Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.
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Methodenartikel
Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Massenspektrometrie kann eine tiefe Abdeckung der posttranslationalen Modifikationen (PTMs) liefern, obwohl eine Anreicherung dieser Modifikationen aus komplexen biologischen Matrizen aufgrund ihrer geringen Stöchiometrie im Vergleich zu nicht modifizierten Analyten oft erforderlich ist. Die meisten Anreicherungs-Workflows von PTMs auf Peptiden in Bottom-up-Proteomik-Workflows, bei denen Proteine enzymatisch verdaut werden, bevor die resultierenden Peptide analysiert werden, reichern nur eine Art von Modifikation an. Es ist jedoch das gesamte Komplement von PTMs, das zu biologischen Funktionen führt, und die Anreicherung einer einzigen Art von PTM kann ein solches Übersprechen von PTMs übersehen. PTM-Übersprechen wurde zwischen Proteinglykosylierung und Phosphorylierung beobachtet, den beiden häufigsten PTMs in menschlichen Proteinen und auch den beiden am meisten untersuchten PTMs unter Verwendung von Massenspektrometrie-Workflows. Unter Verwendung der hier beschriebenen simultanen Anreicherungsstrategie werden beide PTMs aus postmortalem menschlichem Pankreasgewebe, einer komplexen biologischen Matrix, angereichert. Die dual-funktionelle Ti(IV)-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie wird verwendet, um verschiedene Formen der Glykosylierung und Phosphorylierung gleichzeitig in mehreren Fraktionen in einer bequemen Spinspitzen-basierten Methode zu trennen, die nachgelagerte Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Wechselwirkungen ermöglicht. Dieser Anreicherungs-Workflow für Glyko- und Phosphopeptide kann auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um eine tiefe Profilierung mehrerer PTMs zu erreichen und potenzielle Zielmoleküle für zukünftige Studien zu identifizieren.
Einleitung
Protein-posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation von Proteinstrukturen und damit ihrer Funktionen und nachgelagerten biologischen Prozesse. Die Vielfalt des menschlichen Proteoms nimmt aufgrund der kombinatorischen Variabilität verschiedener PTMs exponentiell zu. Verschiedene Varianten von Proteinen aus ihren kanonischen Sequenzen, wie sie vom Genom vorhergesagt werden, werden als Proteoformen bezeichnet, und viele Proteoformen entstehen ausPTMs 1. Die Untersuchung der proteoformen Vielfalt in Gesundheit und Krankheit ist in den letzten Jahren zu einem Forschungsgebiet von großem Interesse
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Protokoll
Es wurde die Zustimmung für die Verwendung von Pankreasgewebe für die Forschung von den nächsten Angehörigen des Verstorbenen eingeholt und eine Genehmigung des University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board eingeholt. Eine IRB-Aufsicht ist nicht erforderlich, da sie keine menschlichen Probanden betrifft, wie in 45 CFR 46.102 (f) anerkannt.
VORSICHT: Beim Umgang mit den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, zu denen Säuren (Ameisen, Essigsäure, Trifluoressigsäure), Basen (Ammoniumhydroxid) und Kryogene (flüssiger Stickstoff) gehören, ist Vorsicht geboten. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter für die verwen....
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Ergebnisse
Repräsentative Massenspektrometriedaten, einschließlich Rohdateien und Suchergebnisse, wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD03306522 an das ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.
In dieser Arbeit wurden doppelte Injektionsreplikate für jede Anreicherungselution analysiert. Identifikationen aus beiden technischen Replikaten wurden in der Endanalyse zusammengetragen. Aufgrund der semi-stochastischen Natur der datenabhängigen Erfass.......
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Diskussion
Die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie ist nützlich für die gleichzeitige Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus derselben Probe in einem einzigen Probenvorbereitungs-Workflow. Es wurde auch gezeigt, dass ERLIC-basierte Methoden eine gleichzeitige Anreicherung von PTMs durchführen. Beide Strategien wurden zuvor für Deep Coverage in PTM-Analyseneingesetzt 14,18. Durch die Anpassung der dualen Ti-Methode an die Verkürzung der Probeninkubationszeit.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 und R21AG065728) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B und SRA-2016-168-S-B) unterstützt. Die hier vorgestellten Daten wurden zum Teil auch durch die Unterstützung eines NIH/NCATS UL1TR002373 Award durch das Institute for Clinical and Translational Research der University of Wisconsin gewonnen. Die Orbitrap-Instrumente wurden durch die Unterstützung eines NIH Shared Instrument Grant (NIH-NCRR S10RR029531) und des Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education an der University of Wisconsin-Madison erworben. Wir möchten auch die g....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Essigsäure, Eissäure (ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Aceton (ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitril, Optima LC/MS-Qualität | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammoniumacetat (kristallin/ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammoniumhydroxid (ACS Plus-zertifiziert)) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic Software | Protein Metrics | n/a | Kommerzielle Software für die glykoproteomische Analyse (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH-Material | Wasser | 186002353 Material, | das aus der Säule entnommen und zum Verpacken von Nanokapillaren verwendet wird (gezogen, um die Spitze zu integrieren, die direkt in einer Linie mit dem Instrumenteneingang verwendet wird) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J& K Scientific | 2749380-1G | Material für dual-funktionelles Ti(IV)-IMAC; kann auch für konventionelle IMAC/konventionelle Phosphopeptid-Anreicherung verwendet |
| werden Cellcrusher-Kit | Cellcrusher n | /a | Wird zum Mahlen von Gewebeproben zu Pulver vor der Extraktion verwendet |
| Eppendorf 5424R Mikrozentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | Für temperaturkontrollierte Zentrifugation |
| cOmplete Proteasehemmer Cocktailtabletten | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molekulare Qualität (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Proteinreduktionsmittel |
| Ethanol, 200 Proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analoger Vortex-Mischer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention (1,5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Modell 120 Schalldämpfer | Fisher Scientific | FB120110 | Für die Probenanalyse mittels Ultraschall |
| Ameisensäure, 99,0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Quarzglaskapillare (75 μ m Innendurchmesser, 360 μ m Außendurchmesser) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | Für hauseigene gezogene und gepackte Säulen mit integriertem Emitter |
| Flusssäure (48 Gew.-% in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Wird zum Öffnen des Emitters einer gezogenen Kapillarsäule |
| verwendet Iodacetamid, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Proteinreduktionsreagenz |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Kostenlose Software für die phosphoproteomische Analyse (https://www.maxquant.org/) |
| Multithermer Shaker mit Heizung und Kühlung | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heizblock |
| Oasis HLB 1 cc Vac Kartusche, 10 mg Sorptionsmittel pro Kartusche, 30 & Mikro; m, 100/pk | Wasser | 186000383 | Großflächige Kartuschenentsalzung für tryptische Aufschlüsse (Ladekapazität ca. bis zu 1 mg pro Stück) |
| OMIX C18 Pipettenspitzen, 100 & Mikro; L-Spitze, 10 - 100 μ L-Elutionsvolumen, 1 x 96 | Spitzen Agilent | A57003100 | Kleinere gepackte Pipettenspitze zum Entsalzen für Anreicherungselutionen |
| P-2000 Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | Zum Ziehen von Nanokapillarsäulen für LC-MS |
| PhosSTOP Phosphatase-Inhibitor-Tabletten | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitativer kolorimetrischer Peptid-Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μ m, Porengröße 300 & Aring;) | PolyLC | BMSX1203 | Material für die Stark-Anionenaustausch-Chromatographie zur Anreicherung von ERLIC/konventionellen Glykopeptiden |
| Kaliumphosphat Monobasisch (kristallin/ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Druckinjektionszelle mit integrierter magnetischer Rührplatte | Next Advance | PC77-MAG | Zum Verpacken von Nanokapillarsäulen mit stationärer Phase bis zu einem Grenzwert |
| von 2500 psiProteome Discoverer-Software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Kommerzielle Software für die Proteomik-Analyse (mit integrierten Datenbank-Suchsoftware-Knoten) und Datenvisualisierung (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vakuumkonzentrator Modell SC110-120 | Savant | n/a | Zentrifugal-Vakuumkonzentrator zum Trocknen von Proben (unter Hitze) |
| SDS-Lösung, 10%ige Natriumdodecylsulfatlösung, Molekularbiologie/Elektrophorese | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequenzierqualität modifiziertes Trypsin | Promega | V5111 | |
| Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Leer, 10-200 & Mikro; L, Packung mit 96 | Stück Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Leere Pipettenspitze mit mikrometergroßem Loch, die zum Verpacken von chromatographischem Material für Anreicherungen verwendet werden kann, gebündelt mit Röhrchenadaptern |
| Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB, 1 M, pH 8,5 (flüchtig))Sigma | 90360-100ML | ||
| Trifluoressigsäure, Reagenzqualität, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris-Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Molekularbiologie) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C-Mix, Massenspektrometrie | Promega | V5071 | |
| Harnstoff (ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Wasser, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
Referenzen
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22
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Nachdrucke und Genehmigungen
