Methodenartikel

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

DOI:

10.3791/63819

⸱

10. Mai 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubuli-Netzwerke werden in Zellen eingesetzt, um eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen, die von der Funktion als Spuren für den Vesikeltransport bis hin zur Arbeit als spezialisierte Arrays während der Mitose reichen, um die Chromosomentrennung zu regulieren. Zu den Proteinen, die mit Mikrotubuli interagieren, gehören Motoren wie Kinesine und Dynein, die aktive Kräfte und Richtungsbewegungen erzeugen können, sowie nicht-motorische Proteine, die Filamente zu Netzwerken höherer Ordnung vernetzen oder die Filamentdynamik regulieren. Bisher haben sich biophysikalische Studien von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen überwiegend auf die Rolle einzelner Motorproteine konzentriert, die für den Vesikeltransport benötigt werden, und es wurden signifikante Fortschritte bei der Aufklärung der krafterzeugenden Eigenschaften und der mechanochemischen Regulation von Kinesinen und Dyneinen erzielt. Für Prozesse, bei denen Mikrotubuli sowohl als Fracht als auch als Spur fungieren, wie z.B. beim Gleiten von Filamenten innerhalb der mitotischen Spindel, ist jedoch viel weniger über die biophysikalische Regulation von Ensembles der beteiligten Vernetzungsproteine bekannt. Hier beschreiben wir unsere Methodik zur direkten Untersuchung der Krafterzeugung und -reaktion innerhalb vernetzter Mikrotubuli-Minimalnetzwerke, die aus gereinigten Mikrotubuli und mitotischen Proteinen rekonstituiert wurden. Mikrotubulipaare werden durch interessante Proteine vernetzt, ein Mikrotubuli wird an einem mikroskopischen Deckglas immobilisiert und das zweite Mikrotubuli wird durch eine optische Falle manipuliert. Die simultane Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Mehrkanalvisualisierung aller Komponenten dieses Mikrotubuli-Netzwerks, während die Filamente auseinandergleiten, um Kraft zu erzeugen. Wir zeigen auch, wie diese Techniken verwendet werden können, um Schubkräfte zu untersuchen, die von Kinesin-5-Ensembles ausgeübt werden, und wie viskose Bremskräfte zwischen gleitenden Mikrotubulipaaren entstehen, die durch die mitotische MAP PRC1 vernetzt sind. Diese Assays liefern Einblicke in die Mechanismen des Spindelaufbaus und der Spindelfunktion und können breiter angepasst werden, um die Mechanik des dichten Mikrotubuli-Netzwerks in verschiedenen Kontexten zu untersuchen, wie z.B. das Axon und die Dendriten von Neuronen und polaren Epithelzellen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellen verwenden Mikrotubuli-Netzwerke, um eine Vielzahl von mechanischen Aufgaben auszuführen, die vom Vesikeltransport 1,2,3 bis zur Chromosomentrennung während der Mitose 4,5,6 reichen. Viele der Proteine, die mit Mikrotubuli interagieren, wie die molekularen Motorproteine Kinesin und Dynein, erzeugen Kräfte und werden durch mechanische Belastungen reguliert. Um besser zu verstehen, wie diese kritischen Moleküle funktionieren, haben Forscher biophysikalische Einzelmolekülmethoden wie optisches Trapping und TIRF-Mikroskopie eingesetzt, um kritische Parameter wie unbelastete Schrittraten, Prozessivität und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehungen für einzelne Proteine direkt zu überwachen. Die am häufigsten verwendete experimentelle Geometrie bestand darin, Motorproteine direkt an Fangperlen anzuheften, deren sphärische Geometrie und Größe Vesikel nachahmen, die einem motorisch angetriebenen Transport unterzogen werden. Zahlreiche Kinesine, darunter Kinesin-1 7,8,9, Kinesin-2 10,11,12, Kinesin-3 13,14,15,16 Kinesin-517,18, Kinesin-8 19,20, sowie Dynein und Dynein-Komplexe21,22, 23,24,25, wurden mit diesen Methoden untersucht.

In vielen zellulären Prozessen verwenden jedoch motorische und nicht-motorische Proteine Mikrotubuli sowohl als Spur als auch als Fracht26,27. Darüber hinaus funktionieren diese Proteine in diesen Szenarien, in denen Mikrotubulifilamente zu Bündeln höherer Ordnung vernetzt sind, als Ensembles und nicht als einzelne Einheiten. Zum Beispiel organisieren sich innerhalb sich teilender somatischer Zellen dichte Filamentnetzwerke selbst, um den mitotischen Spindelapparat28,29,30 aufzubauen. Das interpolare Spindel-Mikrotubuli-Netzwerk ist hochdynamisch und weitgehend mit Minus-Enden, die zu den Spindelpolen zeigen, und Plus-Enden, die sich in der Nähe des Spindeläquators überlappen, angeordnet. Filamente innerhalb der Spindel sind durch Motorproteine wie Kinesin-5 31,32,33, Kinesin-12 34,35,36 und Kinesin-1437,38,39 oder durch nicht-motorische Proteine wiePRC1 40,41,42,43 oder NuMA 44,45 vernetzt. 46. Sie bewegen sich häufig oder erfahren mechanischen Stress während Prozessen wie dem polwärts gerichteten Fluss oder bei der Koordination der Chromosomenzentrierung während der Metaphase oder der Chromosomentrennung während der Anaphase 47,48,49,50,51,52. Die Integrität des Spindelapparates im Mikrometerbereich durch Mitose beruht daher auf einem sorgfältig regulierten Gleichgewicht von Druck- und Zugkräften, die von diesem Netzwerk interagierender Filamente erzeugt und aufrechterhalten werden. Die Werkzeuge, die benötigt werden, um diese mechanische Regulation zu untersuchen und zu erklären, wie Proteinensembles zusammenarbeiten, um Mikrotubulibewegungen zu koordinieren und die Kräfte zu erzeugen, die benötigt werden, um die Spindel richtig zusammenzubauen, wurden jedoch erst kürzlich entwickelt, und wir beginnen gerade erst, die biophysikalischen Regeln zu verstehen, die dynamische Mikrotubuli-Netzwerke definieren.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zu demonstrieren, die erforderlich sind, um vernetzte Mikrotubulipaare in vitro zu rekonstruieren, diese Bündel in einer Mikroskopiekammer zu immobilisieren, die eine gleichzeitige Fluoreszenzvisualisierung sowohl der Mikrotubuli als auch der vernetzenden Proteine und die nanoskalige Kraftmessung ermöglicht, und diese Daten robust zu verarbeiten. Wir beschreiben die Schritte, die erforderlich sind, um fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli stabil zu polymerisieren, Mikroskopdeckgläser für die Befestigung vorzubereiten, Polystyrolperlen für optische Fangexperimente vorzubereiten und vernetzte Filamentnetzwerke zusammenzubauen, die ihre In-vivo-Funktionalität bewahren und gleichzeitig eine direkte biophysikalische Manipulation ermöglichen.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung von Mikrotubuli

HINWEIS: Bei Verwendung von GFP-markierten Vernetzungsproteinen, rot (z. B. Rhodamin) und tiefrot (z. B. biotinyliertes HiLyte647, im Rest des Textes als biotinyliertes Fernrot bezeichnet) funktioniert die organische Fluorophormarkierung der Mikrotubuli gut. Minimales Übersprechen zwischen allen drei Kanälen kann während der Bildgebung durch die Verwendung eines hochwertigen Quad-Band-TIRF-Filters (Total Internal Reflection Fluorescence) erreicht werden.

  1. GMPCPP-Mikrotubuli-Saatgutbestände vorbereiten
    1. Suspendieren Sie 1 mg unmarkiertes lyophilisiertes Tubulin in 84 μL eiskaltem 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), wobei DTT kurz vor Gebrauch zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt wird. 60 μg fluorophormarkiertes lyophilisiertes Tubulin in 6 μL kaltem 1x BRB80 mit 1 mM DTT suspendieren. 60 μg biotinmarkiertes lyophilisiertes Tubulin in 6 μL kaltem 1x BRB80 mit 1 mM DTT suspendieren.
    2. Zur Herstellung von nicht biotinyliertem Rhodamin-markiertem Tubulin-Saatgut mit einem Markierungsverhältnis von 1:10 werden 84 μL unmarkiertes Tubulin, 6 μL fluorophormarkiertes Tubulin und 10 μL 10 mM GMPCPP-Stammlösung zu einem 0,5-ml-Röhrchen gegeben. Gut durch vorsichtiges Pipettieren mischen und auf Eis halten.
      HINWEIS: Die GMPCPP-Polymerisation wird für diese Assays bevorzugt, da die Mikrotubuli stabiler und für eine direkte Manipulation mit der optischen Falle zugänglich sind als wenn sie mit GTP polymerisiert oder wenn Taxol weggelassen wird.
    3. Zur Herstellung biotinylierter weit rot markierter Tubulinsamen mit einem fluoreszierenden Markierungsverhältnis von 1:10 werden 80 μL unmarkiertes Tubulin, 6 μL fluorophormarkiertes Tubulin, 4 μL Biotin-markiertes Tubulin und 10 μL 10 mM GMPCPP-Stammlösung in einem 0,5-ml-Röhrchen hinzugefügt. Gut durch vorsichtiges Pipettieren mischen und auf Eis halten. Das Saatgut 5 min auf Eis bebrüten.
    4. Die Tubulinlösung wird in ein Polycarbonatröhrchen überführt, das für die Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet ist. Zentrifugieren Sie das Saatgut bei ~350.000 x g für 5 min bei 2 °C, um eine Mikrotubulipolymerisation zu verhindern und den Überstand für die Aliquotierung zurückzugewinnen. Die endgültige geschätzte Konzentration von Tubulin in diesem Stadium beträgt ~50 μM.
    5. Unter Verwendung von 0,2 ml PCR-Röhrchen 2 μL Aliquots des Saatguts herstellen und mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Aliquots können bei -80 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.
  2. Polymerisation von Mikrotubuli
    1. 500 μL 1x BRB80 zubereiten und auf Eis legen. Legen Sie je einen der biotinylierten dunkelroten und nicht biotinylierten Rhodaminsamen-Aliquots zum Auftauen auf Eis.
    2. Die Samenvorräte 5 min auf Eis bebrüten. Am Ende der Inkubationszeit sofort 26 μL 1x BRB80 in jedes Röhrchen geben. Wenn längere Mikrotubuli gewünscht werden, erhöhen Sie das Volumen von BRB80 um 5-10 μL, während bei kürzeren Mikrotubuli das Volumen für die Polymerisation um 5 μL reduziert wird.
    3. Die Mikrotubuli-Samenbestände 1 h bei 37 °C im Wasserbad inkubieren. Kombinieren Sie 298,5 μL Raumtemperatur 1x BRB80 und 1,5 μL 4 mM Taxol-Stammlösung zu einer 20 μM Taxollösung. Bereiten Sie 300 μL 1x BRB80 vor und halten Sie beide Röhrchen bei Raumtemperatur.
    4. Erwärmen Sie einen geeigneten Hochgeschwindigkeitsrotor auf 30 °C. Dies kann in einer Tisch-Ultrazentrifuge erfolgen, die auf 30 °C eingestellt ist. Die Mikrotubuli aus dem Wasserbad nehmen und 10-15 min auf einer Tischplatte bei Raumtemperatur aufbewahren.
  3. Klärung von Mikrotubuli
    1. 100 μL Raumtemperatur 1x BRB80 in die Mikrotubuli-Wachstumslösung geben und mischen, indem Sie das Röhrchen ~10 mal schnippen oder vorsichtig pipettieren. Die Mikrotubuli-Wachstumslösung wird in ein Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen überführt.
    2. Markieren Sie eine Seite des Polycarbonatrohrs, die relativ zur Rotation der Zentrifuge nach außen zeigt. Dies hilft bei der Lokalisierung des Mikrotubuli-Pellets, das aufgrund des geringen Materialvolumens kaum sichtbar ist.
    3. Zentrifugieren Sie die Mikrotubulilösung bei ~350.000 x g für 10 min bei 30 °C. Nach dem Zentrifugieren untersuchen Sie das Röhrchen mit den Mikrotubuli nach Möglichkeit auf ein Pellet. Entfernen Sie alle bis auf die letzten Mikroliter Flüssigkeit vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Wenn das Pellet nicht gut sichtbar ist, verwenden Sie die Markierung als Leitfaden, um den Bereich, in dem sich das Pellet befindet, nicht zu stören.
    4. Sofort 100 μL 1x BRB80 + 20 μM Taxol in das Mikrotubuliröhrchen geben. Dies kann direkt auf das Pellet gegeben werden; Eine Störung des Pellets in diesem Stadium hat keinen wesentlichen Einfluss auf den Klärungsprozess.
    5. Zentrifugieren Sie die Mikrotubuli erneut bei ~350.000 x g für 10 min, wobei darauf zu achten ist, dass der markierte Abschnitt des Röhrchens wieder relativ zur Rotation der Zentrifuge nach außen ausgerichtet ist.
    6. Entfernen Sie wie zuvor alle bis auf wenige Mikroliter Lösung und achten Sie erneut darauf, das Mikrotubuli-Pellet nicht zu stören. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4.-1.3.5. und dann das Mikrotubuli-Pellet in 20-50 μL 1x BRB80 + 20 μM Taxol resuspendieren.
    7. Resuspendieren Sie, indem Sie den größten Teil des Resuspensionsvolumens pipettieren und vorsichtig direkt auf das Pellet auswerfen, 20-30x wiederholen oder bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Dies sollte mit Vorsicht geschehen, um die Mikrotubuli nicht durch zu kräftiges Pipettieren zu scheren. Das Schneiden der Pipettenspitze, um die Größe der Öffnung zu vergrößern, kann auch hilfreich sein, um die Mikrotubulischerung zu reduzieren.
    8. Lagern Sie die Mikrotubuli bei Raumtemperatur, indem Sie das Röhrchen in Folie wickeln, um die Fluorophore vor Licht zu schützen, und auf dem Tisch. Mikrotubuli sind in der Regel für 2-3 Tage nach Abklärung verwendbar.
  4. Beurteilung von Mikrotubuli durch Mikroskopie
    1. Bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung der geklärten Mikrotubulilösung vor, indem Sie 1 μL Mikrotubuli und 9 μL Raumtemperatur 1x BRB80 mischen. Bilden Sie diese Lösung sofort ab, indem Sie 10 μL auf einen Objektträger pipettieren und dann ein Deckglas über den Tropfen legen, um einen Kürbis zu bilden.
    2. Stellen Sie sicher, dass Mikrotubuli mit einer Länge von 8-25 μm bei hoher Dichte (mehrere hundert pro Vollsichtfeld, in einem dichten Netz geschichtet) sichtbar sind, wenn sie mit Fluoreszenzmikroskopie und einem 100x-Objektiv visualisiert werden, das auf die Deckglasoberfläche in Kontakt mit der Mikrotubuli-Verdünnung gerichtet ist.

2. Herstellung passivierter Deckgläser

  1. Waschen von Deckgläsern
    1. Legen Sie die 18 mm x 18 mm großen Deckgläser in nicht reaktive Kunststoffgestelle und legen Sie jedes Gestell in ein 100-ml-Becherglas. Legen Sie ein Deckglas pro Schlitz in die Racks, da beide Seiten der Deckgläser gereinigt werden müssen.
    2. Beschallen Sie mit einem Badsonikator für 5 min, wobei 50 ml der folgenden Lösungen in der für jeden Ultraschallzyklus angegebenen Reihenfolge verwendet werden: (1) entionisiertes Wasser (mit 18,3 MΩ-cm Widerstand), (2) 2% Micro-90-Lösung, (3) entionisiertes Wasser, (4) frisch zubereitetes 0,1 M KOH, (5) entionisiertes Wasser (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind. Spülen Sie zwischen den Ultraschallzyklen jedes Rack Deckgläser in entionisiertem Wasser ab, indem Sie das Rack mit einer Pinzette 10-20x in entionisiertes Wasser eintauchen, das Wasser ersetzen und den Spülvorgang 2x wiederholen.
    3. Spülen Sie die Deckgläser 3x in Wasser ab, füllen Sie dann die Becher mit 100% Ethanol wieder auf und geben Sie die Gestelle wieder in die Bechergläser zurück. Stellen Sie die Becher in einen Abzug und legen Sie genügend Taschentücher aus, um Platz für alle Deckglasregale zu schaffen. Entfernen Sie dann die Gestelle mit einer Pinzette und legen Sie sie auf die Taschentücher.
    4. Mit einem trockenen Stickstoffgasstrom das Ethanol von den Deckgläsern und ihren Gestellen abblasen, bis es trocken ist. Entsorgen Sie das restliche Ethanol aus den Bechergläsern und trocknen Sie es ebenfalls mit dem trockenen Stickstoffgasstrom (Abbildung 1A).
  2. Aminosilan-Oberflächenfunktionalisierung auf Deckgläsern
    1. Die (3-Aminopropyl)tiethoxysilan (APTES)-Reagenzlösung wird durch Zugabe von 40 ml Aceton und 400 μL APTES-Reagenz in ein 50-ml-konisches Röhrchen hergestellt, fest verschlossen und durch Invertieren von 10x gemischt.
    2. Legen Sie ein Rack Deckgläser in das entsprechende Trockenbecherglas und tauchen Sie es dann vollständig in APTES-Lösung ein. 5 min inkubieren (Abbildung 1A). Bringen Sie das APTES-behandelte Gestell in ein neues Trockenbecherglas und schieben Sie ein neues Gestell in das APTES, um es 5 m lang zu inkubieren.
    3. Spülen Sie das behandelte Gestell mit entionisiertem Wasser ab, indem Sie das Gestell 10-20x wie in Schritt 2.1.2 beschrieben tauchen und das Wasser 5x ersetzen. Wiederholen Sie, bis alle Deckgläser behandelt und gewaschen wurden.
  3. PEGylierung der Aminosilanoberfläche
    1. Bereiten Sie zwei PEG-Lösungen vor, eine von ~100 μL mit 25% w/v PEG und eine andere von ~10 μL mit 10% w/v Biotin-PEG, beide suspendiert in frisch zubereitetem 0,1 M NaHCO3, ausreichend um 24 Deckgläser zu beschichten. Zentrifugieren Sie die 25%ige PEG-Lösung bei 3.000 x g für 20 s, sobald 0,1 M NaHCO3 hinzugefügt wird, um die PEG vollständig aufzulösen; Die Lösung kann trüb bleiben. Mischen Sie das Biotin-PEG durch schonendes Pipettieren (Abbildung 1B).
    2. Es wird eine Mischung aus PEG- und Biotin-PEG-Lösungen mit dem 33,3-fachen Volumen PEG zu 1 Volumen Biotin-PEG (z. B. 100 μL PEG-Lösung und 3 μL Biotin-PEG-Lösung) hergestellt.
    3. Legen Sie in einem Abzug mehrere sterile und fusselfreie Tücher aus. Stellen Sie die Deckglasgestelle auf die Tücher und föhnen Sie sie wie bisher mit einem trockenen Stickstoffgasstrom trocken. Legen Sie auf mehreren neuen und trockenen Tüchern die nun vollständig getrockneten Deckgläser paarweise angeordnet aus und beschriften Sie sie jeweils in der rechten unteren Ecke mit einem asymmetrischen Symbol wie "b". Diese Markierung befindet sich gegenüber der Probenoberfläche des Deckglases und stört das Experiment nicht (Abbildung 1B).
    4. Werfen Sie ein Deckglas in jedes Paar mit einer Pinzette. Geben Sie 6 μL PEG/Biotin-PEG-PEG-Gemisch auf jedes umgedrehte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf, so dass beide "b"-Etiketten nach außen zeigen.
    5. Richten Sie die Deckglasränder aus und legen Sie sie in eine befeuchtete und luftdichte Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Deckgläser in der Feuchtekammer bei Raumtemperatur 3 h anbrüten.
    6. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser aus der Feuchtigkeitskammer, trennen Sie die Deckglaspaare vorsichtig und legen Sie sie wieder in ihre Gestelle. Waschen Sie jedes Rack wie zuvor in entionisiertem Wasser, tauchen Sie die Racks mit einer Pinzette 10-20x und ersetzen Sie das Wasser insgesamt 5x.
    7. Platzieren Sie alle PEGylierten Seiten der Deckgläser in die gleiche Richtung, so dass sich keine zwei PEGylierten Deckglasoberflächen gegenüberliegen. Die PEGylierte Oberfläche wird sehr klebrig sein, bis sie vollständig trocknet, also achten Sie besonders darauf, dass sich die Deckgläser nicht berühren. Trocknen Sie jedes Gestell und die Deckgläser wie zuvor mit einem trockenen Stickstoffgasstrom (Abbildung 1B).
    8. Sobald die Deckgläser und ihre Gestelle vollständig getrocknet sind, lagern Sie sie in einem Vakuum-Exsikkator, um eine Verschlechterung der Oberflächenbeschichtung zu verhindern. Richtig unter Vakuum und mit Trockenmittel gelagert, um zu verhindern, dass Feuchtigkeit die PEG-Beschichtung stört; Deckgläser können ca. 1 Woche verwendet werden.

3. Herstellung von kinesinbeschichteten Perlen

  1. Auswahl und Vorbereitung des Rigor-Kinesin-Konstrukts
    1. Drücken und reinigen Sie Rigor-Kinesin-Konstrukte gemäß den veröffentlichten Protokollen53,54. 5 μL Aliquots von 0,02 mg/ml Kinesinlösungen schockgefrieren und bei -80 °C bis zu 1 Jahr lagern.
      HINWEIS: Rigor-Kinesin-Proteine haben eine G234A-Punktmutation, die die ATP-Hydrolyse verhindert. Wenn sie an Mikrokügelchen konjugiert werden, ermöglichen hochaffine Wechselwirkungen mit dem Mikrotubuli es Perlen, Lasten von 10-20 pN für mehrere Minuten zu halten. Rigormutierte Versionen sowohl des üblicherweise verwendeten Kinesin-1-Homodimers K56053 als auch eines weiter optimierten K439-Konstrukts 55 wurden ebenfalls mit Erfolg in diesen Assays54 eingesetzt. Dieses verbesserte K439-Konstrukt enthält eine EB1-Dimerisierungsdomäne zur Verbesserung der Stabilität und einen C-terminalen 6-His-Tag für die spezifische Bindung an einen 6-His-Antikörper, wie unten beschrieben.
  2. Bindung von 6-His-Antikörpern an Streptavidin-beschichtete Perlen
    1. Geben Sie 50 μL Streptavidin-beschichtete Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 1 μm in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Sonicate für 30 s.
    2. Fügen Sie 10 μL 200 mM DTT zu 790 μL 1x BRB80 hinzu. Fügen Sie 10 μL beschallte Perlen zu 40 μL dieses 1x BRB80 + 2,5 mM DTT-Puffers hinzu.
    3. Kombinieren Sie 1 μL biotinylierten 6-His-Antikörper und 49 μL 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; Wirbel kurz mischen.
    4. Kombinieren Sie die 50 μL verdünnte Perlenmischung und 50 μL Antikörperverdünnung in einem neuen Röhrchen. Legen Sie das Rohr bei 4 °C in einen Rohrrotator und drehen Sie es für 1 Stunde. Die Perlenmischung 10 min bei 3.000 x g bei 4 °C herunterdrehen.
    5. Pipettieren Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μL 2 mg/ml Kaseinlösung in 1x BRB80. Wiederholen Sie diese Zentrifugation und Resuspension 2x.
  3. Zugabe von Rigorkinesin
    1. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 100 μL 2 mg/ml Kaseinlösung. In einem 0,5 ml Zentrifugenröhrchen 5 μL 0,02 mg/ml Rigorkinesin und 5 μL Perlen mischen und vorsichtig mischen, indem Sie das Röhrchen ~ 10x leicht bewegen.
    2. Halten Sie sowohl die K439 G234A Wulstaufhängung als auch die restlichen 6-His-Sicken auf dem Rotor bei 4 °C, wenn sie nicht verwendet werden. Perlen müssen frisch zubereitet und am selben Tag für die Experimente verwendet werden, da sie dazu neigen, zu verklumpen und über diese Zeit hinaus an Aktivität zu verlieren.

4. Aufbau der Mikroskopiekammer

  1. Vorbereitung von Objektträgern und Kammerbau
    1. Spülen Sie 75 mm x 25 mm Mikroskop-Objektträger zuerst mit Reinstwasser, gefolgt von Ammoniak-D-Glasreiniger und dann noch einmal mit Reinstwasser. Schütteln, um überschüssige Wassertröpfchen zu entfernen. Trocknen Sie die Objektträger mit einem Stickstoffstrom, damit keine Streifen zurückbleiben, und legen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch (Abbildung 2A).
    2. Mit einer Schere doppelseitiges Klebeband in Streifen von ~2-3 mm x 2,5 cm schneiden (2 Streifen pro Einzelkammer und 3 pro Doppelkammer).
    3. Legen Sie mit einer Pinzette zwei Streifen Klebeband auf einen Glasträger, so dass zwischen ihnen ~ 0,5 cm Platz sind, um eine einzige Kammer zu konstruieren. Verwenden Sie für Doppelkammern den gleichen Abstand, jedoch mit drei Bandstreifen (Abbildung 2B). Das Volumen des Probenkanals beträgt bei dieser Methode ca. 10 μL.
      HINWEIS: Je breiter die Kammer(n), desto wahrscheinlicher ist es, dass sich Blasen bilden, wenn Lösungen eingeströmt werden; Kammern, die weniger als 0,5 cm breit sind, können jedoch aufgrund der reduzierten Fläche für die Bildgebung schwierig zu verwenden sein.
    4. Kratzen Sie mit einer Pinzette über die Länge jedes Bandstreifens, so dass das Band fest mit dem Glasobjektträger verbunden ist.
    5. Lassen Sie den Druck vom Exsikkator los und entfernen Sie mit einer Pinzette ein biotinyliertes Deckglas aus einem Lagerregal. Legen Sie ein biotinyliertes Deckglas mit einer Pinzette auf den Glasobjektträger. Stellen Sie sicher, dass die biotinylierte Seite nach innen zeigt, in Richtung des Glasobjektträgers.
    6. Drücken Sie mit dem flachen hinteren Ende der Pinzette vorsichtig auf das Glas, wo das Deckglas das Klebeband berührt, um die Kammern sicher zu verschließen. Es muss leichter Druck ausgeübt werden, um sicherzustellen, dass das Deckglas nicht reißt (Abbildung 2C).
    7. Lagern Sie die fertigen Mikroskopierkammern bis zur Verwendung in einem luftdichten Behälter vor direktem Licht geschützt (Abbildung 2D).
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Kammern am selben Tag zu verwenden, an dem sie hergestellt werden, da die biotinylierten Deckgläser an der Luft abgebaut werden.
  2. Einfließen von Mikroskopiereagenzien
    1. Konstruieren Sie eine Feuchtigkeitskammer, indem Sie ein zusammengefaltetes, fusselfreies, mit Reinstwasser angefeuchtetes Gewebe auf den Boden einer leeren Pipettenspitzenbox legen. Die Probenkammern sollten zwischen den Einströmungsschritten in dieser Box aufbewahrt werden, um die Verdampfung von Lösungen aus dem Kanal zu reduzieren.
    2. Führen Sie alle Reagenzien ein, indem Sie die Flüssigkeit an einem Ende des Kanals pipettieren und die Flüssigkeit am gegenüberliegenden Ende ableiten. Um es abzuleiten, drehen Sie ein Ende des Gewebes und legen Sie es vorsichtig auf die Ausgangsseite der Kammer, so dass die Kapillarwirkung das Reagenz homogen verteilt (Abbildung 3A). Bringen Sie alle Reagenzien kurz vor dem Einfließen auf Raumtemperatur, um eine Depolymerisation der Mikrotubuli zu verhindern.
    3. Unter Verwendung einer abgewinkelten 20-μL-Pipettenspitze, so dass sie die Eingangsseite einer Kammer berührt, fließen Sie langsam 10 μL 0,5 mg/ml Streptavidin oder Neutravidin ein. Verwenden Sie kleinere Pipettenspitzen und einen langsamen, konstanten Einfluss von Reagenzien, um die Wahrscheinlichkeit von Blasen in der Kammer zu verringern (Abbildung 3B).
    4. Inkubieren Sie den Objektträger in der Feuchtigkeitskammer für 4 min mit der Deckglasseite der Kammer nach unten. Diese Ausrichtung ermöglicht es, dass größere Objekte wie Mikrotubuli oder Perlen in der Nähe der PEGylierten Oberfläche absinken.
    5. Spülen Sie die Kammer mit 20 μL 1x BRB80 aus, wobei Sie ein fusselfreies Tuch verwenden, um Flüssigkeiten herauszuziehen. Wenn in der Kammer ein Leck vorhanden ist, entsorgen Sie den Objektträger und beginnen Sie mit einem anderen. Kleine Blasen, die in der Kammer auftreten, beeinträchtigen die Bildgebung nicht.
    6. Wiederholen Sie die Schritte Einströmung, Inkubation und Spülung mit 10 μL 0,5 mg/ml Kaseinblocklösung (Abbildung 3C). Biotinylierte dunkelrote Mikrotubuli ~1:20 verdünnen und 10 μL in die Kammer fließen. 5 min inkubieren und die Kammer mit 20 μL 1x BRB80 spülen (Abbildung 3D). Die optimale Dichte dieser Mikrotubuli innerhalb eines Bildfeldes von 100 μm x 100 μm sollte 10-20 betragen; und die Verdünnung in diesem Stadium sollte angepasst werden, um dieses Oberflächenbindungsverhältnis zu erreichen.
    7. Wiederholen Sie die Schritte des Einfließens, der Inkubation und der Spülung mit 10 μL einer geeigneten Konzentration (typischerweise 1-10 nM), die den zu untersuchenden Motor oder das nicht-motorische Protein vernetzen (Abbildung 3E).
    8. Fluss in 10 μL Rhodamin-Mikrotubuli, verdünnt auf eine ähnliche Konzentration wie die vorherigen biotinylierten dunkelroten Mikrotubuli. Wiederholen Sie die Schritte Inkubation und Spülung (Abbildung 3F).
    9. Kombinieren Sie 1 μL Rigor-Kinesin-beschichtete Beads und 19 μL Reaktionspuffer, optimiert für die Vernetzung der Proteinaktivität. Verwenden Sie beispielsweise zur Analyse der Kinesin-5-Aktivität Reaktionspuffer mit 1 mM TCEP-Bindungsbrecher, 0,2 mg/ml Alpha-Casein, 70 mM KCl, Sauerstofffängersystem (4,5 mg/ml Glucose, 350 Einheiten/ml Glucoseoxidase, 34 Einheiten/ml Katalase), 1 mM DTT und ATP in der gewünschten Konzentration (z. B. 1 mM für maximale Kinesingeschwindigkeitsbedingungen) in 1x BRB80 (Abbildung 3G) ). Für die Analyse von nicht-motorischen Proteinen ist ATP wegzulassen und die Konzentration von KCl zu variieren, um die Protein-Mikrotubuli-Interaktionsstärke in diesen Assays zu modulieren.
    10. Versiegeln Sie beide Ränder der Kammer mit durchsichtigem Nagellack, und warten Sie, bis die Lacke getrocknet ist, bevor Sie sie aufnehmen (Abbildung 3H). Eine erfolgreich konstruierte Kammer weist keine Leckagen und minimale Blasen auf.

5. Bildgebende Mikrotubuli-Bündel mit 3-Farben-TIRF

  1. Verwenden Sie ein inverses Mikroskopinstrument, das über TIRF-Bildgebungsfunktionen verfügt und in das eine optische Einzelstrahlfalle eingebaut wurde (Abbildung 4).
    HINWEIS: Für die hier beschriebenen Studien wurde ein inverses Mikroskop mit einer 100x/NA1.49 Ölobjektivlinse, einem TIRF-Modul und drei Lasern bei 488 nm, 561 nm und 640 nm für das GFP-markierte Protein, rhodaminmarkierte Mikrotubuli bzw. biotinylierte weit rot markierte Mikrotubuli verwendet.
    1. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas der Probenkammer. Übermäßiges Öl kann das Mikroskopobjektiv beschädigen. Legen Sie die abzubildende Probe mit der Deckglasseite der Probenkammer nach unten auf die Mikroskopplattform.
    2. Bringen Sie das Objektiv langsam nach oben, so dass sowohl das Deckglas als auch das Objektiv durch das Öl in Kontakt kommen. Stellen Sie die Objektivhöhe so ein, dass die Deckglasoberfläche der Probenkammer scharf ist.
    3. Nehmen Sie Einzelbildbilder der Probe in allen drei Kanälen auf. Verwenden Sie für die Experimente hier 100-200 ms Belichtung als optimale Bildgebungsdauer über alle drei Kanäle; Längere Belichtungszeiten können zu einer erhöhten Photobleiche führen.
    4. Passen Sie die Laserleistung an, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis der Proben zu erzielen und gleichzeitig das Photobleaching über die 2-5 Minuten zu minimieren, wenn das einzelne Bündel untersucht wird. Für den hier verwendeten Laser (Abbildung 4 und Abbildung 5) ist eine Laserleistung von 5 mW für den GFP-Kanal und 3 mW für beide Mikrotubulikanäle optimal zu verwenden.
      HINWEIS: Erfolgreich zusammengesetzte Bündel sollten aus einem oberflächenimmobilisierten Mikrotubuli im fernroten Kanal, einer koextensiven Region von mehreren Mikrometern mit signifikantem GFP-Proteinsignal und einem Rhodamin-Mikrotubuli bestehen, der diese Regionen überlappt und sich dann mehrere Mikrometer vom Bündel entfernt erstreckt (Abbildung 5B, C und Abbildung 6 ). Live-Bildgebung des Rhodamin-Mikrotubuli sollte subtile Fluktuationen am nicht vernetzten Mikrotubuli-Ende zeigen, was darauf hindeutet, dass dieses Filament nicht an die Oberfläche oder andere Proteine in der Kammer gebunden ist.
    5. Beobachten Sie die Häufigkeit von Mikrotubulibündeln pro Sichtfeld. Für eine erfolgreich präparierte Probe sollten ca. 3-4 Mikrotubulibündel pro 100 μL x 100 μL Sichtfeld pro Kammer vorhanden sein.

6. Durchführung optischer Fallenexperimente an Mikrotubulibündeln

  1. Vorexperimentelle Kalibrierung der Bedingungen
    1. Um diese Experimente durchzuführen, verwenden Sie eine optische Einzelstrahlfalle mit einer Steifigkeit von 0,05-0,1 pN/nm. Integrieren Sie die Fangoptik und den positionsempfindlichen Photodetektor in ein TIRF-fähiges inverses Mikroskop, indem Sie Kurzpassfilter direkt unter dem Objektiv bzw. über dem Kondensator einführen (Abbildung 4).
    2. Fügen Sie zusätzlich eine Nanopositionierungsstufe hinzu, auf der die Probe sitzt, damit der Benutzer die Mikrotubuli während dieser Assays kontrolliert mit einer Präzision im Nanometerbereich bewegen kann. Das hier verwendete System zur Erfassung repräsentativer Daten wurde in der veröffentlichten Arbeit 27,53,54,56,57 beschrieben.
      HINWEIS: Obwohl über den Rahmen dieses Protokolls hinausgehend, stehen mehrere Ressourcen zur Verfügung, die den Aufbau und die Kalibrierung einer optischen Einzelstrahlfalle58,59,60 detailliert beschreiben.
    3. Beobachten Sie die Dichte der Perlen in der Probe mit einem Hellfeld- oder DIC-Kanal und dem 100x-Objektiv am Mikroskop. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie nur, um Perlen zu identifizieren und zu manipulieren und nicht gleichzeitig mit Fluoreszenzbildaufnahme aufzuzeichnen. Platzieren Sie die Perlen im Durchschnitt mindestens 10 μm voneinander und stellen Sie sicher, dass sie frei von jeglicher Art von Oberflächenbegrenzung oder Anhaftung sind und nicht miteinander verbunden sind oder sich anderweitig gruppieren.
    4. Stellen Sie sicher, dass die biotinylierten dunkelroten Mikrotubuli fest mit der Oberfläche des Deckglases verbunden sind, ohne sichtbare Brownsche Bewegungen, wie Bewegungen entlang der Mikrotubuliachse oder freie Enden von Mikrotubuli, die in Lösung schwanken.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Rhodamin-Mikrotubuli über den vernetzenden MAP an biotinylierten Mikrotubuli befestigt sind und an ihren freien Enden sichtbar schwanken. Die Oberflächenanheftung von nicht-biotinylierten Mikrotubuli deutet oft darauf hin, dass die PEGylierung möglicherweise nicht erfolgreich war oder dass die PEG-Beschichtung abgebaut wurde.
  2. Mikrotubuli-Gleitmessungen mit Motorantrieb
    1. Expression und Reinigung des interessierenden Motorproteins nach veröffentlichten Protokollen. Zum Beispiel wurden GFP-markierte Kinesin-5-Proteine in voller Länge erfolgreich gereinigt und in diesen Assays 53,61 sowie unmarkierte Kinesin-1262 und Kinesin-1463 eingesetzt. Zusammensetzen und visualisieren Sie motorisch und proteinvernetzte Bündel, wie oben in Schritt 4 und 5 beschrieben.
    2. Erfassen Sie mit der optischen Falle eine freie einzelne Perle in Lösung, die eine Brownsche Bewegung aufweist. Stellen Sie die Fallenoptik nach Bedarf ein, um die Perle in die Mitte des Sichtfeldes zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass das reflektierte Interferenzmuster des Fallenstrahls symmetrisch ist, und passen Sie die Fallenoptik an, um alle Strahlasymmetrien aufzulösen.
    3. Bewegen Sie den Probentisch so, dass das freie Ende eines Rhodamin-Mikrotubuli innerhalb eines Bündels direkt unter der Perle liegt und die Perle mehrere Mikrometer von der Überlappungsregion entfernt ist, die Vernetzungsproteine enthält, um die durch Fallenstrahlen induzierte Photobleiche zu minimieren. Senken Sie die Perle in der Z-Achse, bis sie mit dem Mikrotubuli kollidiert. Achten Sie darauf, die Perle vorsichtig abzusenken und drücken Sie die Perle nicht gegen die Deckglasoberfläche, da dies zu einem Anhaften an der Deckglasoberfläche führen kann.
    4. Schalten Sie die Falle kurz aus, um mit dem Hellfeldkanal die Beweglichkeit der am gleitenden Mikrotubuli befestigten Perle zu beobachten. Bei der Durchführung von Motorprotein-Assays bewegt sich die angehängte Perle gerichtet, wenn die Mikrotubuli auseinandergleiten. Reaktiviere die Falle und fange die Perle erneut.
    5. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Fluoreszenzdaten in den drei Kanälen (488 nm, 561 nm, 640 nm) mit einer Rate von 1-2 Bildern pro s unter Verwendung der Laserleistung und Belichtungszeiten, die in Schritt 5 oben optimiert wurden.
    6. Zeichnen Sie mithilfe der Trapping-Computersoftware Spannungsdaten vom positionsempfindlichen Photodetektor (X-, Y- und SUM-Intensitätssignale), der Nanopositionierungsstufe (X-, Y- und Z-Koordinaten) und dem TIRF-Kameraverschlusszustand auf. Beginnen Sie mit der Digitalisierung dieser Fallenspannungswerte mithilfe einer dedizierten Datenerfassungskarte für den Spannungseingang, die von geeigneter Software (z. B. benutzerdefiniertem LabView-Code) mit einer Rate von 1-10 kHz gesteuert wird, abhängig von den experimentellen Anforderungen.
    7. Überwachen Sie das Kraftsignal während der Datenerfassung und achten Sie genau auf Anomalien, die eine erfolgreiche Datenerfassung beeinträchtigen könnten.
      HINWEIS: Zu den Anomalien gehören unter anderem (1) andere Perlen, die sich in die Falle bewegen, (2) die Perle, die vorzeitig aus der Falle entkommt, und (3) plötzliche Krafteinbrüche und das anschließende Versäumnis, die Kraft gegen die Falle wieder einzuleiten, was auf Probleme mit den Rigor-Kinesin-Molekülen auf der Oberfläche der Perle hinweist.
    8. Deaktivieren Sie nach der Messung die Falle, um die Perle freizugeben, und wiederholen Sie dies mit einer neuen Perle und einem neuen Mikrotubuli, bis die erforderliche Anzahl von experimentellen Wiederholungen erreicht ist.
  3. Passive Vernetzungswiderstandsmessungen
    1. Expression und Reinigung der nicht-motorischen Vernetzungsproteine von Interesse nach veröffentlichten Protokollen. Zum Beispiel wurden GFP-markiertes PRC1 43,54,57 in voller Länge und ein dimeres NuMA-verkürztes Konstrukt 56 erfolgreich in diesen Assays eingesetzt. Stellen Sie die vernetzten Bündel zusammen und visualisieren Sie sie, wie oben in den Schritten 4 und 5 beschrieben.
    2. Identifizieren Sie ein geeignetes Mikrotubulibündel, das nur zwei Mikrotubuli enthält, einen biotinylierten mit vollflächiger Befestigung und einen nicht biotinylierten Mikrotubuli, der teilweise frei in Lösung ist; Dies gibt ein freies Ende, um eine Perle zu befestigen und garantiert, dass die Perle nicht an der oberflächengebundenen Mikrotubuli befestigt ist und entweder auf der X- oder Y-Achse ausgerichtet ist, so dass die Bühnenbewegung nur entlang einer Achse verläuft.
    3. Verwenden Sie die optische Falle, um eine freie Perle zu erfassen, die sich einer Brownschen Bewegung unterzieht. Sobald die Perle gefangen wurde, bewegen Sie die Perle vorsichtig zum ausgewählten Mikrotubulibündel, um sicherzustellen, dass dabei keine anderen Perlen in die Falle gezogen werden. Stellen Sie sicher, dass die Perle mehrere Mikrometer von der Überlappungsregion entfernt ist, die vernetzende Proteine enthält, um das Photobleichen des GFP-Tags zu minimieren.
    4. Senken Sie die Perle in der Z-Achse vorsichtig ab, bis sie mit dem Rand des freien Segments des Rhodamin-Mikrotubuli in Kontakt kommt. Ziehen Sie vorsichtig nach oben und bewegen Sie sich senkrecht zur Mikrotubuli-Achse, um die Befestigung zu überprüfen, indem Sie die Biegung des Rhodamin-Mikrotubuli beobachten und der Perlenposition folgen. Wenn nicht angebracht, wiederholen Sie das sanfte Stoßen der Perle auf den Mikrotubuli, bis er befestigt ist.
    5. Richten Sie den Rhodamin-Mikrotubuli vorsichtig entlang der Mikrotubuli-Achse des oberflächenbefestigten Mikrotubuli aus, indem Sie den Nanopositionierungstisch bewegen und die Parameter für das automatisierte Ziehen des Mikrotubulibündels einstellen. Stellen Sie die Richtung entlang der parallelen Achse der Mikrotubuli ein, stellen Sie die gewünschte Zuggeschwindigkeit (25-200 nm / s ist ein nützlicher Geschwindigkeitsbereich) und die gewünschte Zugzeit (ca. 30 s bis 2 min) je nach Überlappungslänge ein.
    6. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Fluoreszenzdaten in den drei Kanälen (488 nm, 561 nm, 640 nm) mit einer Rate von 1-2 Bildern pro Sekunde. Verwenden Sie Laserleistungen und Belichtungszeiten, die in Schritt 5 oben optimiert wurden.
    7. Initiieren Sie automatisierte Bühnenbewegungen und zeichnen Sie Überfüllungsdaten aus dem positionsempfindlichen Detektor-, Tisch- und TIRF-Kamerastatus auf. Überwachen Sie alle Faktoren, die die Datenerfassung beeinträchtigen könnten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (1) eine andere Perle, die in die Falle eintritt, (2) vorzeitiger Verlust der Mikrotubuli-Vernetzung oder (3) Perlenablösung vom Rhodamin-Mikrotubuli.
    8. Deaktivieren Sie die Falle, um die Perle freizugeben, und wiederholen Sie das Experiment wie gewünscht. Eine typische Probenkammer kann etwa 30 Minuten verwendet werden, bevor es zum Abbau der Bündel und zum Verlust der Proteinaktivität kommt.
      HINWEIS: Die Abbaueffekte variieren je nach verwendetem Vernetzer, können sich jedoch in der Bildung statischer Puncta auf den Mikrotubuli oder der Oberfläche, dem Verlust von Mikrotubuli-Fluktuationen, die auf eine unspezifische Bindung hinweisen, oder der Unfähigkeit, Perlen stabil an Mikrotubuli zu befestigen, manifestieren.

7. Datenanalyse und Korrelation von Fluoreszenzbildern mit optischen Fallenaufzeichnungen

HINWEIS: Um die Datenerfassung zu optimieren, ist es vorteilhaft, zwei separate Computersteuerungssysteme zu verwenden: eines für die optische Fangsoftware und eines für die Fluoreszenzbildgebung. Dieser Aufbau ermöglicht eine Hochgeschwindigkeits-Datenerfassung in beiden experimentellen Modalitäten und eliminiert Verzögerungen bei der Ausführung von Nano- und Mikrosekunden bei der Ausführung der Daten, die bei Verwendung einer einzigen CPU auftreten können.

  1. Digitalisieren Sie die optischen Fangdaten mit einer Geschwindigkeit, die für die verwendeten motorischen oder nicht-motorischen Vernetzungsproteine und ihre erwarteten Schrittraten (z. B. typischerweise zwischen 1-10 kHz) optimiert ist.
  2. Zeichnen Sie X-, Y- und SUM-Spannungssignale vom positionsempfindlichen Photodetektor sowie die X-, Y- und Z-Positionsdaten des Nanopositionierungstisches mit einer speziellen Software zur Steuerung der optischen Falle und zur Abtastung der digitalen Spannungssignale dieser Komponenten auf.
  3. Zeichnen Sie das digitale Auslösersignal der Kamera mit einem zusätzlichen Spannungseingangskanal auf der optischen Datenerfassungskarte auf. Dies ermöglicht eine Korrelation der Fluoreszenzbilddaten mit den optischen Fangzeitspuren. Beginnen Sie mit der Datenerfassung mit der optischen Falle vor Beginn der Bildgebung, damit das Kamerasignal des ersten Bildes ordnungsgemäß aufgezeichnet wird.
  4. Mittelwert der rohen Zeitreihendaten, die mit hohen Abtastraten erfasst werden, verwenden Sie je nach Bedarf eine geeignete Filtermethode, z. B. Schiebefenster, Medianfilter oder Gaußfilter.
  5. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzbild-Zeitreihendaten mit Methoden wie der Linescan-Analyse, bei der der Pixelintensitätswert entlang der Länge des Mikrotubulibereichs berechnet wird. Aus diesen Linien können Trajektorien die Mikrotubuli-Kanten und damit die Überlappungsbereiche identifizieren. Verwenden Sie außerdem die Fluoreszenzintensität aus dem Vernetzerproteinkanal, um Proteinlokalisierung, Konzentration und Dichte zu berechnen.
  6. Die Korrelation von Kraft- und Bilddaten ist ein wesentliches Ergebnis dieses experimentellen Systems. Wählen Sie beispielsweise alle Kraftdatenpunkte innerhalb eines bestimmten Kamerabelichtungsbereichs (angezeigt durch die entsprechende digitale Signalspitze im Kamerakanal) aus und mittelen Sie sie, um sie direkt mit dem entsprechenden Fluoreszenzbildrahmen zu vergleichen. Anschließend extrahieren Sie die Beziehungen zwischen der Kraftstärke und der Anzahl der vernetzenden Proteine, der Überlappungslänge oder der Vernetzerverteilung.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Herstellung von Mikrotubulibündeln, die für die biophysikalische Analyse geeignet sind, gilt als erfolgreich, wenn mehrere der Schlüsselkriterien erfüllt sind. Erstens sollte die Bildgebung in drei Farben zwei ausgerichtete Mikrotubuli mit einer Konzentration von vernetzendem Protein zeigen, die bevorzugt die Überlappungsregion schmücken (Abbildung 5B, C und Abbildung 6B). Idealerweise sollte der Abstand zwischen der Überlap...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubuli-Netzwerke werden von unzähligen Zelltypen verwendet, um eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen, die grundlegend mechanischer Natur sind. Um zu beschreiben, wie Zellen sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitszustand funktionieren, ist es wichtig zu verstehen, wie diese Netzwerke im Mikrometerbereich von den nanometergroßen Proteinen, die sie gemeinsam aufbauen, organisiert und reguliert werden. Biophysikalische Werkzeuge wie optische Pinzetten eignen sich gut, um die Mechanochemie von Schlüsselproteinen i...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Unterstützung von R21 AG067436 (an JP und SF), T32 AG057464 (an ET) und Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (an SF) würdigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10W Ytterbium-Faserlaser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set für TIRF-AnwendungenChromaTRF89901v2
6x His Tag Antikörper, Biotin KonjugatInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Aceton, HPLC-QualitätFisher Scientific18-608-395
Alpha Kasein aus RindermilchSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA Öl Immersion TIRF ObjektivNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Deckglas Mini-Rack, für 8Deckgläser Fisher ScientificC14784
FeinfühlerKimberly-Clark34120
Dextrose wasserfreiFisher ScientificBP3501
D-SaccharoseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Tauchthermostat E100 mit 003 BadLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, mit einer Dicke von 0,9-1,1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Typ VII, ohne Zusatz von Sauerstoff
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SKann mehrere Monate bei -20 Grad gelagert werden; C und bis zu einem Jahr bei -80 °; C
Gold Seal-Cover GlasThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazolFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Labor-ExsikkatorBel-Art999320237190mm Plattengröße
KanamycinsulfatFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956fusselfreies Taschentuch
Immersionsöl, Typ BCargille16484
LinsengewebeThorLabsMC-5
LuNA Laserstart (4 Kanäle: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesiumacetat-TetrahydratFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverses MikroskopNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA HarzThermo Scientific88221
Oligonukleotid - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonukleotid - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDT N/A
Dickwandiges Polycarbonat-Rohr mit offenem Deckel, 0,2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltrazentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol-Äquivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Schweinetubulin, Biotin-MarkierungCytoskeleton, Inc.T333P
Schweinetubulin, HiLyte 647Fluor-Zytoskelett, Inc.TL670Mfar-rot markiertes
Schweinetubulin, Rhodamin-Zytoskelett, Inc.TL590M
Schweinetubulin, Tubulin-Protein-Zytoskelett, Inc.T240
KaliumacetatFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS KameraPhotometrischerN/A
Quadrantendetektor SensorkopfThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
NatriumbicarbonatFisher ScientificS233-500
Natriumphosphat Dibasisch wasserfreiFisher ScientificBP332-500
Gläser mit quadratischer AbdeckungCorning12-553-45018 mm x 18 mm, mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm
Streptavidin MikrosphärenPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 SäuleGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 FestwinkelrotorBeckman Coulter343840
Ultraschallreiniger (Ultraschallgerät)VevorJPS-08A(DD)304 Edelstahl, 40 kHz Frequenz, 60 W Leistung
Vectabond APTES LösungVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Elektrischer Glasreiniger mit Ammoniak-DS.C. JohnsonSJN695237
NC0479433NC0107576

Referenzen

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