Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen humanen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen

Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von oberflächenassoziierten Mikroben oder nicht angebundenen Aggregaten, die von einer extrazellulären polymeren Substanz (EPS)^1,2 umhüllt sind. Diese Gemeinschaften schützen die eingeschlossenen Mikroorganismen vor Umweltstressoren, einschließlich der Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und dem Immunsystem³. Mehrere pathogene mikrobielle Spezies bilden Biofilme, die mit chronischen Infektionen in Verbindung gebracht wurden⁴. Die Entwicklung von Biofilmen ist ein komplizierter Prozess, der die Anhaftung an Oberflächen, die EPS-Produktion, die Zellproliferation, die Biofilmstrukturierung und die Zellablösung^{umfasst 5}. Sobald sich Zellen zu einem Biofilm zerstreut haben, bleiben sie planktonisch oder translozieren sich in ein neues Substrat und beginnen die Biofilmentwicklung wieder⁶.

Staphylococcus aureus, ein opportunistischer Erreger, folgt einem allgemeinen Schema der Biofilmentwicklung, einschließlich Anheftung, Proliferation, Reifung und Ausbreitung⁷. Der Bindungsprozess in S. aureus-Biofilmen wird durch hydrophobe Wechselwirkungen, Teichonsäuren und mikrobielle Oberflächenkomponenten, die adhäsive Matrixmoleküle (MSCRAMMs) erkennen, ^bestimmt8,9. Wenn die Vermehrung von S. aureus beginnt, wird EPS produziert, das hauptsächlich aus Polysacchariden, Proteinen, extrazellulärer DNA und Teichonsäuren besteht⁵. Bei der Herstellung von EPS-Komponenten werden auch verschiedene Exoenzyme und kleine Moleküle produziert, die zur 3-dimensionalen Struktur des Biofilms beitragen und die Ablösung⁵ unterstützen. S. aureus nutzt diesen hochgradig koordinierten Lebensstil, um verschiedene chronische Infektionen zu etablieren, einschließlich Infektionen durch das Verweilen in Medizinprodukten¹⁰.

Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) ist eine der Hauptursachen für Infektionen im Zusammenhang mit verweilten medizinischen Geräten wie Zentralvenen- und Harnkathetern, Gelenkprothesen, Herzschrittmachern, mechanischen Herzklappen und Intrauterinpessaren¹¹. Während solcher Infektionen sind Neutrophile die ersten Immunzellen des Wirts, die an der Infektionsstelle rekrutiert werden, um Krankheitserreger über mehrere Strategien zu bekämpfen¹². Dazu gehören Phagozytose, Degranulation, Produktion von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS/RNS) oder Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) zur Eliminierung von Krankheitserregern¹³.

Die Erzeugung von ROS bei Phagozytose von Mikroben ist eine der wichtigsten antimikrobiellen Reaktionen von Neutrophilen¹⁴. Die Phagozytose wird verstärkt, wenn Mikroben mit Opsoninen beschichtet sind, insbesondere Immunglobuline und Komplementkomponenten, die im Serum¹⁵ vorkommen. Die opsonisierten Mikroben werden dann von Zelloberflächenrezeptoren auf Neutrophilen erkannt und verschlingt, wobei sie ein Kompartiment bilden, das als Phagosom¹⁵ bezeichnet wird. Neutrophile erzeugen und setzen ROS im Phagosom über die membranassoziierte NADPH-Oxidase¹⁶ frei. Dieser Mehrkomponenten-Enzymkomplex erzeugt Superoxidanionen, indem er Elektronen auf molekularen Sauerstoff¹⁶ überträgt. Darüber hinaus erzeugen Neutrophile auch RNS durch die Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)¹⁷. Diese hohen Superoxid- und Stickstoffmonoxidradikale im Phagosom haben breite antimikrobielle Aktivitäten. Sie können mit Metallzentren in Enzymen interagieren und Nukleinsäuren, Proteine und Zellmembranen des Erregers 18,19,20,21 schädigen. Zahlreiche Mikroben nehmen einen Biofilm-Lebensstil an und wenden unterschiedliche Strategien an, um der Tötung durch ROS^22,23 zu entgehen. Daher sind standardisierte Assays, die Biofilme mit Neutrophilen koppeln, um ROS zu quantifizieren, für konsistente Ergebnisse von Vorteil.

Während Assays, wie die Quantifizierung der neutrophilen ROS-Produktion, Informationen über die Reaktionen von Neutrophilen auf Biofilme liefern, kann die Fähigkeit, die Wechselwirkungen von Neutrophilen innerhalb eines Biofilms zu visualisieren, ebenfalls als leistungsfähiges Werkzeug dienen. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen für die Mikroskopie erfordert oft eine Optimierung, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, die für die mikroskopische Bildgebungsanalyse verwendet werden können. Die Flexibilität, einige Bedingungen zu optimieren, ist begrenzt, da Neutrophile nach der Isolierung den Zelltod durchlaufen können. Darüber hinaus werden typischerweise Biofilme gewaschen, um die planktonische Population vor der Zugabe von Neutrophilen aus dem Versuchsaufbau zu entfernen. Während des Waschens kann es aufgrund des Verlusts von partieller Biomasse zu Variabilität zwischen replizierten Biofilmen kommen, wenn Biofilme lose an der Oberfläche haften.

Im Großen und Ganzen umfassen aktuelle Methoden auf diesem Gebiet zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und Biofilmen hauptsächlich Mikroskopie, Durchflusszytometrie und die Enumeration koloniebildender Einheiten (CFU)^24,25,26,27. Die Mikroskopie beinhaltet die Verwendung von Farbstoffen, die entweder die Neutrophilen und Biofilme direkt anfärben oder auf verschiedene neutrophile Reaktionen gegen Mikroben wie NET-Bildung, Degranulation und Zelltod abzielen^25,28. Eine Teilmenge dieser Reaktionen, wie Neutrophilenzelltod und Degranulation, kann auch mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, erfordert jedoch, dass Neutrophile vorzugsweise nicht mit großen Aggregaten von Mikroben in einem Biofilm assoziiert sind^28,29. Die Durchflusszytometrie kann auch einige Biofilmparameter quantifizieren, wie z. B. die Zelllebensfähigkeit²⁷. Diese Prozesse erfordern jedoch eine Störung der Biofilmbiomasse und wären nicht nützlich, um andere wichtige Wechselwirkungen wie die räumliche Verteilung von Neutrophilen und ihren Komponenten innerhalb eines Biofilms^27,29,30 zu visualisieren.

Das vorliegende Protokoll konzentriert sich auf die Anpassung einiger der traditionell verwendeten Methoden zur Untersuchung von Neutrophil-Biofilm-Wechselwirkungen auf Biofilmen, die optimiert wurden, um eine minimale Variabilität während der Handhabung zu gewährleisten. Dieses Protokoll bietet somit standardisierte Methoden zur Züchtung und Quantifizierung von Biofilmen, zur Isolierung primärer humaner Neutrophile aus peripherem Blut, zur Quantifizierung der ROS-Produktion und zur Visualisierung von Biofilm-Neutrophilen-Interaktionen mittels Mikroskopie. Dieses Protokoll kann an verschiedene Systeme angepasst werden, um Biofilm-Neutrophilen-Interaktionen unter Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Spenderpools zu verstehen.

Alle Verfahren wurden vom Ohio State University Institutional Review Board (IRB) genehmigt (2014H0154). Die schriftliche Zustimmung aller Spender zur Entnahme von peripherem Blut zur Isolierung primärer humaner Neutrophilen wurde von allen Spendern eingeholt. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ wurde als Modellorganismus für die Durchführung der Experimente verwendet. Die Experimente wurden mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) aufgrund einer möglichen Exposition gegenüber einem durch Blut übertragenen Krankheitserreger durchgeführt.

1. Herstellung von In-vitro-Biofilm

1. Isolierte Kolonien von S. aureus werden aus einem kryokonservierten Bestand 31 unter Verwendung einer Streifenplattentechnik^32,33 auf einer nährstoffreichen Agarplatte, wie z. B. Tryptose-Soja-Agar^, erhalten (siehe Materialtabelle).
2. Einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 100 μL 0,001% (v/v) Poly-L-Lysin (PLL) verdünnt in sterilem_H2Obeschichten und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren. Aseptisch saugen Sie die PLL-Lösung mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle ab. Lassen Sie die Brunnen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
   HINWEIS: Alle Aspirationsschritte im Protokoll werden mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
3. Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie eine Kolonie von S. aureus in minimal essentiellem Alpha (MEMα) mit 2% Glucose beimpfen und bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min für 16-18 h schütteln.
4. Die Übernachtkultur wird durch Übertragen von 50 μL bis 5 ml frischem MEMα, ergänzt mit 2% Glucose, verdünnt und bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min bis zur mittleren logarithmischen Phase inkubiert, im Allgemeinen zwischen der optischen Dichte 600 (OD_600nm) von 0,5-0,8. Verwenden Sie MEMα, um die mittellogarithmische Kultur auf einen OD_600nm von 0,1 zu normalisieren.
5. Übertragen Sie 150 μL normalisierte Kultur in jede Vertiefung der mit PLL behandelten 96-Well-Platte. In einer befeuchteten Kammer bei 37 °C statisch 18-20 h inkubieren.
   HINWEIS: Die Biofilme können auch in anderen Formaten wie μ-Kanal-Objektträgern gezüchtet werden (siehe Materialtabelle).
6. Saugen Sie den Überstand ab, um die Planktonzellen zu entfernen. Waschen Sie die verbleibende Biomasse vorsichtig mit 150 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Fügen Sie HBSS tropfenweise hinzu, um eine Unterbrechung des Biofilms zu vermeiden.
   HINWEIS: Lassen Sie beim Absaugen des Überstands und des HBSS während des Waschens gerade genug Flüssigkeit (Überstand oder HBSS) in den Vertiefungen, die den Biofilm enthalten, so dass der Biofilm noch eingetaucht ist. Dies verhindert die Störung der Biofilmstruktur, wenn HBSS tropfenweise hinzugefügt wird, um den Biofilm zu waschen.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6 mindestens zwei weitere Male, um alle Planktonzellen zu entfernen. An diesem Punkt sind Biofilme bereit für sofortige nachgeschaltete Experimente.
   HINWEIS: Wenn die Biofilme nicht für neutrophile Experimente verwendet werden, kann HBSS durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ersetzt werden. HBSS wird gegenüber PBS bevorzugt, da HBSS Komponenten enthält, einschließlich Glukose, die optimale Bedingungen für die Aktivierung von Neutrophilen bieten³⁴.

2. Quantifizierung der Biomasse von Biofilmen

1. Bereiten Sie eine Brühe von 0,1% (w/v) kristallvioletter (CV) Lösung (siehe Tabelle der Materialien) vor, indem Sie in 20% (v/v) Ethanol und 80% (v/v) H2O auflösen. Stellen Sie sicher, dass der CV vollständig in Ethanol gelöst ist, bevor Sie_{H2O hinzufügen}.
2. 150 μL 0,1% ige CV-Lösung in den gewaschenen Biofilm geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie mindestens drei leere Bohrlöcher als reine Mediensteuerung.
3. Die 0,1%ige CV-Lösung aus den Biofilmen absaugen und die gefärbten Biofilme mit 200 μL 1x PBS waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wäschen, um überschüssiges CV aus den Vertiefungen zu entfernen.
4. 150 μL 33%ige (v/v) Eisessigsäure verdünnt mit_H2Ozugeben. Bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei 50 U/min für 30 min inkubieren, damit sich der an die Biomasse gebundene CV vollständig auflösen kann.
   VORSICHT: Führen Sie diesen Schritt in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter PSA durch, da Eisessig eine korrosive Chemikalie ist.
5. In der Zwischenzeit richten Sie den Mikroplattenleser (siehe Materialtabelle) ein, um die CV-Färbewerte abzulesen. Nach der Eisessigbehandlung die Platte bei 595 nm Wellenlänge ablesen.
   HINWEIS: Die Wellenlänge, die zur Messung des OD von CV verwendet wird, kann zwischen 500 und 600 nm³⁵ liegen.

3. Neutrophilen-Isolierung

ANMERKUNG: Neutrophile wurden nach einer zuvor veröffentlichten Methode mit geringfügigen Änderungen isoliert³⁶. Dieses Isolationsprotokoll kombiniert zuerst die Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt von einer 3%igen Dextransedimentation. Dieser Abschnitt behandelt nur das gesamte Neutrophilen-Isolierungsprotokoll und konzentriert sich auf die Änderungen am veröffentlichten Protokoll. Darüber hinaus ist das unten beschriebene Protokoll eine der vielen Methoden, die Neutrophile isolieren und bei Bedarf ersetzen können. Andere Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen umfassen die Verwendung von Zelltrennmedien oder magnetische Antikörperzelltrennung³⁷.

1. Entnehmen Sie Blut von einem erwachsenen Spender durch Venenpunktion, gemäß dem im institutionellen IRB beschriebenen Protokoll. Stellen Sie vor der Blutentnahme sicher, dass die Spritze ausreichend konservierungsmittelfreies Heparin enthält, so dass die Endkonzentration von Heparin 20 U / ml beträgt.
2. Das heparinisierte Blut wird mit 3/4 des Volumens des endotoxinfreien 0,9% NaCl (siehe Materialtabelle) in_H2Obei Raumtemperatur verdünnt.
3. Für jeweils 20 ml der verdünnten Blutprobe aliquot 14 ml eines handelsüblichen Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in einem frischen 50 ml konischen Röhrchen. Schichten Sie die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium.
4. Zentrifugieren Sie die geschichtete Blutprobe bei 400 x g für 40 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge eine langsame Pause hat, um eine Störung der Schicht nach Abschluss der Zentrifugation zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Blutprobe besteht aus fünf Schichten, die eine Mischung aus Kochsalzlösung und Plasma, eine mononukleäre Zellschicht, ein Dichtegradientenmedium, Neutrophile und Erythrozyten enthalten.
5. Mit einer serologischen Pipette alle Schichten über den Neutrophilen und dem Erythrozytenpellet aspirieren, gefolgt von einer sanften Resuspension des Pellets in kaltem endotoxinfreiem 0,9% NaCl in_H2O. Für jedes Pellet, das aus einer 20-ml-Blutprobe erzeugt wird, resuspendieren Sie das Pellet wieder auf insgesamt 20 ml Volumen. Fügen Sie 1:1 Volumen von 3% Dextran hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie das Rohr aufrecht für 18-20 min auf Eis.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das 3% ige Dextran mit endotoxinfreiem 0,9% NaCl in_H2Ohergestellt wird.
6. Entfernen Sie 20 ml der oberen Schicht, die Neutrophile und einige Erythrozyten enthält, in ein neues 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 355 x g für 10 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand ab und hinterlassen Sie ein rotes Pellet.
7. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml kaltem, sterilem_H2Ofür 30 s, um die restlichen Erythrozyten zu lysieren. Fügen Sie der Mischung sofort 10 ml kalte endotoxinfreie 0,9% Kochsalzlösung hinzu, um die Spannkraft wiederherzustellen. Die Lösung wird bei 233 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert.
8. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet mit 95% -97% Neutrophilen in 1 ml kaltem HBSS pro 20 ml der Blutprobe.
9. Übertragen Sie 10 μL der resuspendierten Neutrophilen in 90 μL 0,4% Trypanblau-Ausschlussfarbstoff und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Nicht lebensfähige Zellen sind blau gefärbt, da der Trypanblau-Ausschlussfarbstoff in lebensfähigen Zellen undurchlässig ist. Dieses Protokoll bietet >99% Zelllebensfähigkeit^37,38.
10. Fügen Sie zusätzliches HBSS hinzu, so dass die Endkonzentration der Neutrophilen 4 x 10⁶ Zellen / ml beträgt.
    HINWEIS: Für Fälle mit <99% Zelllebensfähigkeit kann die Endkonzentration von 4 x 10⁶ Zellen / ml immer noch erreicht werden; Das Gesamtvolumen der erhaltenen Lösung, die 4 x 10⁶ Zellen / ml enthält, nimmt jedoch ab. Die Endkonzentration der Neutrophilen kann entsprechend den experimentellen Bedürfnissen des Benutzers angepasst werden. Die Neutrophilen wurden bei einer Endkonzentration von 4 x 10⁶ Zellen/ml für alle unten beschriebenen Experimente resuspendiert. Um die Variabilität von Spender zu Spender zu berücksichtigen, wird dringend empfohlen, dass alle Experimente mit Neutrophilen mit mindestens drei verschiedenen Spendern durchgeführt werden.

4. Messung der ROS durch Neutrophile

1. 100 μL 20% normales menschliches Serum (verdünnt in HBSS) tropfenweise in den gewaschenen Biofilm geben (Schritt 1.6) und bei 37 °C unter statischen Bedingungen für 30 min inkubieren, um den Biofilm zu opsonisieren.
2. Die 20%ige Serumlösung absaugen und die Biofilme tropfenweise mit 150 μL HBSS einmal waschen. Absaugen Sie das HBSS und hinterlassen Sie Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen.
   HINWEIS: Für die Interpretation des Experiments werden mindestens vier Gruppen empfohlen: (A) Neutrophile + Biofilm, (B) Neutrophile + PMA (Positivkontrolle, siehe Materialtabelle), (C) Nur Neutrophile und (D) Nur Biofilm.
3. Zugabe von Luminol (siehe Materialtabelle) zu den in HBSS resuspendierten Neutrophilen in einer Konzentration von 4 x 10⁶ Zellen/ml, so dass die endgültige Luminolkonzentration 50 μM beträgt. Diese Lösung ist sofort einsatzbereit für die Gruppen (A) und (C). Fügen Sie 4 x 10⁵ Neutrophile gemischt mit Luminol in die Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen hinzu.
4. In einem separaten Röhrchen 50 μM Luminollösung in HBSS ohne Neutrophile herstellen und in den gut enthaltenden Biofilm (Gruppe D) geben.
5. Aliquot 350 μL Neutrophile gemischt mit Luminol und Zugabe von Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in einer Endkonzentration von 500 ng/ml zu der Mischung. Für Gruppe (B) 4 x 10⁵ Neutrophile aus dieser Mischung in Vertiefungen ohne Biofilm geben. Dies dient als Positivkontrolle.
   HINWEIS: Die in diesem Schritt angegebene PMA-Konzentration ist relativ hoch, um eine robuste Burst-Reaktion zu gewährleisten, da PMA-stimulierte Neutrophile eine positive Kontrolle darstellen. PMA kann je nach Experiment in einer niedrigeren Konzentration verwendet werden, um Neutrophile zu aktivieren.
6. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 x g für 30 s bei 4 °C.
7. Stellen Sie sicher, dass das Plattenlesegerät auf 37 °C eingestellt ist, zusammen mit der Einstellung für Lumineszenz und kinetisches Ablesen für 60 Minuten mit 3-Minuten-Intervallen. Legen Sie die Platte in den Plattenleser, um die ROS-Produktion durch Neutrophile für 60 Minuten zu messen.
   HINWEIS: Für diesen Assay wurden Biofilme in weißen Platten gezüchtet, die für Lumineszenztests verwendet wurden. PMA ist ein bekannter Agonist für die oxidative Burst-Reaktion³⁹. Wenn Sie Studien mit PMA durchführen, stellen Sie sicher, dass PMA im letzten Schritt hinzugefügt wird, während die Lösung, die Neutrophile enthält, kalt ist, da PMA sofort die Burst-Reaktion einleitet.

5. Bildgebung von Biofilm-Neutrophilen-Interaktionen

1. Richten Sie einen Biofilm mit den Schritten 1.2-1.6 ein. Um die Biofilmbildgebung zu erleichtern, verwenden Sie einen fluoreszierenden Stamm von S. aureus, wie USA300, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) ^40,41 exprimiert^, um die Mikroskopie-Bildgebung zu erleichtern.
   HINWEIS: Ein 6-μ-Kanal-Objektträger (siehe Materialtabelle) wurde anstelle einer 96-Well-Platte verwendet, um das In-vitro-Biofilmmodell zu demonstrieren (Schritt 1).
2. 4 x 10⁶ Zellen/ml Neutrophile mit 100 μM Blue CMAC (7-Amino-4-chlormethylcumarin) Farbstoff (BCD, siehe Materialtabelle) für 30 min in einer Wippe bei 37 °C und 5%_CO2 inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln inkubiert werden, und begrenzen Sie die Lichteinwirkung für die verbleibenden Schritte.
3. Um überschüssiges BCD zu waschen, zentrifugieren Sie Neutrophile bei 270 x g für 5 min und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie die Neutrophilen in frischem HBSS. An dieser Stelle fügen Sie den BCD-gefärbten Neutrophilen Ethidiumhomodimer-1 (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 4 μM hinzu, um den Neutrophilen- und Bakterientod zu überwachen.
4. Fügen Sie 150 μL Neutrophile in den S. aureus-Biofilm hinzu, der in μ-Objektträgern gezüchtet wurde, so dass das Verhältnis von Neutrophilen zu Bakterien 1:30 beträgt (neutrophil: Bakterien). Inkubieren Sie die μ-Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 30 min. Die Anzahl der Bakterienzellen basiert auf der Zellzahl, die aus der Beschichtung eines 18-stündigen Biofilms gewonnen wird.
5. Stellen Sie sich die Neutrophil-Biofilm-Wechselwirkung mit fluoreszierenden Kanälen vor, die den Anregungs- und Emissionswellenlängen der fluoreszierenden Farbstoffe/Proteine entsprechen.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie beträgt BCD 353/466 nm, Ethidiumhomodimer-1 528/617 nm und GFP 395/509 nm. Begrenzen Sie die Exposition der Probe gegenüber dem Laser oder dem Licht, um ein Photobleichen der Proben zu verhindern.
6. Analysieren Sie die Bilder mit Mikroskopie-Bildanalysesoftware oder Programmen wie FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ und BAIT, unter vielen mehr^42,43,44,45.
   HINWEIS: Bei der Arbeit mit Flecken ist es wichtig, die Spezifität der verwendeten Farbstoffe zu berücksichtigen. Einige Färbungen wirken auf prokaryotische und eukaryotische Zellen, während andere nur auf einer funktionieren. Wenn Neutrophile und Biofilme separat mit Farbstoffen gefärbt werden, die beide Zelltypen färben können, stellen Sie sicher, dass Sie den verbleibenden Farbstoff abwaschen, bevor Sie Neutrophile und Biofilme kombinieren, um eine Kreuzfärbung zu verhindern.

Die Medien, mit denen bakterielle Biofilme gezüchtet werden, beeinflussen das Überleben von Neutrophilen. Verschiedene Medien wurden getestet, um die Wirkung von Medien allein auf die Lebensfähigkeit von Neutrophilen für die Untersuchung von Neutrophil-Biofilm-Wechselwirkungen zu reduzieren (Abbildung 1). Bakterielle Wachstumsmedien wie Tryptose-Sojabrühe minimieren die Lebensfähigkeit von Neutrophilen, so dass ~60% der Neutrophilen nach einer 30-minütigen Inkubationszeit bei 37 °C mit 5%CO2 am Leben sind. Säugetierzellkulturmedien wie MEMα haben keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Neutrophilen und unterstützen das Wachstum von S. aureus-Biofilmen. Tatsächlich fördern minimale Medien ein robustes Wachstum von Biofilmen in anderen Bakterien46,47.

Um die Wirkung von Medien auf das Biofilmwachstum und die Variabilität in der Biofilmbiomassequantifizierung nach dem Waschen der Biomasse zur Eliminierung von Planktonzellen zu bewerten, wurde ein 18 h S. aureus-Biofilm in einer 96-Well-Platte gezüchtet, wobei Vertiefungen mit Poly-L-Lysin behandelt oder unbehandelt wurden. Ein nährstoffreiches (Tryptose-Soja-Bouillon (TSB)) und minimales (MEMα) Medium wurde unverändert verwendet oder mit 2% Glukose ergänzt. Die mit CV angefärbte Biofilmbiomasse zeigte, dass der in MEMα mit 2% Glukose angebaute Biofilm S. aureus den robustesten Biofilm unter allen getesteten Medien produzierte (Abbildung 2A). Darüber hinaus zeigten Biofilme, die in PLL-vorbehandelten Vertiefungen mit MEMα + 2% Glukose gezüchtet wurden, eine geringere Variabilität als Biofilme in PLL-unbehandelten Vertiefungen, die MEMα + 2% Glukose enthielten. Diese Biofilme zeigten eine geringere Variabilität in der Quantifizierung mittels CV-Assay35 und der KBE/ml, wenn sie nach präziser Handhabung von Biofilmen für die Biomassequantifizierung plattiert wurden. Diese Biofilme enthielten im Durchschnitt 1 x 108 KBE/ml, wie durch Plattieren der Biofilme in 3 verschiedenen Tagen gezeigt wurde (Abbildung 2B). Diese Zahl ist nützlich, um die Anzahl der Neutrophilen zu bestimmen, die den Biofilmen für Neutrophilen-Funktionstests hinzugefügt werden sollen.

Um die ROS-Produktion von Neutrophilen als Reaktion auf Biofilme zu messen, wurden S. aureus-Biofilme für 18-20 h in einer 96-Well-Platte statisch gezüchtet. Biofilme wurden dann opsonisiert und Neutrophile hinzugefügt. Anschließend wurde die ROS-Produktion 60 Minuten lang gemessen (Abbildung 3A). Die Fläche unter der Kurve wird aus der kinetischen Kurve berechnet, um die gesamte ROS-Produktion durch Neutrophile zu quantifizieren. Neutrophile, die mit einem Agonisten wie PMA behandelt wurden, der als Kontrolle verwendet wird, zeigen eine erhöhte ROS-Produktion. In Abwesenheit von Biofilmen zeigten mit PMA behandelte Neutrophile eine robuste ROS-Produktion. In Gegenwart von S. aureus Biofilm nahm die gesamte ROS-Produktion von Neutrophilen, die mit PMA behandelt wurden, ab. In Abwesenheit von PMA verlassen sich Neutrophile ausschließlich auf ihre Interaktion mit dem Biofilm, wodurch die Menge an produziertem ROS weiter reduziert wird (Abbildung 3B).

Um die Neutrophil-Biofilm-Wechselwirkungen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren, wurde ein GFP-exprimierender Stamm von S. aureus, Blue CMAC Farbstoff und Ethidiumhomodimer-1 verwendet, der das Zytoplasma lebender Zellen bzw. DNA toter Zellen färbt. S. aureus Biofilm wurde für 18 h in einem 6 μ-Kanal-Dia gezüchtet. Blaue CMAC-Farbstoff-markierte Neutrophile wurden zusammen mit Ethidiumhomodimer-1 zu den gewaschenen Biofilmen gegeben und vor der Bildgebung für 30 min bei 37 °C mit 5% CO2 inkubiert. Die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass viele Neutrophile auf der Oberfläche von S. aureus-Biofilmen lokalisiert waren, während sich einige im Biofilm befinden (Abbildung 4A). Die Interaktion zwischen S. aureus-Zellen innerhalb von Neutrophilen war ebenfalls offensichtlich (Abbildung 4C). Die meisten S. aureus-Zellen, die mit Neutrophilen (Cyan) interagieren, waren tot (Magenta), während einige am Leben blieben (gelb), wie durch Lebend-Tot-Färbung bestimmt (Abbildung 4C). Zum Vergleich wurden GFP-exprimierende S. aureus-Biofilme mit Ethidiumhomodimer-1 angefärbt, was einen Bruchteil der toten S. aureus-Population innerhalb des Biofilms zeigte (Abbildung 4B). Nicht lebensfähige Neutrophile, die positiv für Ethidiumhomodimer-1 waren, wurden nach Inkubation mit S. aureus-Biofilmen mittels Analysesoftware (siehe Materialtabelle) quantifiziert. Etwa 48% der Neutrophilen waren bereits innerhalb von 30 Minuten nach der Inkubation mit S. aureus Biofilm tot. Während der Optimierung des Mikroskopieprotokolls wurde auch die Wirkung des Waschens des Biofilms und der Neutrophilen nach 30-minütiger Inkubation zur Entfernung von nicht haftenden Neutrophilen bewertet, wobei etwa 33% der toten Neutrophilen noch am Biofilm gebunden waren (Abbildung 4D).

Abbildung 1: Der LIVE-DEAD-Assay vergleicht das Überleben von Neutrophilen zwischen Bakterien- und Säugetierwachstumsmedien. Neutrophile wurden isoliert und in HBSS, MEMα, TSB oder 0,1% SDS für 30 min inkubiert. Die LIVE-DEAD-Färbung wurde mit Calcein AM (lebend) und Ethidiumhomodimer-1 (tot) durchgeführt. Der Prozentsatz der lebenden Neutrophilen wurde bestimmt, wobei HBSS-inkubierte Neutrophile als 100% lebende Neutrophile behandelt wurden. Die Ergebnisse stellen einen Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten dar, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, wobei Neutrophile von zwei verschiedenen Donatoren gewonnen wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001 dargestellt. Einweg-ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Quantifizierung der Biofilmbiomasse unter verschiedenen Bedingungen und bakterielle Lebensfähigkeit von Biofilmen, die unter den optimierten Bedingungen gezüchtet wurden. (A) S. aureus wurde in einer 96-Well-Platte ausgesät, die entweder mit Poly-L-Lysin (PLL) beschichtet oder unbeschichtet war. Biofilme wurden in TSB, MEMα oder einem der mit 2% Glucose ergänzten Medien unter statischen Bedingungen für 18 h gezüchtet. Kristallviolette (CV) Färbung wurde durchgeführt, um Biofilmbiomasse zu färben. Der eluierte CV-Fleck wurde bei 1:10 verdünnt und in einem Mikrotiterplatten-Reader abgelesen. Die Ergebnisse repräsentieren durchschnittlich drei unabhängige Experimente, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Der SD für jede Gruppe ist unten dargestellt, um die Variabilität verschiedener Biofilmwachstumsbedingungen zu demonstrieren. (B) Bakterielle KBE-Zahlen wurden aus Biofilmen erhalten, die in einem optimierten Medium (MEMα + 2% Glukose) gezüchtet wurden. Die statischen 18-Stunden-Biofilme wurden der gleichen Anzahl von Wäschen unterzogen, gefolgt von einer 10-minütigen Beschallung, um die Biofilmbiomasse zu lösen, und durch eine 22G-Nadel geleitet, um die Aggregate vor der Beschichtung zu stören. Die Ergebnisse repräsentieren drei Replikate, die in dreifacher Ausführung durchgeführt werden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (ns = nicht signifikant) dargestellt. Einweg-ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Quantifizierung der ROS-Produktion durch Neutrophile mittels Chemilumineszenz-Assay. (A) Neutrophile (PMN) wurden mit HBSS-gewaschenen S. aureus-Biofilmen (BF) entweder in Gegenwart (geschlossenes graues Dreieck) oder Abwesenheit (offenes graues umgekehrtes Dreieck) von PMA inkubiert, um die ROS-Produktion durch Neutrophile zu messen. Luminol wurde verwendet, um ROS alle 3 Minuten für 60 Minuten in einem Mikrotiterplatten-Reader zu detektieren. Während Neutrophile, die in Abwesenheit eines Biofilms (geschlossener schwarzer Kreis) mit PMA behandelt wurden, als Positivkontrolle dienten, dienten nur neutrophile (offener schwarzer Kreis) und nur Biofilm (offenes graues Dreieck) Gruppen als Negativkontrollen. Die Daten stellen durchschnittlich zwei unabhängige Experimente dar, die in dreifacher Ausfertigung mit Neutrophilen von zwei verschiedenen Donatoren durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (B) Die Fläche unter der Kurve von (A) wurde berechnet, um die von den Neutrophilen erzeugte Gesamt-ROS zu quantifizieren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (***p < 0,0001. Einweg-ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Visualisierung der Interaktion zwischen S. aureus Biofilm und Neutrophilen mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie. Blaue CMAC-Farbstoff-markierte Neutrophile (Cyan) wurden mit Ethidiumhomodimer-1 (Magenta; tot) ergänzt, bevor sie mit einem 18 h S. aureus-Biofilm (gelb) inkubiert wurden. Biofilm-Neutrophilen-Wechselwirkungen wurden mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und Bilder mit einer Bildanalysesoftware verarbeitet. Die Experimente wurden mit drei verschiedenen Spendern durchgeführt. Repräsentative Bilder werden präsentiert als (A) 3D-Ansicht des S. aureus-Biofilms mit lebenden (cyan) und toten (Magenta; einige mit weißen Pfeilen gekennzeichnet) Neutrophilen, (B) 3D-Ansicht eines S. aureus-Biofilms in Abwesenheit von Neutrophilen mit entweder lebendem S. aureus, das GFP (gelb) oder totes S. aureus exprimiert, gefärbt mit Ethidiumhomodimer-1 (Magenta), (C) eine orthogonale Ansicht von S. aureus und Neutrophilen-Interaktion, dargestellt durch die xy-, yz- und xz-Ebenen, und (D) Quantifizierung der Neutrophilenlebensfähigkeit in Gegenwart von S. aureus-Biofilm nach 30 min entweder sofort (ungewaschen) oder nach drei Waschrunden mit HBSS, um nicht haftende Neutrophile (gewaschen) zu entfernen. Der neutrophile Zelltod wird als mittlerer ± SD (Student's t-Test) dargestellt. Der Maßstabsbalken zeigt 50 μm in (A) und (B) und 10 μm in (C) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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