Bewertung der photosynthetischen Effizienz in photorespiratorischen Mutanten mittels Chlorophyllfluoreszenzanalyse

Abiotische Stressbedingungen, die häufig auf den Feldern von Landwirten auftreten, können sich negativ auf die Ernteerträge auswirken, indem sie die photosynthetische Effizienz verringern. Schädliche Umweltbedingungen wie Hitzewellen, Klimawandel, Dürre und Bodensalzgehalt können abiotische Belastungen verursachen, die die Verfügbarkeit von CO₂ verändern und die Reaktion einer Pflanze auf hohen Lichtstress verringern. Die beiden größten terrestrischen Kohlenstoffflüsse sind Photosynthese und Photorespiration, die für das Pflanzenwachstum und die Ernteerträge unerlässlich sind. Viele der wichtigen Proteine und Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wurden unter Laborbedingungen charakterisiert und auf genetischer Ebene^{identifiziert 1}. Obwohl große Fortschritte beim Verständnis der Photosynthese und Photorespiration erzielt wurden, bleiben viele Schritte, einschließlich des Transports zwischen Pflanzenorganellen, uncharakterisiert ^2,3.

Die Photorespiration, der zweitgrößte Kohlenstofffluss in Pflanzen nach der Photosynthese, beginnt, wenn das Enzym Rubisco Sauerstoff anstelle von Kohlendioxid zu Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) fixiert und die hemmende Verbindung 2-Phosphoglycolat (2PG)¹ erzeugt. Um die hemmende Wirkung von 2PG zu minimieren und den zuvor gebundenen Kohlenstoff zu recyceln, haben C3-Pflanzen den multiorganellaren Prozess der Photorespiration entwickelt. Die Photorespiration wandelt zwei Moleküle von 2PG in ein Molekül 3-Phosphoglycerat (3PGA) um, das wieder in den C3-Kohlenstofffixierungszyklus^{eintreten kann 1}. So wandelt die Photorespiration nur 75% des zuvor fixierten Kohlenstoffs aus der Erzeugung von 2PG um und verbraucht dabei ATP. Infolgedessen ist der Prozess der Photorespiration eine signifikante Belastung des photosynthetischen Prozesses von 10% -50%, abhängig von der Wasserverfügbarkeit und den Temperaturen in der Vegetationsperiode⁴.

Die an der Photorespiration beteiligten Enzyme sind seit Jahrzehnten ein Forschungsschwerpunkt, aber nur wenige Transportproteine wurden auf genetischer Ebene charakterisiert, obwohl mindestens 25 Transportschritte am Prozess beteiligt sind ^5,6,7. Die beiden Transportproteine, die direkt an der Bewegung des bei der Photorespiration erzeugten Kohlenstoffs beteiligt sind, sind der plastidische Glykolat/Glycerat-Transporter PLGG1 und der Gallensäure-Natriumsymporter BASS6, die beide am Export von Glykolat aus dem Chloroplasten ^5,6 beteiligt sind.

Unter Umgebungstemperatur [CO₂] fixiert Rubisco ein Sauerstoffmolekül in etwa 20% der Fälle an RuBP¹. Wenn Pflanzen niedrigem [CO 2] ausgesetzt sind, steigt die Photorespirationsrate, was ein niedriges [CO₂] zu einer idealen Umgebung macht, um auf Mutanten zu testen, die unter erhöhtem Photorespirationsstress wichtig sein können. Das Testen zusätzlicher mutmaßlicher Chloroplasten-Transportprotein-T-DNA-Linien unter niedrigem_CO2 für 24 h und die Messung von Veränderungen der Chlorophyllfluoreszenz führten zur Identifizierung von bass6-1-Pflanzenlinien, die einen Photorespirationsmutanten-Phänotyp⁵ zeigten. Eine weitere Charakterisierung zeigte, dass BASS6 ein Glykolattransporter in der inneren Membran des Chloroplasten ist.

Dieser Artikel beschreibt detailliert ein Protokoll, das dem ähnelt, das ursprünglich zur Identifizierung von BASS6 als Photorespirationstransporter verwendet wurde, das aus einer Liste mutmaßlicher Transportproteine stammt, die sich innerhalb der Chloroplastenmembran befinden⁸ Dieses Protokoll kann in einem Hochdurchsatzexperiment zur Charakterisierung von Arabidopsis-T-DNA-Mutanten oder EMS-generierten mutierten Pflanzen verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der photosynthetischen Effizienz unter einer Reihe von abiotischen Belastungen wie Hitze wichtig sind. hohe Lichtbelastung, Trockenheit und CO₂ -Verfügbarkeit. Das Screening von Pflanzenmutanten mittels Chlorophyllfluoreszenz wurde in der Vergangenheit verwendet, um schnell Gene zu identifizieren, die für den Primärstoffwechsel wichtig^{sind 9}. Da bis zu 30% des Arabidopsis-Genoms Gene enthalten, die für Proteine mit unbekannter oder schlecht charakterisierter Funktion kodieren, könnte die stressinduzierte Analyse der photosynthetischen Effizienz Einblicke in molekulare Funktionen geben, die unter kontrollierten Bedingungen in mutierten Pflanzen nicht beobachtet werden¹⁰. Ziel dieser Methode ist es, Mutanten des photorespiratorischen Weges mittels eines_CO2-armen Screenings zu identifizieren. Wir stellen eine Methode vor, um Mutanten zu identifizieren, die die Photorespiration nach Exposition gegenüber niedrigem_CO2 stören. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es sich um ein Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge handelt, das in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann. Die Videoprotokollabschnitte enthalten Details zur Saatgutvorbereitung und -sterilisation, zum Pflanzenwachstum und zur Behandlung mit niedrigem_CO2-Wert , zur Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems, zur Messung der Quantenausbeute der behandelten Proben, zu repräsentativen Ergebnissen und zu Schlussfolgerungen.

1. Saatgutaufbereitung und Sterilisation

HINWEIS: Die Saatgutvorbereitung besteht aus Saatgutaufnahme und Saatgutsterilisation. Es ist wichtig zu beachten, dass alle diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden müssen, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Alle notwendigen Materialien, Reagenzien und Wachstumsmedien müssen autoklaviert werden (siehe Materialtabelle).

1. Saatgutaufnahme und -schichtung
   HINWEIS: Die verwendeten Seed-Linien sind plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) und Wildtyp (WT, Col-0).
   1. Geben Sie die Samen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Samen in sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube aufnehmen und bei 4 °C bei Dunkelheit für 2 Tage schichten.
2. Saatgutsterilisation
   1. Unter sterilen Bedingungen 10 ml 50% (v/v) Bleichlösung vorbereiten und etwa 20 μL Tween 20 hinzufügen. Für die Saatgutsterilisation Wasser aus den aufgenommenen Samen entfernen, 1 ml Bleichlösung in die Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
   2. Entfernen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette.
   3. Spülen Sie die Samen in 1 ml sterilem Wasser ab, um sie zu resuspendieren. Entfernen Sie das Wasser, sobald sich die Samen auf dem Boden abgesetzt haben. Wiederholen Sie Schritt 1.6 und Schritt 1.7 siebenmal.
   4. Resuspendieren Sie die Samen in steriler 0,1% iger Agaroselösung.
3. Saatgutbeschichtung
   1. Machen Sie ein 1 L Volumen Murashige & Skoog Basal Medium mit Vitaminen und 1,0 g / L 2-(N-morphonio) ethansulfonsäure (MS), indem Sie 5,43 g des Pulvers zu 500 ml destilliertem Wasser geben. Stellen Sie den pH-Wert zwischen 5,6 und 5,8 mit Kaliumhydroxid (KOH) ein. Mit destilliertem Wasser auf 1 L füllen.
      1. Die flüssige Lösung wird in 500 ml aufgeteilt und jeweils zur Hälfte in einen 1-l-Kolben gegeben, der einen magnetischen Rührstab enthält. Man fügt 5 g Agarpulver hinzu, um für jeden Kolben eine 1%ige Agarw/v-Lösung zu erhalten.
      2. Autoklav bei 121 °C und 15 psi für 30 min; Dann unter langsamem Rühren bei Raumtemperatur platzieren. Nach dem Abkühlen 25 ml MS-Agar in eine quadratische Petrischale gießen. Lassen Sie es erstarren.
         HINWEIS: Diese Murashige & Skoog Basal Medium Platten enthalten 1% MS-Medium mit Vitaminen und 1% Agar für die Kultivierung der Testmutanten.
   2. Schneiden Sie eine 200 μL Pipettenspitze mit einer Rasierklinge ab. Platzieren Sie einen Samen in der Mitte des vorgesehenen quadratischen Gitters für jede Testmutante oder jeden Genotyp (1 cm² Quadrat) einer quadratischen MS-Platte (Abbildung 1) mit einer 200 μL Mikropipette.
      HINWEIS: Das quadratische Raster von 1 cm x 1 cm hilft, einen gleichmäßigen Abstand zwischen den Sämlingen einzuhalten und Überlappungen zu vermeiden, was bei der späteren Fluoreszenzbildgebung und -analyse wichtig sein wird.
   3. Sobald die Samen plattiert sind, wickeln Sie sie mit chirurgischem Klebeband um den Deckel, um ihn zu versiegeln, und legen Sie ihn unter den unten beschriebenen Bedingungen in die Wachstumskammer.

2. Pflanzenwachstum und_CO2-arme Behandlung

1. Wachsen Sie die Pflanzen für 7-9 Tage bei 20 °C unter einem 8 h Lichtzyklus von 120 μmol·m⁻²s⁻¹ und 16 h Dunkelheit bei 18 °C. Überprüfen Sie die Pflanzen am 6. Tag, um festzustellen, ob sie groß genug für die Bildgebung sind. Am 8. Tag nach der Beschichtung setzen Sie die Pflanzen einem niedrigen CO₂ aus.
2. Niedrige CO₂ -Behandlung
   1. Nach den 7-9 Tagen werden vier der acht Platten aus den Bedingungen der Umgebungswachstumskammer in photorespiratorische Bedingungen von 20 °C, Dauerlichtstärken von 200 μmol·m−2 s⁻¹ und niedrigem CO₂ für ¹²h gelegt.
   2. Konstruieren Sie den niedrigen CO_2-Zustand mit einem luftdichten transparenten Behälter mit 100 g Kalknatron, der im Boden des Behälters platziert ist. Stellen Sie den Behälter in dieselbe Wachstumskammer wie die Steuerung. Halten Sie die Kontrollanlagen 12 h lang unter 120 μmol·m−2 s⁻¹ in ^CO2Umgebungstemperatur.

3. Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems

1. Legen Sie eine Prüfplatte (vorbereitet nach Abschnitt 1 und Abschnitt 2) zentriert unter der Kamera in einem festen Abstand in das Fluoreszenzbildgebungssystem.
2. Navigieren Sie in der Gerätesoftware zum Live-Fenster und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Blitze , um nicht-aktinische Messblitze einzuschalten.
3. Klicken Sie auf die Zoom - und Fokuswerkzeuge , bis ein vollständiges und scharfes Bild sichtbar ist. Verwenden Sie dazu eine Bühne oder ein Regal, um den Abstand zwischen den Pflanzen und der Kamera einzustellen. Halten Sie den Zoom, den Fokus und den Abstand zur Kamera während des gesamten Experiments konstant.
4. Stellen Sie den Wert von El. Shutter auf 0 ein und stellen Sie die Empfindlichkeit ein, um ein Fluoreszenzsignal im Bereich von 200-500 digitalen Einheiten zu erhalten.
   HINWEIS: Ein niedrigerer El. Shutter-Wert (0-1) stellt sicher, dass die Messblitze nicht aktinisch sind, während ein höherer Wert (2) die Auflösung des Bildes verbessert.
5. Stellen Sie einen Belichtungsmesser in die gleiche Position, die zum Anpassen der Kameraeinstellungen verwendet wurde.
6. Aktivieren Sie im Live-Fenster das Kontrollkästchen Super , um einen Sättigungsimpuls von 800 ms zu starten. Denken Sie daran, das Kontrollkästchen jedes Mal für einen neuen Impuls anzukreuzen.
7. Verwenden Sie den Schieberegler, um den Prozentsatz der relativen Leistung für den Superpuls anzupassen, bis der Belichtungsmesser 6.000-8.000 μmol·m−²s⁻¹ anzeigt.

4. Entwerfen Sie das Quantenausbeuteprogramm

1. Importieren Sie Standardbetriebswerkzeuge für das Imaging-System.
   default.inc einschließen
   Light.inc einschließen
   HINWEIS: Die Programmsyntax, die in diesem Experiment als Referenz verwendet wird, gilt für ein FluorCam-Bildgebungssystem.
2. Definieren Sie die folgenden globalen Variablen entsprechend den konfigurierten Lichteinstellungen:
   Verschluss = 0
   Empfindlichkeit = 40
   Super = 65
3. Geben Sie den Zeitschritt für die Protokollierung von Daten an:
   TS = 20ms
4. Sammeln Sie die Fo-Messung, indem Sie die Fluoreszenz in einem dunkel angepassten Zustand abtasten.
   F0duration = 2s;
   F0periode = 200ms;
   HINWEIS: F0duration definiert den Zeitbereich, über den die dunkelangepasste Fluoreszenz aufgezeichnet wird. F0periode definiert das Zeitintervall, über das die dunkeladaptierte Fluoreszenzmessung wiederholt wird.
5. Zeichnen Sie die Fo-Messungen in Datentabellen auf.
   <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Dabei < , stellt > den Satz von Fluoreszenzwerten dar, die nach Zeit indiziert sind. => speichert Messungen in einer Systemdatei; mfmsub stellt den gesamten Datensatz für das Experiment dar. und checkpoint erstellt eine Teilmenge für Daten bestimmter Messungen wie startFo.
6. Sammeln und speichern Sie die FM-Messung durch Probenahme der Fluoreszenz nach einem Sättigungsimpuls.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0Dauer + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>checkpoint,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   wobei a1 und a2 Variablen sind, um die Probenahmezeit mit dem Sättigungsimpuls zu koordinieren; a1 steht für die Startzeit der Fm-Messung; und a2 steht für die Mittelpunktszeit des Pulses.

5. Messung der Quantenausbeute der behandelten Proben

1. Direkt nach der Behandlung die Platten für 15 min mit Aluminiumfolie abdecken, um die Anpassung an die Dunkelheit zu gewährleisten. Entfernen Sie die Folie, um die Quantenausbeute des Photosystems II mit einem pulsamplitudenmodifizierten Fluorometer zu messen. Platzieren Sie dann die Keimlingsplatte direkt unter der Kamera und führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, das Sie im GitHub-Repository finden.
2. Laden Sie das quantum_yield Protokoll von GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) herunter oder verwenden Sie ein ähnlich gestaltetes Programm aus Abschnitt 4. Verwenden Sie die Software des Fluorometers, um die Programmdatei zu öffnen, indem Sie auf das Ordnersymbol klicken und zum Speicherort der Datei navigieren.
3. Führen Sie das Quantenausbeuteprogramm aus, indem Sie auf das rote Blitzsymbol klicken.
4. Navigieren Sie nach Abschluss des Protokolls zum Voranalysefenster . Unterteilen Sie die Platte in einzelne Sämlinge, indem Sie mithilfe der Auswahlwerkzeuge alle Pixel für jeden Sämling auf dem Plattenbild hervorheben. Klicken Sie auf Hintergrundausschluss , um alle hervorgehobenen Hintergrundpixel zu entfernen, sodass nur der Sämlingsbereich übrig bleibt.
5. Klicken Sie auf Analysieren, um Fluoreszenzdaten für jeden Sämling auf dem Plattenbild zu generieren. Stellen Sie den Fluoreszenzwertbereich manuell ein, um konsistente Minimal- und Maximalwerte für alle Platten anzuzeigen.
6. Klicken Sie im Reiter Experiment | auf Numerischer-Durchschnitt | exportieren Numerisch. Wählen Sie Alle Daten und nach Spalte aus, und klicken Sie auf OK, um eine Textdatei mit QY-Messungen für jeden Sämling zu generieren.

6. Öffnen der Datendatei

1. Öffnen Sie die Textdatei zur Analyse in einer Tabelle. Von den Überschriften, die die Flächennummer, die Größe der Pixel, Fm, Ft, Fq und QY anzeigen, identifizieren Sie die Bereichsnummer für den Kerngenotyp (WT oder Testmutante) und QYmax. Führen Sie einen paarweisen t-Test in Bezug auf den Wildtyp durch, um die Signifikanz zu bestimmen. Daten werden als signifikant unterschiedlich interpretiert, wenn p-Werte unter 0,05 liegen.

Die Ergebnisse zeigen Plattenbilder von Roh- und Fluoreszenzbildern aus dem Umgebungs- undCO2-Screening von WT- und Testmutanten. Jedes Pflänzchen ist nach Flächennummer gekennzeichnet, wobei die entsprechenden Fluoreszenzwerte als QY angegeben werden. Die Daten werden als Textdatei exportiert und können zur Analyse in einer Tabelle geöffnet werden (siehe Zusatztabelle S1). Die Mutantenlinien plgg1-1 und abcb26 wurden ausgewählt, um die positive und negative Identifizierung von Genen zu demonstrieren, die mit photorespiratorischem Stress assoziiert sind. PLGG1 kodiert für den ersten Transporter im Weg nach der Oxygenierung von RuBP6, während ABCB26 vermutlich für einen Antigentransporter kodiert, von dem nicht bekannt ist, dass er an der Photorespirationbeteiligt ist 11. Die dunkeladaptierten Fv/Fm QY-Wirkungsgrade von WT und Mutanten werden durch Box- und Whisker-Plots visualisiert. Um den statistischen Unterschied zwischen den WT- und Testmutanten zu testen, wurde ein paarweiser t-Test mit einem p-Wert < 0,05 verwendet. Hier haben wir photorespiratorische Mutantenlinien mit reduziertem QY Fv/Fm als Testmutanten verwendet, um die Effizienz der Screening-Methode zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Testmutanten einen signifikant niedrigeren QY-Wirkungsgrad als WT aufweisen. Abbildung 3B zeigt eine signifikante Reduktion des Verhältnisses von variabler zu maximaler Fluoreszenz (Fv/Fm) für plgg1-1 , aber nicht abcb26 bei niedrigemCO2. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Rolle von PLGG1 als Transporter, der an der Photorespiration beteiligt ist, während abcb26 keinen Phänotyp zeigt, der sich von der WT-Kontrolle unter niedrigen CO2-Bedingungen unterscheidet. Somit kann diese Screening-Methode photorespiratorische Mutanten mittels CO2-niedrigemCO2-Screening identifizieren.

Abbildung 1: Beispielschema des Säplattenlayouts. Es werden zwei technische Replikate mit sechs Samen in einer Reihe gezeigt. WT-Kontrollsamen, die über mutierten Samen platziert werden. Abkürzung: WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Dunkel angepasste Fv/Fm Bilder von 9 Tage alten Sämlingen. Die Wildtyp-Kontrolle wird mit T-DNA-Mutantenlinien bei Umgebungs- und niedrigemCO2-Gehalt verglichen. Die Farbskala stellt den Durchschnitt Fv/Fm jedes Sämlings dar. Maßstabsbalken = 1 cm. Abkürzungen: Fv/Fm = Verhältnis von variabler zu maximaler Fluoreszenz; WT = Wildtyp; plgg1-1 = plastidaler Glykolat/Glycerat-Translokator 1; abcb26 = ATP-bindende Kassette B26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Fluoreszenzbeobachtungen. Messungen der maximalen Quantenausbeute (Fv/Fm) an Sämlingen unter (A) Umgebungs- und (B) niedrigen CO2-Bedingungen . Die Kästchen stellen den Bereich zwischen den inneren Quartilen dar, die Linien innerhalb der Kästchen stellen die Mediane dar und die Schnurrhaare repräsentieren die maximalen und minimalen Beobachtungen. * Zeigt einen signifikanten Unterschied basierend auf einem paarweisen t-Test relativ zu WT (n > 44, p < 0,05; Zusatztabelle S2). Abkürzungen: Fv/Fm = Verhältnis von variabler zu maximaler Fluoreszenz; WT = Wildtyp; plgg1-1 = plastidaler Glykolat/Glycerat-Translokator 1; abcb26 = ATP-bindende Kassette B26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatztabelle S1: Zusammengestellte Fluoreszenzdaten von allen im Experiment verwendeten Keimlingplatten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatztabelle S2: Statistiken werden aus einem t-Test zwischen Wildtyp und beiden mutierten Genotypen berichtet. Mutanten unterscheiden sich signifikant vom Wildtyp, wenn der p-Wert niedriger als 0,05 ist. Tabelle A stellt t-Tests dar, die an Pflanzen durchgeführt werden, die in CO2-Umgebungstemperatur angebaut wurden, während Tabelle B t-Tests an Pflanzen mit niedrigemCO2-Gehalt darstellt. t-Test: Zwei-Stichproben unter der Annahme gleicher Varianzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.