Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.
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Methodenartikel
Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.
Einleitung
Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen1. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien2. Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren1. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln3, während die Kommunikation über
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Protokoll
Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill und der Division of Comparative Medicine (IACUC-Protokollnummer 21-116.0) verwendet. Für diese Experimente wurden Mäuse beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 21 (P21) verwendet. CD1-Mäuse wurden kommerziell gewonnen (Table of Materials), und MADM9 WT:WT und MADM9 WT:KO Mäuse wurden zuvor9 beschrieben.
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert Gehirne mit fluoreszierender Proteinexpression in einer spärlichen Population von Astrozyten. Die Expression fluoresz....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozytengebiet.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an den Per.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Mikroskopie wurde am UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) durchgeführt, teilweise unterstützt durch Mittel aus dem NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und dem NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Die Bilder und Daten in Abbildung 4 werden mit Genehmigung des Herausgebers aus einer früheren Publikation 9 nachgedruckt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #5 Pinzette | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB | Spritze Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl bis pH 7,4, dH2O bis 1 L; bei Raumtemperatur lagern (RT) | ||
| 12-Well-Platte | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; bei RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28,2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS lagern; bei 4 & Grad; C | ||
| 24-Well-Platte | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30 % Saccharose in TBS | 15 g Saccharose, 1x TBS bis 50 mL; bei 4 μg lagern; C | ||
| 4% PFA (Paraformaldehyd) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH Pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O bis 1 L; lagern bei 4 &/deg; C | ||
| Avertin | 0,3125 g Tri-Bromethanol, 0,625 mL Methylbutanol, dH2O bis 25 mL; lagern bei 4 μg; C; 2 Wochen nach der Herstellung verwerfen | ||
| Blockierungs- und Antikörperpuffer | 10% Ziegenserum in TBST; lagern bei 4 & Grad; C | ||
| CD1 Mäuse | Charles River | 022 | |
| Sammelfläschchen für Gehirne | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Konfokale Erfassungssoftware | Olympus | FV31S-SW | |
| Konfokales Mikroskop | Olympus | FV3000RS | |
| Deckgläser | Fisher Scientific | 12544E | |
| Kryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Kryostat Klinge | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Einbettform | Polysciences | 18646A-1 | |
| Gefriermedium | 2:1 30% Saccharose:OCT; lagern bei RT | ||
| GFP Antikörper | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Ziege Anti-Huhn 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Ziege Anti-Kaninchen 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Ziegenserum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Salzsäure | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metall Lunchdose | AQUARIUS | N/A | Von Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Mikro-Präparierschere | Roboz | RS-5921 | |
| Eindeckmedium | 20 mM Tris pH 8,0, 90 % Glycerin, 0,5 % N-Propylgallat; Bei 4 & Grad lagern; C; haltbar bis zu 2 Monate | ||
| Nagellack | VWR | 100491-940 | |
| N-Propylgallat | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Speziell für Mikroskop/Objektiv |
| Operationsschere 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital Plattform Shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Erforderliche Mindestdrehzahl: 25 U/min |
| Pinsel | Bogrinuo | N/A | Von Amazon, "Detail Pinsel - Miniaturbürsten " |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteurpipette (5,75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteurpipette (9") | VWR | 14672-380 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Rasierklinge | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP Antikörper | Rockland | 600-401-379 | |
| Schnittmedium | 1:1 Glycerin:1x TBS; lagern bei RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Natriumchrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0,2 % Triton in 1x TBS; bei RT | ||
| lagern Transferpipette | VWR | 414004-002 | |
| Tri-Bromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 ( | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension stellen als Ergänzungsmaterial zur Verfügung |
Referenzen
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
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Nachdrucke und Genehmigungen
