Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) ermöglicht hochauflösende Bildgebung und hocheffiziente Markierung

Die Expansionsmikroskopie (ExM) wird von Forschern seit ihrer Einführung als bequemer Ansatz verwendet, um hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen wie Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopen zu erreichen 1,2,3,4,5,6,7 . Mit ExM ist es möglich, auch mit normalen konfokalen Mikroskopen eine laterale Auflösung von ~70 nm zu erreichen. Wenn ExM mit hochauflösender Bildgebung kombiniert wird, wird die Auflösung weiter verbessert. Zum Beispiel kann man mit der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) eine Auflösung von etwa 30 nm und mit der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (^{STORM) eine} Auflösung von etwa 4 nm erreichen1,5.

Die geringe Etikettiereffizienz ist jedoch bei Standard-ExM-Methoden ein kritisches Problem. Der Fluoreszenzverlust kann je nach Art der Fluoreszenzgruppen und Aufschlusszeit variieren. Im Durchschnitt wurde jedoch berichtet, dass mehr als 50% der Fluorophore nach der Polymerisation und den Proteinverdauungsschritten von ExM verloren gehen, was sich nachteilig auf die Bildqualität auswirkt ^3,4.

So wurde die Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Etiketten effizient zurückhalten und Signalverluste reduzieren kann¹. Die Schlüsselinnovation von LR-ExM ist die Verwendung eines Satzes von trifunktionalen Ankern anstelle von Fluoreszenzfarbstoffen - wie im Standard-ExM-Verfahren - zur Färbung von Proteinen von Interesse. Diese trifunktionalen Linker bestehen aus drei Teilen: (1) dem Konnektor (z. B. N-Hydroxysuccinimid (NHS)) zur Verbindung mit dem Antikörper, (2) dem Anker (z. B. Methacrylamid (MA)) zur Verankerung von Proteinen im Polymer und (3) dem Reporter (z. B. Biotin oder Digoxigenin (DIG)) zur Konjugierung mit einem organischen Farbstoff. Die trifunktionellen Anker überleben die Polymerisations- und Proteinverdauungsschritte und verhindern so den Verlust von Fluorophoren.

Darüber hinaus birgt diese Methode großes Potenzial, da sie mit selbstmarkierenden enzymatischen Tags wie SNAP oder CLIP kompatibel ist. Enzymatische Tag-Ansätze haben einige Vorteile gegenüber dem Immunfärbungsansatz in Bezug auf hohe Spezifität und Markierungseffizienz 8,9,10.

In diesem Manuskript wird eine detaillierte Vorgehensweise von LR-ExM demonstriert. LR-ExM ist eine hocheffektive und flexible Methode, um eine hohe räumliche Auflösung bei verbesserter Beschriftungseffizienz zu erreichen.

1. Zellkultur

1. Verwenden Sie U2OS-Zellen, die in McCoys 5A-Medium kultiviert wurden, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C in 5%_CO2.
2. Kulturzellen auf ein 16 gut abnehmbares Kammerdeckglas (Kulturfläche 0,4 cm²) für eine einfache Handhabung.

2. Fixierung und Permeabilisierung

HINWEIS: Die Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen hängen von den optimierten Immunfärbungsprotokollen ab. Das Folgende ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungsprotokoll für Co-Immunfärbung von Mikrotubuli und Clathrin-beschichteten Pits (CCPs).

1. Sobald die Zellzahl ~0,04 x 10⁶ erreicht, fixieren Sie die Zellen mit 100 μL 3,2% Paraformaldehyd (PFA) im PEM-Puffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA und 1 mM MgCl₂, pH 6,9) für 10 min bei Raumtemperatur (Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Fixierung mit PFA erfolgt in einer zertifizierten Sicherheitshaube.
2. Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Permeabilisieren Sie Zellen mit dem 100 μL Permeabilisierungspuffer bei Raumtemperatur für 15 min (Tabelle 1).
   HINWEIS: Fahren Sie so schnell wie möglich mit der Markierung fort, um den Abbau von Zielproteinen, RNA oder DNA zu vermeiden und ein optimales Ergebnis zu erzielen. Bei Bedarf können jedoch feste Proben für eine längere Zeit (bis zu einem Monat) in einem PBS-Puffer bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie verdampftes PBS und schützen Sie die Probe vor Photobleiche.

3. Endogene Streptavidin- und Biotinblockierung

1. Inkubieren Sie die Zellen mit der in einem Zellblockierungspuffer (100 μL) verdünnten Streptavidinlösung für 15 min bei Raumtemperatur (Tabelle 1).
2. Spülen Sie kurz mit 200 μL Zellblockerpuffer ab.
3. Inkubieren Sie Zellen mit 100 μL Biotinlösung, verdünnt in einem Zellblockierpuffer für 15 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Wenn Sie einen selbstbeschriftenden Tagging-Ansatz verwenden, z. B. SNAP- oder CLIP-Tags, überspringen Sie Schritt 4 und fahren Sie mit Schritt 5.1: Selbstbeschriftungs-Tagging-Ansatz fort.

4. Primäre Antikörperfärbung

1. Inkubieren Sie Zellen mit Ratten-Anti-α-Tubulin-Antikörper (1:500 Verdünnung) und Kaninchen-Anti-Clathrin-Schwerkettenantikörper (1:100 Verdünnung) in 100 μL Zellblockierpuffer für 16 h bei 4 °C oder 1 h bei Raumtemperatur. Verdoppeln Sie die Inkubationszeit für die Gewebeproben.
2. Waschen Sie die Proben viermal mit 200 μL PBS für jeweils 5 Minuten.

5. LR-ExM-spezifische sekundäre Antikörperfärbung

1. Konjugierte IgG-Antikörper mit den trifunktionellen Linkern wie N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Methacrylamid (MA)-Biotin oder NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Abbildung 1B). Die Synthese von trifunktionellen Ankern und die Konjugation der sekundären Antikörper wurden bereits in Shi et ^al.1 eingeführt. Selbstmarkierender Tagging-Ansatz: Konjugierte IgG-Antikörper mit den trifunktionellen Linkern, wie MA-Benzylguanin (BG)-Biotin oder MA-Benzylcytosin (BC)-Dig (Abbildung 1B). Die Synthese von trifunktionellen Ankern und eine Konjugation der sekundären Antikörper wurden zuvor in Shi et ^al.1 eingeführt.
2. Inkubieren Sie Zellen mit den sekundären Antikörpern Esel-Anti-Kaninchen-Dig-MA (1:100 Verdünnung) und Esel-Anti-Ratten-Biotin-MA (1:100 Verdünnung) in 100 μL Zellblockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur. Verdoppeln Sie diese Inkubationszeit für die Gewebeproben.
3. Waschen Sie die Proben viermal in 200 μL PBS für jeweils 5 Minuten.

6. Zusätzliche Verankerung

1. Zellen mit 0,25% Glutaraldehyd (GA) in PBS (100 μL) für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Proteine auf dem Hydrogel zu verankern. Alternativ können 25 mM Methacrylsäure-N-hydroxysuccinimidester (MA-NHS) zur Verankerung verwendet werden. Eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur wird empfohlen.
2. Waschen Sie die Proben dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.

7. Gelierung

HINWEIS: Die Ausdehnungsgeschwindigkeit wird durch die Diffusionszeit von Salz und Wasser aus oder in das Gel bestimmt; So beschleunigt das Gießen dünner Gele die Expansionszeit.

1. Entfernen Sie die obere Struktur der 16-Well-Gelplatte. Fügen Sie 40 μL Monomerlösung in jede Vertiefung hinzu, um die Zellen auf Eis zu konditionieren. Auf Eis 5 min inkubieren.
   1. Informationen zur Herstellung einer Monomerlösung finden Sie in Tabelle 2.
2. Bereiten Sie die Gelierlösung auf Eis vor. Fügen Sie der Monomerlösung doppelt destilliertes Wasser und 10% N,N,N′,N′ Tetramethylethylendiamin (TEMED)-Beschleuniger hinzu (10% TEMED: Monomerlösung = 1:47); Fügen Sie den Initiator noch nicht hinzu (Tabelle 3).
3. Für eine Zellkulturkammer mit einer Fläche von 0,4^cm2 verwenden Sie ein Gelationslösungsvolumen von etwa 40 μL. Bereiten Sie 45 μL Gelationslösung für jede Vertiefung vor.
4. 10% Ammoniumpersulfat (APS) in die Gelierlösung geben, auf Eis inkubieren und sofort 40 μL Gelierlösung in jede Silikondichtung auf Eis pipettieren. Auf Eis 3 min inkubieren (10% APS:10% TEMED:Monomerlösung = 1:1:47).
5. Schützen Sie die Probe vor Licht und bewegen Sie das Deckglas in der 10 cm Petrischale für 1,5 h zur Gelierung in einen 37 °C Inkubator. Um die Feuchtigkeit des Gels während der 37 °C Inkubation zu halten, decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und geben Sie einige Tropfen Wasser in die Petrischale.

8. Verdauung

1. Entfernen Sie nach der Gelierung das Glas, um das Gel zu trennen, und übertragen Sie das Gel auf die 6-Well-Platte. Aufschluss eingebetteter Zellen mit 2 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 1) über Nacht bei Raumtemperatur oder 4 h bei 37 °C. Verwenden Sie mindestens das 10-fache überschüssige Volumen des Verdauungspuffers.
2. Waschen Sie Gele mit mindestens einem 10-fachen überschüssigen Wasservolumen als das endgültige Gelvolumen. Wiederholen Sie den Waschschritt viermal für jeweils 20 bis 30 Minuten. Das Gel dehnt sich in jeder Dimension um etwa das Zweifache aus.
   HINWEIS: Gelproben können bis zu 1 Monat in einem PBS-Puffer bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie verdampftes Wasser, um ein Austrocknen zu vermeiden, und schützen Sie die Probe während der Lagerung vor Licht. Um einen Abbau von trifunktionalen Ankern zu vermeiden, sollten die Proben so schnell wie möglich nach dem Aufschluss und Waschen gefärbt werden.

9. Fluoreszenzfärbung nach der Verdauung

1. Inkubieren Sie Gele in 2 ml Volumen Streptavidin (STV)/Digoxigenin (DIG) Färbepuffer mit 2 bis 5 μM STV-Farbstoff und/oder Anti-DIG-Farbstoff für 24 h bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Proben im Dunkeln auf.

10. Erweiterung

1. Waschen und expandieren Sie das Gel viermal mit überschüssigem Wasser (2-3 ml) für jeweils 30 min bis 1 h.
2. Zur leichteren Visualisierung von Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie färben Sie Zellen während der dritten der fünf Waschgänge mit DAPI. Verdünnte DAPI-Stammkonzentration (5 mg/ml, gelagert bei 4 °C) in 1:5.000 Verdünnungen in Waschwasser. Inkubieren Sie das Gel mit einer DAPI-Wasserlösung (2 ml) für 30 min bis 1 h.
3. Zwei weitere Male mit 3 ml Wasser waschen.
4. Expandieren Sie Gele in jeder flachen Schale, die groß genug ist, um die Proben aufzunehmen. Die expandierten Gele, die auf 0,4 cm 2-Flächen-Deckglas hergestellt werden, passen gut in eine 6-Well-Platte mit Glasboden.
   HINWEIS: Nachexpansionsgefärbte Proben können bis zu 4 Monate in einem PBS-Puffer bei 4° C gelagert werden. Fügen Sie genügend Wasser hinzu, um ein Austrocknen zu vermeiden und die Probe vor Photobleiche zu schützen. Wiederholen Sie den Erweiterungs- und DAPI-Färbeschritt vor der Bildgebung. Um jegliches Risiko eines Fluorophorabbaus zu vermeiden, müssen die Proben so schnell wie möglich abgebildet werden.

11. Bildgebung

1. Beschichten Sie die 6-Well-Glasboden-Bildgebungskammer mit 0,01% Poly-L-Lysin (je 3 ml), um die Gelproben zu immobilisieren.
2. Gelproben in die beschichtete Bildgebungskammer überführen.
3. Bilden Sie die Proben mit den gewünschten Fluoreszenzbereichen ab.

Clathrin-beschichtete Gruben (CCPs) werden mit trifunktionalen Ankern immungefärbt (Abbildung 1B) und LR-ExM wird wie in Abbildung 1A beschrieben durchgeführt. LR-ExM (Abbildung 2C,E) zeigt eine viel höhere Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Proteinretentionsexpansionsmikroskopie (proExM, Abbildung 2A) oder Biotin-ExM (Abbildung 2B); Das Signal für LR-ExM war etwa sechsmal höher als für proExM (Abbildung 2D). LR-ExM kann kleine Strukturen wie CCPs effektiv erfassen, die sogar kleiner als die Beugungsgrenze sind (Abbildung 2F,G).

Einige repräsentative Ergebnisse von LR-ExM werden mit dem Immunfärbungsansatz gezeigt. Mikrotubuli und CCPs werden mit trifunktionalen Ankern, einschließlich NHS-MA-DIG und NHS-MA-Biotin, co-immunofärbt (Abbildung 3A,B). LR-ExM ist für den enzymatischen Tag-basierten Ansatz verfügbar. Das Ergebnis wird anhand der trifunktionalen Anker BG-MA-biotin (für SNAP-Tag) und BC-MA-DIG (für CLIP-Tag) in Abbildung 3C-F demonstriert. Darüber hinaus kann man sowohl die Immunfärbung als auch den Protein-Tag-Ansatz in LR-ExM kombinieren, wie in Abbildung 3G-J gezeigt. Aus diesen Ergebnissen wird bestätigt, dass LR-ExM vorteilhaft ist, um qualitativ hochwertige Bilder mit verbesserter Etikettiereffizienz und Auflösung zu erhalten.

LR-ExM zeigt auch in Gewebeproben eine hervorragende Leistung. LR-ExM wird am Hirngewebe der Maus durch Co-Immunfärbung des präsynaptischen Markers Fagotts und des postsynaptischen Markers Homer1 durchgeführt. Die beiden Etiketten sind klar und gut getrennt, was eine hohe Auflösung und Beschriftungseffizienz unterstützt (Abbildung 4A-E).

Abbildung 1: Workflow der Etikettenretentionsexpansionsmikroskopie (LR-ExM). (a) Arbeitsablauf von LR-ExM. (B) Schematische Darstellung der trifunktionalen Anker. Diese Zahl wurde von Shi et al.1 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Quantifizierung von Signalretentionsmikroskopie (A-C) Expansion Microscopy (ExM) konfokalen Bildern von Clathrin-beschichteten Gruben (CCPs) in U2OS-Zellen, die indirekt für Clathrin Heavy-Chain (POI) immungefärbt wurden. (A) Protein-retention ExM (ProExM) unter Verwendung von AF488-konjugierten sekundären Antikörpern. (B) ExM mit Post-Expansion-Markierung unter Verwendung von Biotin-konjugierten Antikörpern. (C) LR-ExM unter Verwendung von Antikörpern, die mit trifunktionellen NHS-MA-Biotin-Ankern konjugiert sind. Proben in B und C werden nach der Expansion mit Streptavidin-AF488 angefärbt. (D) Intensitätsquantifizierung von A-C. Fehlerbalken stellen SD dar. n = 3 für jeden Fall. Die Längenerweiterungsverhältnisse für Bilder in A, B, C und E-G betragen 4,3, 4,5, 4,6 bzw. 4,3. Das Längenausdehnungsverhältnis für die in Diagramm D verwendeten Proben beträgt 4,5 ± 0,2. Maßstabsbalken, 500 nm (A-C und E) und 100 nm (F und G). Alle Maßstabsbalken befinden sich in Vorexpansionseinheiten. Arb. u., beliebige Einheiten; STV, Streptavidin. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop (Nikon CSU-W1) mit einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv (NA1.27) aufgenommen. Diese Zahl wurde von Shi et al.1 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse von LR-ExM mit konfokalen Mikroskopen. (A,B) LR-ExM konfokale Bilder von Mikrotubuli, markiert mit NHS-MA-Biotin-konjugierten sekundären Antikörpern (Magenta) und CCPs, markiert mit NHS-MA-DIG-konjugierten sekundären Antikörpern (grün) in einer U2OS-Zelle. (B) Vergrößerte Ansicht. (C-F) LR-ExM konfokale Bilder von CCPs und/oder Mitochondrien in HeLa-Zellen, die mit dem Protein-Tag-Ansatz markiert wurden (C) SNAP-Tag-markiertes Clathrin, (D) CLIP-Tag-markiertes TOMM20 und (E) zweifarbige Bildgebung. (F) Vergrößerte Ansicht. (G) Zweifarbige konfokale LR-ExM-Bilder mit einer Kombination aus Immunfärbungsansatz (NPC, rot heiß) und Protein-Tag-Ansatz (SNAP-markiertes Lamin A / C (Cyan)). (H) Vergrößerte Ansicht. (I,J) Ansichten einzelner Kanäle von H. Beachten Sie, dass der zytoplasmatische Hintergrund in G durch den Anti-NUP153-Antikörper verursacht wird. Das Längenerweiterungsverhältnis für Bilder in A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 und G-J beträgt 4,5. Maßstabsbalken, 1 μm für A, 200 nm für B und F, 500 nm für C-E, 2 μm für G und 500 nm für H, I und J. Alle Maßstabsbalken befinden sich in Vorexpansionseinheiten. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop (Nikon CSU-W1) mit einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv (NA1.27) aufgenommen. Diese Zahl wurde von Shi et al.1 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von LR-ExM an Gewebeproben. (A) LR-ExM konfokales Bild eines Maushirnschnitts, indirekt immungefärbt für den präsynaptischen Marker Fagott (Magenta) und den postsynaptischen Marker Homer1 (grün). (B,C) Vergrößerte Bilder von Synapsen. (D,E) Transversale Intensitätsprofile entlang der gelben Kastenlängsachsen. Fagott ist mit NHS-MA-DIG-konjugierten sekundären Antikörpern markiert, und Homer1 ist mit NHS-MA-Biotin-konjugierten sekundären Antikörpern markiert. Alle Proben werden nach der Expansion mit Streptavindin-AF488 und/oder Anti-Digoxin-AF594 gefärbt. Die Längenerweiterungsverhältnisse für Bilder in A-C betragen 4,2. Maßstabsbalken, 1 μm (A) und 200 nm (B,C). Alle Maßstabsbalken befinden sich in Vorexpansionseinheiten. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop (Nikon CSU-W1) mit einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv (NA1.27) aufgenommen. Diese Zahl wurde von Shi et al.1 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Chemikalien und Puffer Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Monomerlösung Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Gelierlösung Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.