Method Article

Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit kontrollierter Dicke für die kryogene Elektronenmikroskopie mit hohem Durchsatz

DOI:

10.3791/63739

⸱

April 21st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein neu entwickelter mikrostrukturierter Chip mit Graphenoxidfenstern wird unter Anwendung mikroelektromechanischer Systemtechniken hergestellt, die eine effiziente und kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung verschiedener Biomoleküle und Nanomaterialien mit hohem Durchsatz ermöglichen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine wesentliche Einschränkung für die effiziente und hochdurchlässige Strukturanalyse von Biomolekülen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist die Schwierigkeit, Kryo-EM-Proben mit kontrollierter Eisdicke auf der Nanoskala herzustellen. Der auf Silizium (Si) basierende Chip, der über eine regelmäßige Anordnung von Mikrolöchern mit Graphenoxid (GO) -Fenster verfügt, die auf einem dickengesteuerten Siliziumnitridfilm (SixNy) strukturiert sind, wurde unter Anwendung von MEMS-Techniken (Mikroelektromechanik) entwickelt. UV-Photolithographie, chemische Gasphasenabscheidung, nasses und trockenes Ätzen des dünnen Films und Tropfenguss von 2D-Nanoblattmaterialien wurden für die Massenproduktion der mikrostrukturierten Chips mit GO-Fenstern verwendet. Die Tiefe der Mikrolöcher wird reguliert, um die Eisdicke bei Bedarf zu kontrollieren, abhängig von der Größe der Probe für die Kryo-EM-Analyse. Die günstige Affinität von GO zu Biomolekülen konzentriert die interessierenden Biomoleküle während der Kryo-EM-Probenvorbereitung im Mikroloch. Der mikrostrukturierte Chip mit GO-Fenstern ermöglicht eine Kryo-EM-Bildgebung verschiedener biologischer Moleküle sowie anorganischer Nanomaterialien mit hohem Durchsatz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) wurde entwickelt, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Proteinen in ihrem nativen Zustand 1,2,3,4 aufzulösen. Die Technik beinhaltet das Fixieren von Proteinen in einer dünnen Schicht (10-100 nm) aus Glaseis und das Aufnehmen von Projektionsbildern von zufällig orientierten Proteinen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), wobei die Probe bei flüssiger Stickstofftemperatur gehalten wird. Tausende bis Millionen von Projektionsbildern werden aufgenommen und verwendet, um eine 3D-Struktur des Proteins durch Rechenalgorithmen 5,6 zu rekonstruieren. Für eine erfolgreiche Analyse mit Kryo-EM wurde die Kryoprobenvorbereitung automatisiert, indem die Ausrüstung, die die Löschbedingungen, die Feuchtigkeit und die Temperatur steuert, eingefroren wurde. Die Probenlösung wird mit einer löchrigen Kohlenstoffmembran in ein TEM-Gitter geladen, nacheinander getupft, um die überschüssige Lösung zu entfernen, und dann mit flüssigem Ethan eingefroren, um dünnes, glasiges Eis 1,5,6 zu erzeugen. Mit den Fortschritten in der Kryo-EM und der Automatisierung der Probenvorbereitung7 wurde Kryo-EM zunehmend verwendet, um die Struktur von Proteinen zu lösen, einschließlich Hüllproteinen für Viren und Ionenkanalproteinen in der Zellmembran8,9,10. Die Struktur der Hüllproteine pathogener Viruspartikel ist wichtig für das Verständnis der Virusinfektionspathologie sowie für die Entwicklung des Diagnosesystems und der Impfstoffe, z. B. SARS-CoV-2 11, die dieCOVID-19-Pandemie verursacht haben. Darüber hinaus wurden Kryo-EM-Techniken in jüngster Zeit in den Materialwissenschaften angewendet, z. B. für die Abbildung strahlempfindlicher Materialien, die in Batterien 12,13,14 und katalytischen Systemen14,15 verwendet werden, und für die Analyse der Struktur anorganischer Materialien im Lösungszustand 16.

Trotz spürbarer Entwicklungen in der Kryo-EM und relevanten Techniken gibt es Einschränkungen in der Kryoprobenvorbereitung, die die Hochdurchsatz-3D-Strukturanalyse behindern. Die Herstellung eines glasigen Eisfilms mit optimaler Dicke ist besonders wichtig, um die 3D-Struktur biologischer Materialien mit atomarer Auflösung zu erhalten. Das Eis muss dünn genug sein, um Hintergrundgeräusche von Elektronen, die vom Eis gestreut werden, zu minimieren und Überlappungen von Biomolekülen entlang des Elektronenstrahlweges 1,17 zu verbieten. Wenn das Eis jedoch zu dünn ist, kann dies dazu führen, dass sich Proteinmoleküle in bevorzugten Orientierungen ausrichten oderdenaturieren 18,19,20. Daher sollte die Dicke des Glaseises in Abhängigkeit von der Größe des interessierenden Materials optimiert werden. Darüber hinaus ist in der Regel ein umfangreicher Aufwand für die Probenvorbereitung und das manuelle Screening der Eis- und Proteinintegrität auf den vorbereiteten TEM-Gittern erforderlich. Dieser Prozess ist extrem zeitaufwendig, was seine Effizienz für die 3D-Strukturanalyse mit hohem Durchsatz beeinträchtigt. Daher würden Verbesserungen der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung den Einsatz von Kryo-EM in der Strukturbiologie und kommerziellen Arzneimittelforschung sowie in der Materialwissenschaft verbessern.

Hierin stellen wir Mikrofabrikationsprozesse zur Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit Graphenoxid (GO) -Fenstern vor, die für Kryo-EM mit hohem Durchsatz mit kontrollierter Eisdicke21 ausgelegt sind. Der mikrostrukturierte Chip wurde mit mikroelektromechanischen Systemtechniken (MEMS) hergestellt, die die Struktur und Abmessungen des Chips in Abhängigkeit von den Bildgebungszwecken manipulieren können. Der mikrostrukturierte Chip mit GO-Fenstern hat eine Mikrowellenstruktur, die mit der Probenlösung gefüllt werden kann, und die Tiefe der Mikrovertiefung kann reguliert werden, um die Dicke des Glaseises zu kontrollieren. Die starke Affinität von GO für Biomoleküle erhöht die Konzentration von Biomolekülen für die Visualisierung und verbessert die Effizienz der Strukturanalyse. Darüber hinaus besteht der mikrostrukturierte Chip aus einem Si-Rahmen, der eine hohe mechanische Stabilität für das Gitter19 bietet, was ihn ideal für die Handhabung des Chips während der Probenvorbereitung und der Kryo-EM-Bildgebung macht. Daher bietet ein mikrostrukturierter Chip mit GO-Fenstern, der mit MEMS-Techniken hergestellt wird, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung, die eine effiziente und hochdurchsatzbasierte Strukturanalyse auf der Grundlage von Kryo-EM ermöglichen kann.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit GO-Fenstern (Abbildung 1)

  1. Deponieren Sie das Siliziumnitrid.
    1. Auf beiden Seiten des Si-Wafers (4 Zoll Durchmesser und 100 μm Dicke) wird Siliziumnitrid (SixNy) unter Verwendung von Niederdruck-Chemical Vapor Deposition (LPCVD) bei 830 °C und einem Druck von 150 mTorr unter einem Durchfluss von 170 sccm Dichlorsilan (SiH2Cl2, DCS) und 38sccm Ammoniak (NH3) abgeschieden.
    2. Mit einer Abscheiderate von ~30 Å/min können Sie die Dicke SixNy innerhalb von 25-100 nm kontrollieren, indem Sie die Abscheidezeit variieren.
      HINWEIS: Beim Umgang mit dem Si-Wafer ist äußerste Vorsicht geboten, da der Wafer sehr dünn und zerbrechlich ist. Achten Sie darauf, den Wafer während der Handhabung oder Verladung in der Ausrüstung nicht zu verbiegen.
  2. Mustern Sie den Fotolack.
    1. Tragen Sie eine Hexamethyldisilazan (HMDS)-Lösung auf den SixN y-abgeschiedenen Si-Wafer mit genügend Volumen auf, um die gesamte Oberfläche des Wafers abzudecken, drehen Sie die Beschichtung mit einem Spincoater bei 3.000 U / min für 30 s und backen Sie bei 95 ° C für 30 s auf einer heißen Platte, um die Waferoberfläche hydrophob zu machen und somit eine gute Beschichtungsleistung mit Fotolack (PR) zu gewährleisten.
    2. Tragen Sie positive PR (Table of Materials) mit genügend Volumen auf, um die gesamte Oberfläche des Wafers abzudecken, schleudern Sie die Beschichtung bei 3.000 U / min für 30 s und backen Sie bei 100 ° C für 90 s auf einer heißen Platte. Spin-Coated PR hat eine Dicke von 500 nm.
    3. Belichten Sie den PR-beschichteten Wafer mit ultraviolettem Licht (365 nm Wellenlänge und 20 mW/cm2 Intensität) für 5 s durch eine Chrommaske (Abbildung 2A-D) mit einem Aligner.
    4. Entwickeln Sie die PR für 1 min mit einem Entwickler (Table of Materials) und spülen Sie den Wafer ab, indem Sie ihn 2x in deionisiertes (DI) Wasser tauchen. Trocknen Sie den PR-gemusterten Wafer vollständig ab, indem SieN2-Gas auf die Waferoberfläche blasen.
      HINWEIS: Beim Einblasen vonN2-Gas auf den Si-Wafer ist äußerste Vorsicht geboten, da der Wafer sehr dünn und zerbrechlich ist. Blasen SieN2-Gas nicht mit hohem Druck in eine Richtung senkrecht zum Wafer, da dies zum Bruch des Wafers führen kann.
  3. Muster der SixNy.
    1. Ätzen Sie das belichtete SixNy nach der Strukturierung des PR mit einem im Labor gebauten reaktiven Ionenradierer (RIE) mit 3 sccm Schwefelhexafluorid (SF6) -Gas bei einer Hochfrequenzleistung (RF) von 50 W. Die Ätzrate mit diesen Einstellungen beträgt ~6 Å/s. Stellen Sie die Ätzzeit in Abhängigkeit von der Dicke der abgeschiedenen SixNy-Schicht ein.
      HINWEIS: Die Ätzrate kann variieren und muss im Labor optimiert werden, abhängig von den Spezifikationen der verwendeten RIE-Ausrüstung.
    2. Beseitigen Sie die PR, indem Sie den SixNy gemusterten Wafer 30 min lang bei Raumtemperatur in Aceton tauchen, gefolgt von Spülen des Wafers, indem Sie ihn in DI-Wasser 2x tauchen. Trocknen Sie den Wafer vollständig ab, indem SieN2-Gas auf die Waferoberfläche blasen.
      HINWEIS: Beim Eintauchen oder Entfernen des Wafers aus den Lösungen ist äußerste Vorsicht geboten, da der Wafer durch die Oberflächenspannung der Lösung gebrochen werden kann. Tauchen Sie den Wafer nicht parallel zur Oberfläche der Lösung ein oder nehmen Sie ihn heraus. Verwenden Sie eine präzise Wafer-Handling-Pinzette mit Kohlefaserspitzen. Greifen Sie die Hostie nicht stark mit der Pinzette; Heben Sie eine Seite des Wafers an, bis sich der Wafer in einen Winkel neigt, in dem er aus der Lösung herausgenommen werden kann. Der Wafer kann aufgrund des festen Griffs beim Anheben brechen, wenn er sich biegt.
  4. Ätzen Sie das Si.
    1. Eine 1,5 m Kaliumhydroxid (KOH)-Lösung wird hergestellt, indem KOH-Pulver in DI-Wasser bei 80 °C gelöst wird.
    2. Tauchen Sie den Si xN y gemusterten Wafer in KOH-Lösung, um das freiliegende Si zu ätzen. Lassen Sie den Wafer unter Rühren in der Lösung, bis die freistehenden Si x N y-Fenster auf der gegenüberliegenden Seite des gemusterten SixN y beobachtet werden können.
      HINWEIS: Die Nassätzzeit kann je nach Dicke des Si variieren; Bei einem 100 μm dicken Wafer dauert das Nassätzen in der Regel mehrere Stunden. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit während des Si-Ätzens nicht zu hoch ein, da die freistehenden SixNy-Fenster sehr dünn sind und durch den Fluss der Flüssigkeit gebrochen werden können. In diesem Experiment wurde die Rührrate auf 250 U/min eingestellt.
    3. Reinigen Sie den geätzten Wafer, indem Sie ihn mehrmals in ein DI-Wasserbad tauchen, um Ätzrückstände zu beseitigen. Trocknen Sie den Wafer an der Luft.
      HINWEIS: Beim Eintauchen oder Entfernen des Si-gemusterten Wafers aus den Lösungen ist äußerste Vorsicht geboten, da die freistehenden SixNy-Fenster sehr dünn und zerbrechlich sind und durch die Oberflächenspannung der Lösung gebrochen werden können. Der Wafer sollte in einem Winkel eingetaucht oder herausgenommen werden, so dass die Kante des Wafers zuerst in die Lösung ein- und austritt.
  5. Beseitigen Sie die KOH-Ätzrückstände.
    1. Drücken Sie leicht auf die Grenzen des Chip-Arrays mit einer Pinzette, um ein Array von Chips zu erhalten, die mikrostrukturiert sein werden (Abbildung 1B).
    2. 1,5 M KOH-Lösung bei 80 °C unter Rühren vorbereiten.
    3. Tauchen Sie das Chip-Array 30 s lang in KOH-Lösung ein und spülen Sie es ab, indem Sie es 2x in DI-Wasser tauchen. Trocknen Sie die Späne vollständig ab, indem SieN2-Gas blasen.
      HINWEIS: Beim Eintauchen der Späne in Lösungen und beim Föhnen mitN2-Gas ist äußerste Vorsicht geboten, da die freistehenden SixNy-Fenster sehr dünn und zerbrechlich sind. Während der Chip in KOH-Lösung eingetaucht ist, sollte das Rühren gestoppt werden. Die Späne sollten mit ihren Kanten zuerst in die Richtung senkrecht zur Lösung getaucht und mitN2-Gas in paralleler Richtung geblasen werden.
    4. Trocknen Sie das Chiparray mindestens 1 Stunde lang vollständig in der Luft ab.
  6. Gestalten Sie die PR.
    1. Bereiten Sie einen leeren 525 μm Si-Wafer als festen Träger vor. Drehen Sie den Si-Wafer wie oben beschrieben mit HMDS und positiver PR, aber befestigen Sie das Chip-Array (mit der freistehenden SixN y-Fensterseite nach oben) auf dem Si-Wafer, bevor Sie den PR backen. Der PR fungiert als Klebstoff zwischen Wafer und Chiparray. Backen Sie den Si-Wafer, der mit dem Chip-Array bei 100 °C für 90 s auf einer heißen Platte befestigt ist.
    2. Drehen Sie den Chipsatz mit HMDS und positiver PR, wie oben beschrieben.
    3. Belichten Sie den Chipsatz mit ultraviolettem Licht (365 nm Wellenlänge; 20 mW/cm2 Intensität) für 5 s durch eine Chrommaske (Abbildung 2E,F) mit einem Aligner.
    4. Entwickeln Sie den PR mit einem Entwickler für 15 s, spülen Sie den Chipsatz ab, indem Sie ihn in DI-Wasser 2x tauchen, und trocknen Sie den PR-strukturierten Chipsatz vollständig ab, indem SieN2-Gas blasen.
  7. Bereiten Sie das mikrostrukturierte SixNy vor.
    1. Ätzen Sie Si x Ny nach der PR-Strukturierung mit einer im Labor gebauten RIE mit 3 sccm SF6 Gas bei einer HF-Leistung von 50 W. Steuern Sie die Ätzzeit in Abhängigkeit von der Dicke der SixNy-Schicht.
  8. Beseitigen Sie die PR.
    1. Beseitigen Sie die PR, indem Sie den gemusterten Chipsatz bei 60 °C in 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP)-Lösung tauchen und über Nacht stehen lassen. Spülen Sie den Chipsatz ab, indem Sie ihn in DI-Wasser 2x tauchen, und trocknen Sie den gemusterten Chipsatz vollständig ab, indem Sie N2-Gas blasen.
    2. Beseitigen Sie die PR-Rückstände mit einem O2-Plasmaprozess unter Verwendung von 100 sccmO2-Gas bei einerHF-Leistung von 150 W für 1 Minute mit der im Labor entwickelten RIE.
  9. Spülen Sie den mikrostrukturierten Chip ab.
    1. Bereiten Sie 1,5 M KOH-Lösung bei 80 °C vor.
    2. Tauchen Sie die mikrostrukturierten Chips 30 s lang in KOH-Lösung, um die PR-Rückstände vollständig zu beseitigen, und spülen Sie die Chips ab, indem Sie sie 2x in DI-Wasser tauchen. Trocknen Sie die Späne vollständig ab, indem SieN2-Gas blasen.
    3. Trocknen Sie die Chips mindestens 1 Stunde lang vollständig an der Luft.
  10. Transfer von Graphenoxid (GO) durch das Tropfengießverfahren.
    1. Verdünnen Sie die GO-Lösung (2 mg/ml) auf 0,2 mg/L mit DI-Wasser und beschallen Sie sie für 10 Minuten, um Aggregate von GO-Blättern aufzubrechen. Zentrifugieren Sie die verdünnte GO-Lösung bei 300 x g für 30 s.
    2. Glühen entladen die Si-geätzte Seite des mikrostrukturierten Chips, um die Chipoberfläche mit positiver Ladung mit einem Glühentladung (Table of Materials) bei 15 mA für 1 min zu rendern.
    3. Tropfen Sie 3 μL der GO-Lösung auf die glühende Seite des mikrostrukturierten Chips und lassen Sie den Tropfen für 1 min auf dem Chip. Nach 1 min die überschüssige GO-Lösung auf dem Chip mit Filterpapier abtupfen.
    4. Waschen Sie den GO-übertragenen Chip mit DI-Wassertröpfchen, die auf Paraffinfolie vorbereitet wurden, und tupfen Sie das DI-Wasser auf dem Chip mit Filterpapier ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x auf der GO übertragenen Seite und 1x auf der gegenüberliegenden Seite. Trocknen Sie den GO-übertragenen Chip bei Raumtemperatur über Nacht.
    5. Waschen Sie den mikrostrukturierten Chip mit GO-Fenstern, indem Sie ihn in das DI-Wasser tauchen und den Chip mitN2-Gas föhnen.

2. Kryo-EM-Bildgebung

  1. Bereiten Sie die Kryoprobe vor.
    1. Bereiten Sie die Kryoprobe mit einer mechanischen Kryo-Tauchmaschine (Table of Materials) vor, die die Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Löschzeit und Kraft steuert. Nachdem Sie das Blotting Pad auf die Blotter geladen haben, stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit und die Temperatur in der Kammer bei 100% bzw. 15 °C gehalten werden.
    2. Nehmen Sie den mikrostrukturierten Chip mit einer typischen Kryo-Pinzette auf und laden Sie die Pinzette in die Kryo-Tauchmaschine. Pipettieren Sie 3 μL Probenlösung auf den mikrostrukturierten Chip an der Lochseite mit GO-Fenstern auf der Unterseite. Steuern Sie die Löschzeit und -kraft in Abhängigkeit von der Probenlösung.
      HINWEIS: Hier wurden biologische Proben, nämlich humanes Immundefizienzvirus (HIV-1), Ferritin, Proteasom 26S, GroEL, Apoferritinproteinpartikel und Tau-Filamentproteine für die Kryo-EM-Bildgebung verwendet. Darüber hinaus wurden verschiedene Arten von anorganischen Materialien, wie Fe2O3-Nanopartikel (NP), Au-Nanopartikel, Au-Nanostäbchen und Kieselsäure-Nanopartikel, für dieKryo-EM-Bildgebung verwendet. Die gewünschte Löschzeit und -kraft wurden auf dem Kryokolben für verschiedene Arten von Proben eingestellt.
    3. Nach dem Blotting-Prozess den probenbeladenen Chip sofort in flüssigem Ethan einfrieren. Übertragen Sie den Chip in flüssigem Stickstoff (LN 2) in die Gitterbox und lagern Sie ihn in LN2 vor der Kryo-EM-Bildgebung.
  2. Führen Sie Kryo-EM-Bildgebung durch.
    1. Laden Sie die Kryoprobe auf einen Kryo-EM-Halter mit einer Temperatur von -180 °C.
    2. Laden Sie den Kryo-EM-Halter in ein TEM und beobachten Sie die Proben im MDS-Modus (Minimum Dose System).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein mikrogemusterter Chip mit GO-Fenstern wurde durch MEMS-Fertigung und 2D-GO-Nanoblatttransfer hergestellt. Chips für die Mikrostrukturierung wurden in Massenproduktion hergestellt, wobei etwa 500 Chips aus einem 4-Zoll-Wafer hergestellt wurden (Abbildung 1B und Abbildung 2A, B). Die Designs der mikrogemusterten Chips können während des Photolithographieverfahrens mit verschiedenen Designs der Chrommaske (Abbildung 2

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden die Mikrofabrikationsverfahren zur Herstellung von mikrogemusterten Chips mit GO-Fenstern vorgestellt. Der hergestellte mikrostrukturierte Chip wurde entwickelt, um die Dicke der Glaskörpereisschicht zu regulieren, indem er die Tiefe des Mikrolochs mit GO-Fenstern in Abhängigkeit von der Größe des zu analysierenden Materials steuert. Ein mikrogemusterter Chip mit GO-Fenstern wurde unter Verwendung einer Reihe von MEMS-Techniken und einer 2D-Nanoblatttransfermethode hergestellt (Abbildung ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.-H.K., S.K., M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das Creative-Pioneering Researchers Program der Seoul National University (2021) und den von der koreanischen Regierung finanzierten NRF-Zuschuss (MSIT; Grant Nr. NRF-2020R1A2C2101871 und NRF-2021M3A9I4022936). M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das POSCO Science Fellowship der POSCO TJ Park Foundation und den von der koreanischen Regierung finanzierten NRF-Zuschuss (MSIT; Grant-Nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. würdigt die finanzielle Unterstützung aus dem NRF-Zuschuss, der von der koreanischen Regierung (MSIT; Grant-Nr. NRF-2020R1A6C101A183) und die interdisziplinären Forschungsinitiativen Programme des College of Engineering und des College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkennt die finanzielle Unterstützung aus dem NRF-Zuschuss an, der von der koreanischen Regierung (MSIT; Grant-Nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Die Autoren danken den Mitarbeitern und der Crew des Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) für ihren unermüdlichen Einsatz und ihre Ausdauer bei den Kryo-EM-Experimenten. Die Autoren danken S. J. Kim vom National Center for Inter-university Research Facilities für die Unterstützung bei den FIB-SEM-Experimenten.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP)Sigma Aldrich, USA443778
Aceton
AFMPark Systems, SüdkoreaNX-10
AlignerMidas System, SüdkoreaMDA-600S
EntwicklerAZ Electronic Materials USA Corp., USA184411
Kryo-EM-HalterGatan, USA626 Kryo-EM-Halter
Kryo-TauchgerätThermo Fisher SCIENTIFIC, USAVitrobot Mark IV
Fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM)FEI Company, USAHelios NanoLab 650
GlimmentladungTed Pella Inc., USAPELCO easiGlow
Graphenoxid (GO)-LösungSigma Aldrich, USA
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%Alfa Aesar, USA10226590
Niederdruck-Gasphasenabscheidung (LPCVD)Centrotherm, DeutschlandLPCVD E1200
maP1205 positive PRMikroresist-Technologie, DeutschlandA15139
Kaliumhydroxid (KOH), FlockenDAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., Südkorea6597-4400
Raman-SpektrometerNOST, SüdkoreaKonfokales Mikro-Raman-System HEDA
Reaktiver Ionenätzer (RIE)Wissenschaftliches Engineering, SüdkoreaLabor gebautes
REMCarl Zeiss, DeutschlandSUPRA 55VP
Si-WaferJP COMMERCE, Südkorea4" Siliziumwafer, P(B)Typ, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin CoaterDong Ah Trade Corp., SüdkoreaACE-200
TEMJEOL, JapanJEM-2100F
AZ 300 MIF mit einfacher Kippung763705 Im

References

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