Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) ermöglicht hochauflösende Bildgebung und hocheffiziente Markierung

Zusammenfassung

Ein Protokoll der Markierungsretentionsexpansionsmikroskopie (LR-ExM) wird demonstriert. LR-ExM verwendet einen neuartigen Satz trifunktionaler Anker, der im Vergleich zu zuvor eingeführten Expansionsmikroskopien eine bessere Markierungseffizienz bietet.

Zusammenfassung

Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist eine Probenvorbereitungstechnik, die mit den meisten lichtmikroskopischen Methoden kombiniert werden kann, um die Auflösung zu erhöhen. Nach dem Einbetten von Zellen oder Geweben in quellbares Hydrogel können die Proben im Vergleich zur ursprünglichen Größe physikalisch um das Drei- bis Sechzehnfache (lineare Dimension) erweitert werden. Daher wird die effektive Auflösung eines Mikroskops um den Expansionsfaktor erhöht. Eine wesentliche Einschränkung des zuvor eingeführten ExM ist die reduzierte Fluoreszenz nach der Polymerisation und dem Aufschlussverfahren. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Markierungs-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Signalverluste verhindert und die Markierungseffizienz mit einer Reihe neuartiger trifunktionaler Anker erheblich verbessert. Diese Technik ermöglicht es, eine höhere Auflösung zu erreichen, wenn zelluläre oder subzelluläre Strukturen im Nanometerbereich mit minimalem Fluoreszenzsignalverlust untersucht werden. LR-ExM kann nicht nur zur Immunfluoreszenzmarkierung, sondern auch mit selbstmarkierenden Proteinmarkierungen wie SNAP- und CLIP-Tags verwendet werden, wodurch eine höhere Markierungseffizienz erreicht wird. Diese Arbeit präsentiert das Verfahren und die Fehlerbehebung für diesen immunfärbungsbasierten Ansatz sowie die Diskussion von selbstmarkierenden Tagging-Ansätzen von LR-ExM als Alternative.

Einleitung

Die Expansionsmikroskopie (ExM) wird von Forschern seit ihrer Einführung als bequemer Ansatz verwendet, um hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen wie Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopen zu erreichen 1,2,3,4,5,6,7 . Mit ExM ist es möglich, auch mit normalen konfokalen Mikroskopen eine laterale Auflösung von ~70 nm zu erreichen. Wenn ExM mit hochauflösender Bildgebung kombiniert wird, wird die Auflösung weiter verbes....

Protokoll

1. Zellkultur

1. Verwenden Sie U2OS-Zellen, die in McCoys 5A-Medium kultiviert wurden, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C in 5%_CO2.
2. Kulturzellen auf ein 16 gut abnehmbares Kammerdeckglas (Kulturfläche 0,4 cm²) für eine einfache Handhabung.

2. Fixierung und Permeabilisierung

HINWEIS: Die Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen hängen von den optimierten Immunfärbungsprotokollen ab. Das Folgende ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungsprotokoll für Co-Immunfärbung von Mikrotubuli und Clathrin-beschichteten Pits (CCPs).

1. Sobal....

Ergebnisse

Clathrin-beschichtete Gruben (CCPs) werden mit trifunktionalen Ankern immungefärbt (Abbildung 1B) und LR-ExM wird wie in Abbildung 1A beschrieben durchgeführt. LR-ExM (Abbildung 2C,E) zeigt eine viel höhere Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Proteinretentionsexpansionsmikroskopie (proExM, Abbildung 2A) oder Biotin-ExM (Abbildung 2B); Das Signal für LR-.......

Diskussion

Die Schlüsselinnovation von LR-ExM besteht darin, trifunktionale Anker zu verwenden, um die Zielproteine effektiv zu markieren und die Bildqualität zu verbessern. Diese Methode wird durch trifunktionale Anker begrenzt, die den Forschern nicht so leicht zur Verfügung stehen. Trifunktionale Anker können jedoch auf Anfrage mit anderen Forschern geteilt werden, und ähnliche Produkte wie ExM-Sonden von Chrometa sind jetzt auch kommerziell erhältlich.

In diesem Protokoll wurde eine 1-stündige Inkuba.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acrylamid	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711– 005-152	Antikörper
AffiniPure Donkey Anti-Ratte IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712– 005-153	Antikörper
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluoreszierende Sonden
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluoreszierende Sonden
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluoreszenzsonden
Ammoniumpersulfat	Sigma	Nr. A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antikörper
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antikörper
DAPI Dilacetat	Thermofisher Scientific	D3571	Fluoreszierende Sonden
DyLight 488 markierte Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluoreszenzsonden
DyLight 594 markierte Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluoreszenzsonden
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixierpuffer
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	EDTA	Aufschlusspuffer
Glutaraldehyd 10% EM Grade	Elektronenmikroskopie Sciences	50-262-13	Verankerung
Grace Bio-Labs CultureWell abnehmbares Deckglas	mit Kammer Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Zellkulturkammer
Grace Bio-Labs CultureWell Entfernungswerkzeug	Grace Bio-Labs	GBL103259	Entfernungswerkzeug
Guanidin HCl	Sigma	G3272	Aufschluss-Puffer
Magnesiumchlorid	Sigma	M8266-1KG	Fixierpuffer
McCoy's 5a	ATCC	30– 2007	Cull-Kulturmedium
Methacrylsäure-N-Hydroxysuccinimidester, 98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Verankerung
monoklonaler Maus-Anti-Nup153-Antikörper	Abcam	ab24700	Antikörper
N,N′ Methylenbisacrylamid	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylendiamin  (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyd Wässrige Lösungen	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	50-980-487	Fixierungspuffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixierungspuffer
Poly-L-Lysin	Sigma	P8920-100ML	Kammerbeschichtung
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Verdauungspuffer
Kaninchen-Anti-Clathrin-Schwerketten-Antikörper	Abcam	ab21679	Antikörper
Ratte Anti– α-Tubulin-Antikörper, tyrosiniert, Klon YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antikörper
Natriumacrylat	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin Blockierungskit	Vector Laboratories	SP-2002	Blockierungspuffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Aufschluss-Puffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Zelllinie
6 Well Glasbodenplatten	Cellvis	P06-1.5H-N	Speicherfolie