Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.
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Methodenartikel
Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während der Entwicklung von Wirbeltieren wandern Neuralleistenzellen (NCCs) ausgiebig und differenzieren sich in verschiedene Zelltypen, die zu Strukturen wie dem kraniofazialen Skelett und dem peripheren Nervensystem beitragen. Während es wichtig ist, die NCC-Migration im Kontext eines 3D-Embryos zu verstehen, erleichtert die Isolierung wandernder Zellen in 2D-Kultur die Visualisierung und funktionelle Charakterisierung und ergänzt embryonale Studien. Das vorliegende Protokoll demonstriert eine Methode zur Isolierung von Schädelfalten von Küken, um primäre NCC-Kulturen zu erzeugen. Wandernde NCCs entstehen aus neuronalen Faltenexplantaten, die auf einem fibronektinbeschichteten Substrat plattiert sind. Dies führt zu verstreuten, adhärenten NCC-Populationen, die durch Färbung und quantitative morphologische Analysen beurteilt werden können. Dieser vereinfachte Kulturansatz ist sehr anpassungsfähig und kann mit anderen Techniken kombiniert werden. Zum Beispiel können NCC-Auswanderung und Migrationsverhalten durch Zeitraffer-Bildgebung ausgewertet oder funktionell abgefragt werden, indem Inhibitoren oder experimentelle Manipulationen der Genexpression (z. B. DNA-, Morpholino- oder CRISPR-Elektroporation) einbezogen werden. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit bietet diese Methode ein leistungsfähiges System zur Untersuchung der kranialen NCC-Entwicklung.
Einleitung
Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine vorübergehende Zellpopulation in Wirbeltierembryonen. NCCs werden an den Grenzen der Neuralplatte spezifiziert und durchlaufen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT), um aus dem dorsalen Neuralrohr1 zu wandern. Nach EMT verteilen sich NCCs weitgehend im gesamten Embryo und differenzieren und tragen letztendlich zu verschiedenen Strukturen bei, einschließlich des kraniofazialen Skeletts, des Ausflusstrakts des Herzens und des größten Teils des peripheren Nervensystems2. Veränderungen der Zellpolarität, des Zytoskeletts und der Adhäsionseigenschaften liegen dieser Verschiebu....
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Protokoll
Jede Vielzahl von Gallus gallus-Rassen kann verwendet werden, einschließlich White Leghorn, Golden Sex Link oder Rhode Island Red. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Hühnereier stammten aus verschiedenen Rassen und stammten aus verschiedenen Quellen, einschließlich lokaler Bauernhöfe und Brütereien.
1. Herstellung von Lösungen und Materialien
- Die Ringer-Lösung wird durch Mischen von 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 und 0,147 mM KH2PO4 hergestellt (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den pH-Wert auf ....
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Ergebnisse
Eine Übersicht über das aktuelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Die bebrüteten Eier wurden geöffnet, und das Eigelb mit dem Embryo auf der Oberfläche wurde isoliert, indem es vorsichtig in die Handfläche einer behandschuhten Hand gegossen wurde (Abbildung 2A, B). Nach dem Entfernen des Albumins (Abbildung 2C) wurden Filterpapierrahmen auf die Dottermembran aufgebracht, die den Embryo umgibt, um das Schneiden und Anheben des Embryos au.......
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Diskussion
Die hier beschriebene Technik bietet eine anpassungsfähige Methode, um neuronale Kükenfalten zu isolieren und zu plattieren, um Kulturen von wandernden kranialen NCCs zu erzeugen. Diese Kulturen bieten vereinfachte 2D-Bedingungen für eine einfache Analyse der NCC-Migration und -Morphologie von Küken, die technisch anspruchsvollere Ovo-Bildgebungsverfahren ergänzen können24,25,26. Während diese In-vitro-Methode .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Corinne A. Fairchild und Katie L. Vermillion, die an der Entwicklung unserer Version des Chick Cranial Neural Fold Culture Protocol beteiligt waren.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AxioObserver ausgestattet mit einem konfokalen Scankopf LSM710, der von der Software ZEN 3.0 SR gesteuert wird | Zeiss | Gebrauchtes alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Öl DIC M27 Objektiv | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Kammerschalen (Glasboden, einzeln oder geteilt) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) | Einkammer 35 mm oder 4 Kammer 35 mm |
| Deckglas | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | Kreise, 0,13– 0,17 mm Dicke, erhältlich in 12-25 mm Durchmesser |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative für L15 Medien |
| Brutkasten | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronektin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filterpapier | Whatman | Grad 3MM | |
| Chromatographie Pinzette (stumpf) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fischer); 1141W97 (Thomas) | |
| Pinzette (fein) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Kostenlose Bildanalysesoftware | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 Medien | Invitrogen | 11415064 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030 | |
| Eindeckmedien (Vectashield oder ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10.000 Einheiten/ml Penicillin; 10.000 mg/ml Streptomycin |
| Petrischalen | VWR (oder ähnlich) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | mehrere Flurophore verfügbar |
| Pinhalter | Fine Science Tools | 26016-12 | Für Wolframnadel (Alternative für Federschere) |
| Schere (Präparierung) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Federschere | Fine Science Tools | 15000-08 | 2,5 mm Schneide (Alternative für Wolframnadel) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Spritzenvorsatzfilter | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Spritzenvorsatzfiltereinheit, 0,22 & Mikro; m, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert |
| Gewebekulturschalen | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm Kulturschalen für Bulk-Neuralfaltenkulturen |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Wolframdraht | Vielzahl von Quellen | 0,01" Durchmesser für Wolframnadel (Alternative für Federschere) |
Referenzen
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
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Nachdrucke und Genehmigungen
