzeitige Bildgebung von dynamischen Mikrotubuli und MAPs.

Das IRM-Setup verwendet eine LED-Beleuchtungsquelle, die auf >600 nm gefiltert ist, während das TIRF-Setup einen 488-nm-Laser verwendet. Wir verwendeten einen kostengünstigen Plattenstrahlteiler, um das Beleuchtungslicht auf die Probe zu reflektieren und das gesammelte Signal an den Detektor zu übertragen (Abbildung 1). Ein Strahlteiler mit 10% Reflexion und 90% Transmission wurde gewählt, um den Verlust des Einzelmolekülsignals zu minimieren. Der 90%ige Verlust der Beleuchtungslichtintensität wird durch eine Erhöhung der Leistung von Beleuchtungslaser und LED kompensiert.

Die spektrale Trennung der Signale wurde mit einem 90/10 (R/T) Strahlteiler und zwei Spektralfiltern (Long-Pass 600 nm für IRM und Bandpass 535/50 nm für TIRF) erreicht. Die spektral getrennten IRM- und TIRF-Signale werden mithilfe einer Bildteilerbaugruppe auf zwei Hälften eines einzelnen Kamerachips projiziert. Die Verwendung eines 90/10-Strahlteilers opfert 90% des IRM-Signals, was jedoch durch die Erhöhung der Intensität der LED-Beleuchtungsquelle ausgeglichen wird. Auch hier könnte ein dichroitischer Spiegel eingesetzt werden, um die IRM- und TIRF-Signale effizienter zu trennen. Fluoreszierende Mikrokügelchen, die in den Assays enthalten sind, ermöglichen eine genaue Ausrichtung der TIRF- und IRM-Bilder und dienen als Referenz für die Fokussierung des Objektivs.

Das kritischste optische Element in diesem Protokoll ist das Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA). Dies ist nicht nur wichtig, um eine totale interne Reflexion zu erreichen, sondern auch, um die Sammlungseffizienz und den Bildkontrast zu maximieren. Die Qualität der erhaltenen Bilder hängt auch von der Sauberkeit der Glasoberfläche und der Aufnahme eines klaren Hintergrundbildes ab, um eine ungleichmäßige Ausleuchtung zu korrigieren und statische Merkmale zu entfernen. Für die IRM-Bildgebung empfehlen wir die Verwendung einer langwelligen Beleuchtung (>600 nm), um die Lichtschäden von Mikrotubuli und Proteinen zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn eine weiße LED-Lichtquelle verwendet wird, in diesem Fall sollte ein Langpassfilter enthalten sein, um UV-Licht zu entfernen.

Dieses Protokoll ermöglicht eine markierungsfreie Hochgeschwindigkeitsbildgebung dynamischer Mikrotubuli und die gleichzeitige hochauflösende Visualisierung fluoreszierender MAPs¹⁷. Im Vergleich zur Filterwürfel-Schalttechnik, die zwischen der Aufnahme von Bildern von Mikrotubuli und MAPs wechselt, ist dieser Aufbau in der Lage, viel höhere Bildraten zu erzielen, da er nicht von der physischen Rotation eines Filterwürfels abhängt. Im Vergleich zu zweifarbigen TIRF-Bildgebungsverfahren verwendet diese Technik einen weniger anspruchsvollen optischen Aufbau und umgeht die Notwendigkeit einer Fluorophormarkierung von Mikrotubuli. Die Haupteinschränkungen dieses Aufbaus sind auf die TIRF-Bildgebung der MAPs zurückzuführen. Die Bildrate ist durch die Belichtungszeit eines Fluorophors begrenzt, und das Photobleichen von Fluorophoren bleibt eine Möglichkeit. Nichtsdestotrotz verbessert dieses Protokoll bestehende Techniken, da es TIRF nur bei Bedarf verwendet (dh zur Visualisierung von MAPs, aber nicht von Mikrotubuli) und die höchstmögliche Geschwindigkeit innerhalb der Grenzen von TIRF erreicht. Weitere Verbesserungen sind nur möglich, wenn sowohl die Mikrotubuli als auch die MAPs über eine interferometrische Technik visualisiert werden, aber dies erfordert die Markierung von MAPs mit Metallnanopartikeln, was ihre Grenzen und experimentellen Herausforderungen hat.

Um die Fähigkeiten dieser Technik zu demonstrieren, visualisierten wir gleichzeitig zwei schnelle dynamische Prozesse über IRM und TIRF: die Schrumpfung eines Mikrotubuli und das Gehen eines fluoreszierenden Kinesinmoleküls. Diese Technik wurde zuvor eingesetzt, um die schnelle Diffusion von Spastin auf schrumpfenden Mikrotubuli zu visualisieren⁵. Über diese Anwendung auf MAPs und Mikrotubuli hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um einzelne fluoreszierende Moleküle gleichzeitig mit jeder makromolekularen Struktur zu visualisieren, die groß genug ist, um über IRM sichtbar gemacht zu werden, wie z. B. eine Zellmembran oder ein Aktinfilament.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10/90 (R/T) Strahlteiler	Thorlabs	BSN10R	Planstrahlteiler für den Anregungsstrahlengang
90/10 (R/T) Strahlteiler	Thorlabs	BSX10R	Planer Strahlteiler für den Bildteiler
Anti-Biotin-Antikörper	Sigma-Aldrich	B3640	Wird zur Funktionalisierung der Oberfläche für die Bindung von biotinylierten Mikrotubuli
ATP	Sigma-Aldrich	FLAAS verwendet	Wird zur Vorbereitung des Motilitätspuffers
verwendet Bandpassfilter	Newport	HPM535-50	Der hartbeschichtete Bandpassfilter wird im Bildsplitter verwendet, um das GFP-Signal abzubilden
Biotinyliertes Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333P-A	Wird verwendet, um Mikrotubuli-Seeds an die Oberfläche des Strömungskanals zu binden
Kasein	Sigma-Aldrich	C8654	Kasein wird verwendet, um nicht-spesische Wechselwirkungen
zu blockieren Katalase	Sigma-Aldrich	C9322	Wird zur Herstellung der Sauerstofffängerlösung
verwendet Exsikkatorkammer	Southern Labware	55207	Exsikkator wird zum Entgasen des
Harzes DTT	verwendetSigma-Aldrich	D0632	Zur Herstellung der Sauerstofffängerlösung
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Zur Herstellung des BRB80-Puffers
Glukose	Sigma-Aldrich	G7528	Zur Herstellung der Sauerstofffängerlösung
Glukoseoxidase	Sigma-Aldrich	G7016	Zur Herstellung der Sauerstofffängerlösung
GMPCPP-Nukleotide	Jena Bioscience	NU-405L	Wird für die Polymerisation von stabilisierten Mikrotubuli
verwendet Bildsplitter	Teledyne-Photometrics Imaging	OptoSplit II	Ein Bildsplitter wird verwendet, um die Bilder räumlich aufzuteilen. Achten Sie beim Kauf auf die Verträglichkeit mit dem Mikroskop
ImajeJ2	NIH		ImageJ2 wird für die Bildanalyse verwendet
Kinesin			im eigenen Haus hergestellt (siehe Referenzen im Text)
LDPE-Schlauch	Thomas Scientific	9565S22	Ungiftiger Polyethylen-Mikroschlauch mit geringerer Dichte wird für Flüssigkeitstransfers verwendet LED-Lichtquelle
	Lumencor	Lumencor sola Light Engine	Wird für die IRM-Bildgebung
verwendet Langpassfilter	Thorlabs	FELH0600	Hartbeschichtete Langpassfilter. Einer wird als Anregungsfilter verwendet, der andere wird in einem Bildsplitter verwendet, um das IRM-Signal abzubilden
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	63068	Wird zur Vorbereitung des BRB80-Puffers verwendet
Micoscope Objektivheizung	okolab	H401-T-DUAL-BL	Wird verwendet, um die Probentemperatur durch Erhitzen des Objektivs konstant zu halten
Mikroskop	Nikon	Ti-Eclipse	Ein inverses Mikroskop, das in den Experimenten verwendet wird
Na-PIPES	Sigma-Aldrich	P2949	Wird zur Vorbereitung des BRB80-Puffers
verwendet Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Ölobjektiv	Nikon	MRD01991	Das Bildgebungsobjektiv hat eine numerische Apertur von 1,49
PDMS und ein Härter	Elektronenmikroskopie Sciences	Sylgard 184 (24236-10)	Wird für die Konstruktion der Strömungskanäle
PDMS Stanzer	World Precision Instruments LLC	504529	Wird verwendet, um ein Loch in den PDMS-Plasmareiniger zu stanzen
	Harrick Plasma	DPC-32G	Das Luftplasma wird verwendet, um organische Verunreinigungen von der PDMS-Oberfläche
zu entfernen Poloxamer 407 (Handelsname Pluronic F-127)	Sigma-aldrich	P2443	Wird für die Passivierung von Kanaloberflächen verwendet, um unspezifische Bindungen zu minimieren
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	567530	Wird zur Vorbereitung der BRB80
Puffer Stabilisierte Mikrotubuli			die im Haus hergestellt werden (siehe Referenzen im Text)
Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	340400	Wird zum Schleudern von Mikrotubuli-Samen
TetraSeck-Kügelchen	ThermoFisher Scientific	T7279	Wird als Referenz für die Ausrichtung von Bildern verwendet
Zyla 4.2 Kamera	Andor	Zyla 4.2	Wissenschaftliche CMOS-Kamera mit Spezifikationen: 2048 x 2048 Pixel (6,5 μ m Pixelgröße) mit einer Quanteneffizienz von 72% und einem Dynamikbereich von 16 Bit