Methodenartikel

Lichtinduzierte In situ Transmissionselektronenmikroskopie zur Beobachtung der Wechselwirkung zwischen flüssiger und weicher Materie

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DOI:

10.3791/63742

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26. Juli 2022

 , 
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Modifikationen des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) mit einem Lichtbeleuchtungssystem, die Herstellung flüssiger Zellen und in situ TEM-Beobachtungen von lichtinduzierten Wechselwirkungen zwischen Bakterienzellen und einem Photosensibilisator. Die Probenvorbereitungsmethoden, die Elektronenstrahlschädigung und die Bildgebung werden ebenfalls diskutiert.

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Modifikationen des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) für in situ lichtinduzierte Beobachtungen. Eine Glasfaser, die in die Elektronensäule über dem Polstück der Objektivlinse eingeführt wurde, und ein Laser, eine einstellbare Lichtquelle, wurde verwendet, um das Gerät herzustellen. Nachdem die Beleuchtung mit einem externen Messsystem kalibriert wurde, kann die Intensität der Beleuchtung an die Bedürfnisse des beobachteten Prozesses angepasst werden. Dieses Beleuchtungssystem wurde verwendet, um antimikrobielle photodynamische Therapiephänomene abzubilden, die derzeit Gegenstand intensiver Forschung sind. Die Probe wurde vorbereitet, indem eine Bakteriensuspension auf einem Kohlenstoff-, Graphen- oder Siliziumnitridsubstrat entdeckt, die überschüssige Lösung abgetupft, die Photosensibilisatorlösung entdeckt, die überschüssige Flüssigkeit erneut abgetupft und dann die flüssige Zelle mit einem zweiten Substrat oder Graphenfilm zusammengesetzt wurde. Der Prozess des bildgebenden Experiments selbst umfasst die Auswahl des richtigen Beobachtungsortes mit geringer Vergrößerung und einer minimalen Elektronendosis und dann die zyklische Aktivierung der Lichtquelle, um nachfolgende Bilder in festgelegten Intervallen mit der minimalen Menge an Elektronen aufzunehmen. Die Elektronendosis jeder Exposition sowie die Zeit und Intensität der verwendeten Beleuchtung müssen aufgrund der Komplexität der beobachteten Phänomene sorgfältig aufgezeichnet werden, da der Prozess gleichzeitig licht- und elektronengetrieben ist. Nach Durchführung des eigentlichen Experiments müssen zusätzliche Kontrollbeobachtungen gemacht werden, bei denen die gleichen Elektronendosen verwendet werden, jedoch ohne zusätzlichen Lichteinfluss und kleinere Elektronendosen für höhere Lichtdosen verwendet werden. Dies ermöglicht es, lichtinduzierte Mikrostruktureffekte sowohl in den Lebens- als auch in den Materialwissenschaften von denen zu unterscheiden, die durch Elektronen verursacht werden.

Einleitung

Lichtinduzierte Phänomene in hoher Auflösung sind in vielen Bereichen wie Nanoengineering 1,2,3, Katalyse 4,5 und Biophotonik6 interessant. Einige originelle Designs, die solche Experimente ermöglichen, finden sich in der Literatur, einschließlich Modifikationen der Probenhalter 1,4,7,8,9 und der am Mikroskop 10,11 befestigten optischen Faser.

Die Kombination aus Lichtbeleuchtung, flüssiger Umgebung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet eine großartige Gelegenheit für detaillierte, dynamische Untersuchungen photoinduzierter Prozesse. Die Hochvakuumbedingungen im Mikroskop sind jedoch für viele Flüssigkeiten, insbesondere Wasserlösungen, eher ungünstig. Die Flüssigkeitsverkapselung, die es vor der Umwelt schützt, kann mit einigen Techniken erreicht werden, die hauptsächlich auf Graphen 12, Siliziumnitrid13 oder Kohlenstoff14-Substraten basieren. Neben der materialwissenschaftlichen Forschung2 bieten sogenannte flüssige Zellen Möglichkeiten, unkonventionelle mikroskopische Beobachtungen an biologischen Proben in der Nähe ihrer nativen Bedingungendurchzuführen 15. Solche Beobachtungen sind vor allem für lebende Mikroorganismen wie Bakterienzellen äußerst anspruchsvoll. Der Elektronenstrahl als ionisierende Strahlung verursacht irreversible Schäden an den hydratisierten Proben, so dass die Elektronendosis angegeben werden muss16. Dies ist notwendig, um ungünstige Auswirkungen zu minimieren, den Schaden zu kontrollieren und verwirrende Artefakte zu vermeiden. Die optimale maximale Elektronendosis, die Beobachtungen lebender Zellen erlaubt, ist noch ein fragwürdiges Thema16, aber die Dosis von 30 e−/nm2 scheint der Schwellenwert zu sein, zumindest für Bakterien17.

Einige der Themen, die für solche mikroskopischen Studien von Interesse sind, sind Prozesse während der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (APDT)18. Kurz gesagt, die Therapie verläuft wie folgt. Die Bakterienzellen sind von der lichtempfindlichen Flüssigkeit namens Photosensibilisator umgeben. Wenn die Lichtbeleuchtung bei einer bestimmten Wellenlänge gegeben wird, werden die zytotoxischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Energie- oder Ladungstransfer von den angeregten Photosensibilisatormolekülen auf den natürlich in der Lösung vorhandenen Sauerstoff erzeugt. Krankheitserreger, die ROS ausgesetzt sind, werden schnell mit sehr hoher Effizienz inaktiviert, ohne Nebenwirkungen19. Das Ansprechen auf die Therapie variiert für verschiedene Mikroben – zum Beispiel kann die Wirkung desselben Photosensibilisators für grampositive und gramnegative Bakterien sehr unterschiedlich sein20. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass das Hauptziel von ROS die äußeren Strukturen von Zellen sind, wo Schäden zu Funktionsstörungen der Zellmembran und folglich zum Tod von Bakterien führen21,22. Aber auch Schäden an Nukleinsäuren und Proteinen können als Ursache für die Inaktivierung angesehen werden18, so dass noch unbekannt ist, welche Zellstrukturen die Hauptziele während dieses Prozesses sind19. Ein tieferes Verständnis der schädigenden Prozesse könnte helfen, diese definitive Therapie zu verbessern. Im Vergleich zu den lichtmikroskopischen Methoden, die in der APDT-Forschung23 verwendet werden, bieten TEM-Techniken mehr Möglichkeiten, den APDT-Mechanismus mit höherer Auflösung und Vergrößerung zu betrachten24. TEM wurde bereits erfolgreich zur Zellbeobachtung während der laufenden Therapie eingesetzt, wodurch wir grampositive Bakterienschäden untersuchen und die Veränderungen innerhalb der Zellwand detailliert beschreibenkonnten 6,25.

Das aktuelle Protokoll stellt einen geeigneten Versuchsaufbau für die hochauflösende Bildgebung der lichtinduzierten Bakterieninaktivierung mittels TEM dar, was ein geeignetes Lichtbeleuchtungssystem, die Verkapselung von Zellen mit einer Flüssigkeit und eine strenge Elektronendosiskontrolle erfordert. Das für die Beobachtung verwendete Bakterium war Staphylococcus aureus, und eine Methylenblaulösung wurde als Photosensibilisator verwendet. Der spezielle Lichtbeleuchtungsaufbau besteht aus einem durchstimmbaren Halbleiterlaser, der über die Lichtfaser direkt mit der Mikroskopsäule verbunden ist. Dieses Design bietet eine gleichmäßige Bestrahlung in der gesamten Probe aufgrund der nahezu parallelen Platzierung der optischen Faser zur Mikroskopachse. Monochromatisches Licht von hoher Intensität, das vom Laser erzeugt wird, kann dann verwendet werden, um verschiedene photochemische Effekte zu untersuchen. Das im Experiment verwendete Licht hatte eine Wellenlänge gleich 660 nm, da Methylenblau im sichtbaren Bereich Absorptionspeaks bei 613 nm und 664 nm26 aufweist. Das Protokoll für die Flüssigkeitsverkapselung basiert auf Kohlenstoffsubstraten, was das Verfahren schnell und unkompliziert macht. Schließlich wird eine Methode zur niedrig dosierten in situ TEM-Beobachtung von Zellen in Flüssigkeit vorgestellt. Die Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung, die Auswirkungen der Elektronendosis auf die empfindliche Probe und die vernünftige Bildinterpretation werden diskutiert.

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Protokoll

1. Modifikation des Transmissionselektronenmikroskops

  1. Modifizieren Sie das Transmissionselektronenmikroskop, indem Sie die optische Faser (siehe Materialtabelle) mit der Mikroskopsäule oben auf der Objektivlinse verbinden. Lassen Sie einige Zentimeter Platz zwischen der Objektivlinse und der Kondensatorlinse sowie einen freien Schlitz für Zubehör.
    HINWEIS: Ein dedizierter Probenhalter4 oder ein Halter für kathodolumineszierende Beobachtungen in umgekehrter Konfiguration1 kann ebenfalls verwendet werden.
  2. Überprüfen Sie das System mit groben Vakuumpumpen auf Leckagen. Wenn das System kein Vakuumleck aufweist, testen Sie das System unter Hochvakuum.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Betätigung des Vakuumsystems nicht vom standardmäßigen Start des belüfteten Mikroskops abweicht. Bei Problemen bei der Ausführung, Montage oder Inbetriebnahme des Moduls wenden Sie sich an autorisiertes Servicepersonal oder den Gerätehersteller.
      HINWEIS: Die korrekt hergestellte und montierte Beleuchtung verdeckt den Elektronenstrahl nicht. Wenn sich der Strahl während des Betriebs des Mikroskops nacheinander verschiebt, wird die nichtleitende optische Faser nicht ausreichend mit einer Metallabschirmung bedeckt und akkumuliert eine elektrische Ladung. In diesem Fall schieben Sie die optische Faser tief in den leitenden Mantel.
  3. Messen Sie die Lichtintensität mit dem Fotodioden-Leistungssensor (siehe Materialtabelle). Wenn der Abstand zwischen den Polstücken der Objektivlinse keine Messung im Mikroskop zulässt, messen Sie die Geometrie der Probe und des Illuminators und reproduzieren Sie diese Bedingungen in einem externen Messaufbau.
  4. Wenn das Mikroskop nicht mit einem Elektronendosismesssystem ausgestattet ist, führen Sie die Kalibrierung durch, indem Sie den Strahlstrom mit einem Faradayschen Becher messen (siehe Materialtabelle) und die Dichte der Elektronen, die auf die Probetreffen 27, numerisch berechnen.

2. Verkapselung von Bakterien mit dem Photosensibilisator

  1. Platzieren Sie zwei unbehandelte TEM-Gitter, die mit amorphem Kohlenstoff bedeckt sind, zwischen zwei gekreuzten Pinzetten, die der kohlenstoffbeschichteten Seite nach oben zugewandt sind. Halten Sie die Gitter so nah wie möglich am Rand.
    HINWEIS: Für bestimmte Substrat-, Lösungs- und Probenkombinationen kann es vorteilhaft sein, Glimmentladung auf einem oder beiden Netzen zu verwenden, um Fabrikverunreinigungen zu entfernen und eine maximale hydrophile Oberflächezu erhalten 28. Am Beispiel von S. aureus-Bakterien und Methylenblau-Lösung wurde festgestellt, dass die besten und reproduzierbarsten Ergebnisse an neuen, unbehandeltem Kohlenstoff auf Kupfergittern ohne zusätzliche Glimmentladung oder Plasmareinigung erzielt wurden6.
  2. Geben Sie 4 μL Bakterienlösung auf eines der Gitter. Die optische Dichte der Probe muss im Bereich von 5-10 liegen.
    HINWEIS: Die in der Studie verwendeten Bakterien wurden aus der Kultur gereinigt und im PBS-Puffer dispergiert. Es wird dringend empfohlen, die Konzentration der Bakterien in der frischen Probe jedes Mal zu überprüfen, z. B. mit negativen Färbemethoden, gemäß den etablierten verfügbaren Protokollen 29,30,31.
  3. Warten Sie 60 s und tupfen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit Filterpapier ab. Versuchen Sie, die Flüssigkeit während dieses Prozesses über die gesamte Gitteroberfläche zu verteilen.
  4. Geben Sie 4 μL Photosensibilisator auf das gleiche Raster.
    HINWEIS: Methylenblau in einer Konzentration von 2 μg/ml wurde als Photosensibilisator für die vorliegende Studie verwendet.
  5. Nach 5 s die Flüssigkeit auslöschen. Lassen Sie eine sehr dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Substrat.
  6. Legen Sie den trockenen Rost schnell auf den mit Flüssigkeit bedeckten.
  7. Bewegen Sie das obere Gitter vorsichtig an den Rand des zweiten und drücken Sie die Substrate an den Rändern mit einer Pinzette zusammen.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann etwas Flüssigkeit aus der Probe fließen, was bedeutet, dass nicht genug abgelassen wurde. Dies bedeutet jedoch nicht zwangsläufig, dass die Bildung der flüssigen Zelle erfolglos bleibt.
  8. Wiederholen Sie den Druck vorsichtig.
    HINWEIS: Es ist einfacher, diesen Schritt durchzuführen, indem Sie die Pinzette um 90° drehen, so dass sie senkrecht zum Tisch liegen und die Spitzen beider Pinzetten auf der gleichen Höhe bleiben, unabhängig von der Position zum Öffnen / Schließen.
  9. Lassen Sie die flüssige Zelle zwischen der Pinzette für 1 min.
  10. Führen Sie die Probe direkt nach Abschluss der Präparation in den TEM-Halter ein.
    HINWEIS: Die Spannung der Haltermontageplatte / des Halterrings hilft den Substraten, zu haften und die Flüssigkeit im Inneren zu halten.
    1. Wenn möglich, pumpen Sie den Probenhalter in eine externe Pumpstation, um die Kontamination des Mikroskops durch Verdampfen von Flüssigkeit zu reduzieren.

3. In situ TEM-Beobachtungen von Bakterienzellen im Flüssigelektronendosiseffekt

  1. Führen Sie die Probe in das Mikroskop ein.
  2. Starten Sie die Beobachtungen im Modus mit geringer Vergrößerung, um einen geeigneten Beobachtungsbereich zu finden.
    HINWEIS: Dunklere Bereiche sind aufgrund der Elektronenstrahlstreuung am ehesten flüssig.
    1. Halten Sie während der Beobachtungen die Elektronendosis so gering wie möglich. Erweitern Sie die Belichtungszeit (bis zu 2 s bei einer Beschleunigungsspannung von 150 kV und einer 5.000-fachen Vergrößerung). Die 5.000-fache Vergrößerung für die Bottom-Mount-Kamera (ungefähres Sichtfeld beträgt 10 μm) reicht aus, um Bakterien mit einem Durchmesser von ~1 μm abzubilden.
      HINWEIS: Manchmal ist es nicht einfach, die Flüssigkeit zu unterscheiden, daher ist es zu Beginn der Beobachtungen hilfreich, den Elektronenstrahl dort zu fokussieren, wo er wahrscheinlich flüssig ist. Die Flüssigkeit sollte sich auf einem fokussierten Elektronenstrahl bewegen, und die Blasen werden erscheinen. Nach dieser Überprüfung ist es notwendig, einen anderen Bereich für weitere Beobachtungen zu finden.
  3. Finden Sie die von Flüssigkeit umgebenen Zellen in der entsprechenden Vergrößerung mit verlängerter Belichtungszeit und nehmen Sie sofort das erste Bild auf. Halten Sie die Elektronendosis konstant und sammeln Sie alle 30 s Bilder, um die Veränderungen zu beobachten.
  4. Untersuchen Sie die Bilder sorgfältig und berechnen Sie die Gesamtelektronendosis27 , die den ersten sichtbaren Veränderungen in den Zellen entspricht.

4. In situ TEM-Beobachtungen lichtinduzierter Prozesse zwischen Bakterienzellen und Photosensibilisator

  1. Stellen Sie vor Beginn des Experiments die Laserlichtintensität ein, indem Sie den aktuellen Wert anpassen. Wählen Sie die geeignete Wellenlänge entsprechend dem Absorptionsspektrum des Photosensibilisators. Wählen Sie gemäß dem vorherigen Kalibrierdiagramm (Schritt 1.4.) den aktuellen Wert, der der niedrigsten Lichtintensität entspricht.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Lichtwellenlänge betrug 660 nm.
  2. Führen Sie die Probe in das Mikroskop ein und suchen Sie den Beobachtungsbereich nach Schritt 3.2. im vorherigen Abschnitt.
  3. Nehmen Sie das erste Bild der Zelle auf, bevor Sie mit der Beleuchtung der Probe beginnen, und verwenden Sie den Strahlblanker, um den Elektronenstrahl auszuschalten, um die Auswirkungen der Elektronenbestrahlung zu vermeiden.
  4. Schalten Sie den Laser ein. Beginnen Sie mit einer kurzen Beleuchtungszeit (hier 30 s), da das Laserlicht eine relativ hohe Intensität aufweist. Schalten Sie nach dieser Zeit die Lichtquelle aus.
  5. Schalten Sie den Strahlblanker aus und nehmen Sie das Bild sofort auf. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatischen Algorithmus, um die Probe nur für die Zeit verfügbar zu machen, die für die Aufnahme des Bildes benötigt wird. Messen Sie sorgfältig die Elektronenbestrahlungszeit, um die für die Bildgebung verwendete Elektronendosis27 zu berechnen.
  6. Wiederholen Sie Schritt 4.4. und Schritt 4.5. , um die erwartete Lichtbeleuchtungszeit zu erhalten.

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Ergebnisse

Der Versuchsaufbau wurde entwickelt, um die lichtinduzierten Prozesse in einer Flüssigkeit mit hoher Auflösung zu beobachten. Die kompetitive Analyse der Bilder erlaubte es uns, die durch den Elektronenstrahl verursachten Schäden von Veränderungen im Zusammenhang mit der photochemischen Reaktion zu unterscheiden. Die Wirkung des Elektronenstrahls auf die empfindliche Probe (in diesem Fall die mit Flüssigkeit verkapselten Zellen) war über den gesamten bestrahlten Bereich sichtbar, da die Elektronen gleichmäßig durchdrange...

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Diskussion

Die Installation und Inbetriebnahme der Beleuchtung erfordert grundlegende Servicekenntnisse und kann das Mikroskop beschädigen. Der einfachste Weg, das Licht in das Mikroskop einzuführen, besteht darin, die optische Faser von der Oberseite der Objektivlinse aus zu verbinden, wo normalerweise Platz für die TEM-Ablenkspulen und zusätzliche Detektoren ist. Mehr Freiraum kann auch von älteren Top-Entry-Geräten erwartet werden, bei denen sich am selben Ort die Probenvakuumschleuse und der Probeninstallationsmechanismus befin...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Forschung wurde durch das Miniatura-Stipendium (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kohlenstofffilm auf 200 Mesh KupfergitterAgar ScientificAGS160Die Standard-TEM-Gitter für Beobachtungen und die Vorbereitung von Flüssigzellen
Crossover-PinzetteDumontN5Die Pinzette ist für die Vorbereitung von Flüssigzellen erforderlich
Photodioden-LeistungssensorThorLabsS130CDer Sensor zur Messung der Lichtintensität
Polyimid-beschichtete Multimode-FaserThorlabsFG400UEPMuss mit dem vor Ort eingebauten Adapter in das Mikroskop eingebaut werden, gemäß dem 10.1016/j.ultramic.2021.113388
TransmissionselektronenmikroskopHitachiH-800Kann durch jedes Side-Entry-Mikroskop ersetzt werden, das modifiziert werden kann
Abstimmbarer DiodenlaserCNIMRL-III-660DDie Lichtwellenlänge muss auf der Grundlage des Absorptionsspektrums des Photosensibilisators gewählt werden

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