An exzitatorischen Synapsen im Säugetiergehirn aktiviert präsynaptisch freigesetztes Glutamat Rezeptoren, die in die postsynaptische Membran eingebettet sind 1,2. Die Stärke dieser synaptischen Verbindungen unterliegt einer erfahrungsabhängigen Plastizität, eine Eigenschaft, die vielfältige Formen des Lernens und des Gedächtnisses ermöglicht 3,4,5,6,7,8,9. Pathologische Veränderungen der Anzahl der Synapsen und ihrer Signaleigenschaften führen zu einer veränderten Schaltkreisaktivität und Informationsverarbeitung, die bei zahlreichen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen auftritt 10,11,12. Daher ist es dringend erforderlich, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, die die neuronale Konnektivität und die Stärke synaptischer Verbindungen steuern.
Exzitatorische Synapsen bilden sich an dendritischen Dornen, winzigen postsynaptischen Vorsprüngen, die Gerüstproteine, Rezeptoren, Signalfaktoren, Zytoskelettproteine und Transportorganellenenthalten 1,2,13,14,15,16. Diese mikrometergroßen Signalkompartimente ermöglichen die Kontrolle der synaptischen Stärke auf Synapsenbasis13,16. Die Morphologie der dendritischen Wirbelsäule variiert entlang der Länge der neuronalen Dendriten, wobei die Wirbelsäulenformen typischerweise als dünn, filopodial, stumpf, pilzförmig oder verzweigt beschriebenwerden 13. Wichtig ist, dass die Form der Wirbelsäule mit der synaptischen Funktion und Stabilität korreliert. Zum Beispiel haben größere Stacheln eine erhöhte Anzahl von Rezeptoren und eine größere synaptische Stärke 16,17,18. Im Gegensatz zu dünnen Stacheln können größere Stacheln in vivo monatelang bestehen bleiben, eine Eigenschaft, die stabile synaptische Verbindungen und eine langfristige Speicherung des Gedächtnisses ermöglichenkönnte 19,20.
Die Morphologie und Dichte der Wirbelsäule entlang eines Dendriten wird häufig verfolgt, um den Grad der neuronalen Konnektivität und die Eigenschaften der exzitatorischen Synapsen innerhalb einer bestimmten Gehirnregion sowohl im Normal- als auch im Krankheitszustand zu untersuchen13. Es wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um die Morphologie der Wirbelsäule in verschiedenen Gewebepräparationen und Modellsystemen mit Hilfe der Standardlicht- und Fluoreszenzmikroskopie sowie der Superauflösungs- und Elektronenmikroskopie (EM)21 sichtbar zu machen. Diese leistungsstarken bildgebenden Verfahren haben einen enormen Einblick in unser aktuelles Verständnis von Organisation, Funktion und Krankheit des Gehirns gegeben. Diese Methodensammlung umfasst wichtige bildgebende Verfahren zur Überwachung der morphologischen Komplexität von Dendriten und Dornen sowie optogenetische Werkzeuge zur Aktivierung und Messung der neuronalen Aktivität in Dendriten und einzelnen Dornen.
Pekarek et al.22 präsentieren ein relativ schnelles Hochdurchsatzprotokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Struktur neuronaler Dendriten tief in intaktem Nervengewebe. Die Autoren führen Clear Lipid-tauschte ACrylamide-hybridisierte Rigid Imaging/immunstaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hY drogel(CLARITY) durch, eine Gewebereinigungstechnik, die Lipide aus dem Hirngewebe entfernt und zur Minimierung der Lichtstreuung während der nachfolgenden Bildgebung beiträgt23. Nach dem Clearing wurden Z-Stapel von Neuronen, die fluoreszierende Proteine exprimieren, durch konfokale oder Zwei-Photonen-Mikroskopie gesammelt. Bildanalyse und automatisierte Quantifizierung ermöglichten präzise Messungen der Dichte und Form der Wirbelsäule sowie der Komplexität des dendritischen Baums. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Abbildung von Strukturen, die von einzelnen Stacheln bis hin zu dendritischen Bäumen reichen, und eliminiert den zeitaufwändigen und potenziell schädlichen Schritt des Dünnschliffschneidens. Diese Technik wird für Forscher, die Veränderungen in der Morphologie der Wirbelsäule und der dendritischen Komplexität in intaktem Hirngewebe nach der Einführung oder Entfernung eines oder mehrerer Gene von Interesse quantifizieren möchten, sehr nützlich sein.
Die Golgi-Färbung wurde vor über 100 Jahrenentwickelt 24 und ist nach wie vor ein leistungsfähiges Werkzeug zur Visualisierung der Organisation des Nervensystems und der neuronalen Morphologie. Bei diesem Verfahren werden dünn besetzte Populationen von Neuronen durch Mikrokristallisation von Silberchromat gefärbt, was die Visualisierung von Axonen, dendritischen Bäumen und Stacheln ermöglicht25. Frankfurt und Bowman26 beschreiben ein schnelles Golgi-Imprägnierprotokoll zur Visualisierung von Neuronen und dendritischen Dornen im Hippocampus der Ratte und im medialen präfrontalen Kortex. Die Autoren zeigen, wie Gewebe für die anschließende Lichtmikroskopie vorbereitet, gefärbt und abgebildet werden kann, sowie wie die Dichte der Wirbelsäule entlang dendritischer Bäume quantifiziert werden kann. Das hier beschriebene Protokoll führt zu einer konsistenten, zuverlässigen Imprägnierung von Neuronen und reduziert die Exposition gegenüber giftigen Chemikalien.
Während die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie gut für die Abbildung von Dendriten und Stacheln geeignet ist, ermöglicht die EM die Visualisierung von prä- und postsynaptischen Strukturen mit Nanometerauflösung21. EM-Ansätze werden typischerweise verwendet, um die ultrastrukturellen Eigenschaften von Synapsen zu messen, einschließlich der Dimensionen der postsynaptischen Dichte sowie der Anzahl und Größe der synaptischen Vesikel21. In dieser Sammlung stellen Śliwińska et al.27 ein Protokoll zur Aufnahme dreidimensionaler (3D) EM-Bilder mittels Serial Block-face scanning Electron Microscopy (SBEM) in hippokampalem Mausgewebevor 28,29. Insbesondere beschreiben sie, wie Proben vorbereitet, Gewebe in Harz eingebettet, Proben eingefasst und getrimmt werden, SBEM durchgeführt und Bilder analysiert werden, um 3D-Rekonstruktionen zu generieren. Dieses Protokoll erzeugt kontrastreiche Bilder mit gut definierten Membranen und kann für eine Vielzahl von Gewebetypen angepasst werden.
Während der Entwicklung des Nervensystems durchlaufen Neuronen dramatische morphologische Veränderungen, da synaptische Verbindungen durch neuronale Aktivität gebildet und verfeinert werden30,31. Um die neuronale Reifung im sich entwickelnden Kleinhirn zu verfolgen, stellen Chan et al.32 ein Protokoll für die in vivo postnatale Elektroporation von sich entwickelnden Körnerneuronen zur Verfügung. Hier injizierten und elektroporierten Forscher DNA in das Hinterhirn von postnatalen Mauswelpen, um eine dünne Population von Neuronen mit fluoreszierenden Proteinen zu transfizieren. Hochauflösende konfokale Mikroskopie und 3D-Bildgebung ermöglichten es den Forschern, die Morphologie von Dendriten und dendritischen Klauen über mehrere Stadien der postnatalen Entwicklung hinweg zu charakterisieren. Wichtig ist, dass dieser Ansatz das Einfügen oder Entfernen von Genen ermöglichen könnte, die die Reifung und Funktion von Körnerzellen beeinflussen können, und für Forscher, die die Entwicklung des Kleinhirns und die Reifung von Körnerneuronen untersuchen, von großem Interesse sein wird.
Schließlich verwenden die Protokolle von Cuentas-Condori und Miller33 superhochauflösende Bildgebung34, Optogenetik35 und Lebendzellbildgebung der Kalziumdynamik36 , um die Aktivität von GABAergen Neuronen im Fadenwurm C. elegans zu untersuchen. Mit einem konfokalen Mikroskop, das für die hochauflösende Bildgebung37 ausgerüstet ist, exprimieren die Autoren fluoreszierende Proteine in Dendriten, um die Häufigkeit verschiedener Wirbelsäulenformen zu messen. Darüber hinaus beurteilen die Autoren die neuronale Funktion durch die Expression eines optogenetischen Proteins präsynaptisch und eines Kalziumindikators postsynaptisch. Nach Lichtaktivierung der Endungen wurden Calciumtransienten innerhalb einzelner dendritischer Dornen beobachtet. Diese Protokolle, zusammen mit jüngsten Erkenntnissen38, unterstreichen die aufregende Verwendung von C. elegans als leistungsfähiges Modellsystem zur Verfolgung der Morphologie und synaptischen Aktivität der Wirbelsäule.
Zusammengenommen werden die in dieser Methodensammlung beschriebenen Protokolle den bereits reichhaltigen Werkzeugkasten ergänzen, der zur Visualisierung der neuronalen Struktur und Funktion21 zur Verfügung steht. Die Implementierung dieser Methoden in zukünftigen Studien wird wahrscheinlich zusätzliche Einblicke in die Prozesse liefern, die die lernbezogene synaptische Plastizität antreiben, und die zellulären Mechanismen, die Krankheitszuständen zugrunde liegen.