Markierungsfreie, hochauflösende Bildgebung durch Vibrationsbildgebung von geschwollenem Gewebe und Analyse

Zusammenfassung

Durch die Kombination der Probenexpansions-Hydrogelchemie mit der markierungsfreien, chemikalienspezifisch stimulierten Raman-Streumikroskopie beschreibt das Protokoll, wie eine markierungsfreie, hochauflösende volumetrische Bildgebung in biologischen Proben erreicht werden kann. Mit einem zusätzlichen Bildsegmentierungsalgorithmus des maschinellen Lernens wurden proteinspezifische Mehrkomponentenbilder in Geweben ohne Antikörpermarkierung erhalten.

Zusammenfassung

Die universelle Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere der hochauflösenden Mikroskopie, hat das Wissen über die moderne Biologie stark erweitert. Umgekehrt stellt die Forderung nach Fluorophormarkierung in Fluoreszenztechniken erhebliche Herausforderungen dar, wie z. B. Photobleiche und ungleichmäßige Markierung von Fluoreszenzsonden und eine langwierige Probenverarbeitung. In diesem Protokoll werden die detaillierten Arbeitsabläufe der Schwingungsbildgebung von geschwollenem Gewebe und der Analyse (VISTA) vorgestellt. VISTA umgeht Hindernisse, die mit Fluorophoren verbunden sind, und ermöglicht eine markierungsfreie, hochauflösende volumetrische Bildgebung in biologischen Proben mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 78 nm. Das Verfahren wird durch die Einbettung von Zellen und Geweben in Hydrogel, die isotrope Expansion des Hydrogel-Probenhybrids und die Visualisierung endogener Proteinverteilungen durch Vibrationsbildgebung mit stimulierter Raman-Streumikroskopie etabliert. Die Methode wird sowohl an Zellen als auch an Gehirngeweben von Mäusen demonstriert. Es wurden stark korrelative VISTA- und Immunfluoreszenzbilder beobachtet, die den Proteinursprung der Bildgebungsspezifitäten bestätigen. Unter Ausnutzung dieser Korrelation wurde ein auf maschinellem Lernen basierender Bildsegmentierungsalgorithmus trainiert, um eine Mehrkomponentenvorhersage von Zellkernen, Blutgefäßen, neuronalen Zellen und Dendriten aus markierungsfreien Bildern des Mausgehirns zu erzielen. Das Verfahren wurde weiter angepasst, um pathologische Polyglutamin (polyQ)-Aggregate in Zellen und Amyloid-beta (Aβ)-Plaques in Hirngeweben mit hohem Durchsatz zu untersuchen, was sein Potenzial für großflächige klinische Proben rechtfertigt.

Einleitung

Die Entwicklung optischer Bildgebungsverfahren hat das Verständnis der modernen Biologie revolutioniert, da sie beispiellose räumliche und zeitliche Informationen von Zielen auf verschiedenen Skalen liefern, von subzellulären Proteinen bis hin zu ganzen Organen¹. Unter ihnen ist die Fluoreszenzmikroskopie die am besten etablierte, mit einer großen Palette organischer Farbstoffe mit hohen Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeuten², einfach zu handhabenden genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen³ und hochauflösenden Methoden wie STED, PALM und STORM zur Abbildung von Strukturen im Nanometerbereich ^4,5. Darüber hinaus ermöglichen jüngste Fortschritte in der Probentechnik und Konservierungschemie, bei denen Proben, die in quellfähige Polymer-Hydrogele ^6,7,8 eingebettet sind, expandieren, eine subbeugungsbegrenzte Auflösung auf herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen. Zum Beispiel erhöht die typische Expansionsmikroskopie (ExM) die Bildauflösung effektiv um das Vierfache mit der vierfachen isotropen Probenexpansion⁷.

Trotz ihrer Vorteile weist die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie Einschränkungen auf, die sich aus der Fluorophormarkierung ergeben. Erstens beeinträchtigen das Photobleichen und die Inaktivierung von Fluorophoren die Fähigkeit für repetitive und quantitative Fluoreszenzbewertungen. Photobleichung ist ein unvermeidliches Ereignis, wenn Licht immer wieder Elektronen in elektronisch angeregte Zustände pumpt⁹. Zweitens ist die Markierung der Fluorophore zu den gewünschten Zielen nicht immer eine einfache Aufgabe. So erfordert beispielsweise die Immunfärbung einen langen und mühsamen Probenvorbereitungsprozess und behindert den bildgebenden Durchsatz¹⁰. Es könnte auch Artefakte aufgrund einer inhomogenen Antikörpermarkierung einführen, insbesondere tief im Gewebe¹¹. Darüber hinaus könnten geeignete Markierungsstrategien, die auf Fluorophore für die gewünschten Proteine abzielen, unterentwickelt sein. So waren beispielsweise umfangreiche Screenings erforderlich, um wirksame Antikörper gegen Aβ-Plaques zu finden¹². Kleinere organische Farbstoffe, wie z. B. Kongorot, haben oft eine begrenzte Spezifität und färben nur den Kern der Aβ-Plaque. Es ist daher sehr wünschenswert, eine markierungsfreie Superauflösungsmodalität zu entwickeln, die die Nachteile der Fluorophor-Markierung umgeht und eine ergänzende hochauflösende Bildgebung von Zellen über Gewebe bis hin zu großen menschlichen Proben ermöglicht.

Die Raman-Mikroskopie liefert markierungsfreien Kontrast für chemikalienspezifische Strukturen und bildet die Verteilung ansonsten unsichtbarer chemischer Bindungen ab, indem sie die angeregten Schwingungsübergänge^{betrachtet 13}. Insbesondere wurde gezeigt, dass die stimulierte Raman-Streuung (SRS) an markierungsfreien oder winzig markierten Proben eine ähnliche Geschwindigkeit und Auflösung wie die Fluoreszenzmikroskopie aufweist^14,15. Zum Beispiel wurde die gesunde Hirnregion in menschlichen und Mausgeweben leicht von einer tumorinfiltrierten Region unterschieden^16,17. Aβ-Plaques wurden auch eindeutig abgebildet, indem die Vibration des Proteins CH₃ (2940 ^cm-1) und Amid I (1660 ^cm-1) auf einem frisch gefrorenen Hirnschnitt ohne jegliche Markierung¹⁸ anvisiert wurde. Die Raman-Streuung bietet daher einen robusten, markierungsfreien Kontrast, der die Einschränkungen von Fluorophoren überwindet. Es stellte sich dann die Frage, wie man mit Hilfe der Raman-Streuung eine Superauflösungskapazität erreichen kann, die strukturelle Details und funktionelle Implikationen im Nanomaßstab in biologischen Proben aufdecken könnte.

Obwohl umfangreiche Anstrengungen unternommen wurden, um eine Superauflösung für die Raman-Mikroskopie mit eleganten optischen Instrumenten zu erreichen, war die Auflösungsverbesserung bei biologischen Proben eher begrenzt 19,20,21. Basierend auf den jüngsten Arbeiten^22,23 stellen wir hier ein Protokoll vor, das eine Probenexpansionsstrategie mit stimulierter Raman-Streuung für eine hochauflösende markierungsfreie Schwingungsbildgebung kombiniert, genannt Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). Zunächst wurden Zellen und Gewebe durch ein optimiertes Protein-Hydrogel-Hybridisierungsprotokoll in Hydrogel-Matrizen eingebettet. Die Hydrogel-Gewebehybride wurden dann in waschmittelreichen Lösungen zur Delipidierung inkubiert, gefolgt von einer Expansion in Wasser. Die expandierten Proben wurden dann mit einem regulären SRS-Mikroskop abgebildet, indem_{CH3-Schwingungen} von zurückgehaltenen endogenen Proteinen gezielt untersucht wurden. Dank seiner markierungsfreien Bildgebung umgeht VISTA Photobleaching und inhomogene Markierung, die durch die Fluorophor-Markierung entstehen, und führt zu einem viel höheren Durchsatz bei der Probenverarbeitung. Dies ist auch die erste berichtete markierungsfreie Bildgebung bei unter 100 nm (bis hinunter 78 nm). Es ist keine zusätzliche optische Instrumentierung neben dem typischen SRS-Setup^22,24 erforderlich, so dass es leicht anwendbar ist. Mit korrelativen VISTA- und Immunfluoreszenzbildern wurde ein etablierter Bildsegmentierungsalgorithmus des maschinellen Lernens trainiert ^25,26, um proteinspezifische Multiplexbilder aus Einkanalbildern zu erzeugen. Die Methode wurde ferner zur Untersuchung von Aβ-Plaques in Hirngeweben von Mäusen angewendet, um ein ganzheitliches Bild zu liefern, das sich für die Subphänotypisierung eignet, basierend auf den feinen Ansichten des Plaquekerns und der peripheren Filamente, die von Zellkernen und Blutgefäßen umgeben sind.

Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten tierexperimentellen Verfahren wurden vom California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, und die Protokollverfahren entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften.

1. Vorbereitung von Stammlösungen für die Fixierung und Probenexpansion

1. Bereiten Sie 40 ml Fixierlösung vor, indem Sie zuerst 12 g Acrylamid (30 % w/v) fest in 26 ml nukleasefreiem Wasser lösen. Fügen Sie dann 10 ml 16%ige PFA-Stammlösung zu der Mischung hinzu. Zum Schluss fügen Sie 4 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) hinzu. Die vorbereitete Lösung kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Acrylamid ist gefährlich, daher sollte der Schritt des Auflösens von festem Acrylamid in Wasser in einem Abzug durchgeführt werden.
2. Bereiten Sie eine Gelierungslösung (Stamm X) her, indem Sie 70 mg Natriumacrylat (7 % w/v), 200 mg Acrylamid (20 % w/v) und 50 μl N,N'-Methylenbisacrylamid (0,1 % w/v) in 420 μl Reinstwasser lösen. Zum Schluss 57 μl sterilfiltriertes 10x PBS (pH 7,4) zugeben und diese Lösung bis zu 1 Woche bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Natriumacrylatfeststoffe, die Klumpen bilden; Stellen Sie sicher, dass das verwendete Natriumacrylat in Form von dispersiven Pulvern vorliegt. Das hergestellte Material X wird eine farblose Flüssigkeit sein; Wenn die Flüssigkeit hellgelb aussieht, besorgen Sie sich neues Natriumacrylat.
3. Bereiten Sie die Polymerisationsinitiatorlösung vor, indem Sie 1 g Ammoniumpersulfat (APS, 10 % w/w) in 9 mL nukleasefreiem Wasser lösen. Bereiten Sie auf ähnliche Weise eine Polymerisationsbeschleunigerlösung vor, indem Sie 1 g Tetramethylethylendiamin (TEMED, 10 % w/w) in 9 ml nukleasefreiem Wasser lösen. Die resultierenden Lösungen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
4. Bereiten Sie 50 ml denaturierenden Puffer vor, indem Sie 2,88 g Natriumdodecylsulfat (SDS, 200 mM), 0,584 g Natriumchlorid (200 mM) und 2,5 ml 1 M Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 8) in nukleasefreiem Wasser lösen.
   HINWEIS: Die Konzentration von SDS liegt nahe an seinem Sättigungszustand. Eine gewisse Kristallisation im Puffer ist normal. Durch leichtes Erwärmen auf bis zu 37 °C kann die Lösung klar und gebrauchsfertig werden.

2. Vorbereitung von Säugetierzellproben

1. 3,5 x 10⁴ HeLa-Zellen auf ein 12 mm Borosilikat-Deckglas (#1,5) in einer 24-Well-Platte säen und dann die Zellen in 400 μl Modifiziertem Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Antibiotika (vollständiges DMEM) unter einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultivieren.
2. Um Zellen in verschiedenen mitotischen Stadien zu erhalten, inkubieren Sie die Zellen in vollständigem DMEM bis zu 60% Konfluenz. Behandeln Sie dann die Zellen 20 Stunden lang mit DMEM ohne fötales Rinderserum, um die Zellstadien zu synchronisieren. Wechseln Sie nach der Synchronisation das Medium, damit die Zellen das DMEM abschließen können, und inkubieren Sie weitere 2-6 Stunden, um die verschiedenen Stadien der Mitose zu erreichen.
3. Waschen Sie die HeLa-Zellen auf Deckgläsern mit sterilem PBS und inkubieren Sie sie mit Fixierlösung (4% PFA, 30% Acrylamid [AA] in PBS) bei 37 °C für 7-8 h, bevor Sie weiterverarbeitet werden.
   HINWEIS: Eine höhere Fixierungstemperatur zusammen mit einer hohen Konzentration an Acrylamid trägt dazu bei, die intermolekulare Vernetzung zwischen Proteinen während der Fixierungsprozesse zu unterdrücken, und es wird berichtet, dass die detaillierten Ultrastrukturen von Proteinen^{erhalten bleiben 8}.
4. Bei Zellen mit polyQ-Aggregaten züchten Sie die Zellen in vollständigem DMEM, bis sie eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreichen. Nach dem Wechsel zu einem neuen vollständigen DMEM transfizieren Sie 1 μg des Plasmids, das für mHtt97Q-GFP kodiert, mit einem Transfektionsmittel in die Zellen (Details in der Materialtabelle). Führen Sie die Transfektion gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
5. Nach 24-48 h Transfektion entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie 800 μl Fixierlösung (4 % PFA, 30 % AA) auf die Deckgläser mit den Zellen. Inkubieren Sie die Deckgläser bei 37 °C für 6-8 h. Waschen Sie das Deckglas mit PBS 3x, und die resultierenden Zellproben sind bereit für die weitere Verarbeitung.

3. Vorbereitung von Mäusehirnproben

1. Kaufen Sie C57BL/6J-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt, männlich und weiblich, sechs Mäuse) und Alzheimer-Mäuse (9 Monate alt, weiblich, drei Mäuse) von kommerziellen Quellen (Details in der Materialtabelle). Euthanasie durch Kohlendioxid-Narkose gemäß Standardprotokoll²⁷ durchführen. Kurz gesagt, setzen Sie die Mäuse in eine Kammer und füllen Sie die Kammer mit einem Fluss von 100 % CO₂ in der Größenordnung von 30 % bis 70 % des Volumens der Kammer/min und halten Sie den Fluss für mindestens 1 Minute nach dem klinischen Tod aufrecht.
2. Nachdem Sie die humane Euthanasie bestätigt haben, enthaupten Sie die Mäuse schnell mit einer Schere. Lege den Schädel mit einem großen Schnitt durch die Haut entlang der Mittellinie frei. Ziehen Sie die Haut in Richtung Nase des Tieres, um den Schädel vollständig freizulegen.
3. Schneide den Schädel entlang der Mittellinie mit einer feinen Schere auf und schäle die beiden Schädelhälften zur Seite weg. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn in eine Petrischale auf Eis mit PBS zu schaufeln. Waschen Sie das frische Mäusegehirn mit eiskaltem PBS und geben Sie das Gehirn in 10 ml Fixationspuffer (4% PFA, 30% AA).
4. Inkubieren Sie das Gehirn der Maus in Fixierungspuffer bei 4 °C für 24-48 h und überführen Sie es dann über Nacht auf 37 °C. Nach dem Waschen mit sterilem PBS das Gehirn der Maus mit einem Vibratom in 150 μm große Abschnitte schneiden und in PBS bei 4 °C lagern.

4. Hydrogel-Einbettung, Denaturierung und Expansion von Zell- und Gewebeproben

1. Stellen Sie sicher, dass die Proben, wie oben angegeben, für die erforderliche Zeit im Fixierungspuffer inkubiert wurden. Tauen Sie Material X, Initiator- und Beschleuniger-Stammlösungen auf und halten Sie sie während des gesamten Prozesses auf Eis.
   HINWEIS: Eine unzureichende Inkubationszeit kann zu einer verringerten Anzahl von Proteinen führen, die auf dem Hydrogel-Hybrid zurückgehalten werden, und daher zu einer Abnahme des Signals.
2. Nehmen Sie das Deckglas mit den Zellen auf und legen Sie es mit einer Pinzette auf einen Objektträger. Entnehmen Sie die Gehirnscheiben (150 μm dick) und legen Sie sie mit einem weichen Wollpinsel auf einen weiteren Objektträger, wobei Sie darauf achten, dass sie flach sind. Befreien Sie sich von überschüssiger Flüssigkeit, die mit den Proben geliefert wird.
3. Stapeln Sie zwei Deckgläser (#1.5), indem Sie Wassertropfen zwischen ihnen hinzufügen, auf beiden Seiten der Probe auf dem Objektträger, um eine Gelierungskammer zu bilden. Legen Sie den Objektträger mit der Probe nach oben auf einen eiskalten Heizblock und kühlen Sie ihn 1 Minute lang auf 4 °C ab.
4. Geben Sie 10 % (w/w) TEMED zu Stamm X und dann 10 % APS-Lösung. Rasch vortexen und innerhalb von 1 Minute nach dem Mischen die resultierende Lösung langsam in die Kammer auf die Proben tropfen, um die Oberfläche der Probe zu bedecken und Luftblasen zu vermeiden. Bewahren Sie die Lösung und die Proben auf Eis (oder einem eiskalten Wärmeblock) auf, um Gelbildung (hoher Polymerisationsgrad) zu vermeiden, bevor Sie sie der Probe hinzufügen.
5. Sobald die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist, legen Sie ein flaches, transparentes, mit Folie überzogenes Deckglas als Deckel für die Kammer auf die Probe. Lassen Sie die Kammer weitere 1 Minute auf Eis oder einem eiskalten Heizblock, bevor Sie sie 30 Minuten lang in einem Befeuchtungsinkubator bei 37 °C inkubieren.
6. Nehmen Sie die Gelierkammer auf dem Objektträger aus dem 37 °C heißen Inkubator. Nach dem Entfernen des Deckels sollte ein undurchsichtiges Gel beobachtet werden. Holen Sie das Gel durch Schneiden mit einer Rasierklinge zurück oder legen Sie den Objektträger für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einen Denaturierungspuffer. Das Gel löst sich von der Glasschiene.
7. Inkubieren Sie das isolierte Gel in einem denaturierenden Puffer unter Wärmebedingungen, um eine weitere Denaturierung und Delipidierung zu erreichen. Für Zellproben 1 h bei 95 °C denaturieren. Für 150 μm dicke Hirnschnitte 3 h lang bei 70 °C denaturieren, gefolgt von 95 °C für 1 h.
   HINWEIS: Das Gel kann lockig werden, wenn es zum ersten Mal mit denaturierendem Puffer bei Raumtemperatur inkubiert wird. Es ist normal und wird nach der Hochtemperaturdenaturierung flach. Bei der Arbeit mit dickeren Gewebeproben ist eine längere Denaturierungszeit erforderlich.
8. Nach der Wärmebehandlung waschen Sie die vergällte Probe 3x mit PBS für 10 min. Zu diesem Zeitpunkt sollte sich das Gel auf etwa das 1,5-fache der ursprünglichen Größe ausgedehnt haben. Inkubieren Sie das gewaschene Gel mit Reinstwasser in einem großen Behälter (mindestens das 20-fache Volumen des Gels), um ein höheres Expansionsverhältnis zu erzielen. Wechseln Sie das Wasser alle 1 h 3x und lassen Sie die Probe über Nacht im Dunkeln. Das resultierende Gel ist bereit für die Abbildung.
   HINWEIS: Das Expansionsverhältnis hängt weitgehend von den mechanischen Eigenschaften der Originalprobe ab. Es wurde eine 4,2-fache Expansion für die Zellproben und eine 3,4-fache Expansion für die Hirngewebeprobe erzielt.

5. Markierungsfreie Bildgebung der endogenen Proteinverteilung in expandierten Zell- und Gewebeproben

1. Bewahren Sie die expandierten Gelproben während des Bildgebungsprozesses in Wasser auf. Das Gel ist nach der Expansion zerbrechlich und sollte daher mit Vorsicht behandelt werden. Legen Sie das expandierte Probengurgel auf einen Objektträger (1 mm dick) mit einem Mikroskopabstandshalter mit entsprechenden Öffnungsgrößen und -tiefen, der mit Wasser gefüllt ist. Decken Sie den Abstandshalter mit einem Deckglas (#1.5) ab und stellen Sie sicher, dass er ordnungsgemäß abgedichtet ist, um eine Bewegung der Probe zu vermeiden.
2. Legen Sie die Probe entweder mit der expandierten Zelle oder dem Gewebe auf den motorisierten Tisch, wobei das Deckglas zum Objektiv zeigt. Klicken Sie in der Software auf Okular , um den Lichtweg auf Hellfeld zu ändern und die Z-Position mit einem manuellen Knopf einzustellen.
3. Geben Sie Immersionsöl auf die Oberseite der Probe und stellen Sie den Kondensor auf die richtige Position für die Köhler-Beleuchtung ein, während Sie unter Hellfeld mit 25-facher Vergrößerung vom Objektiv aus beobachten. Geben Sie 791,3 nm in das OPO-Wellenlängenfenster auf dem Laserpanel ein, um die_{CH3-Schwingung} des Proteins bei 2940 ^cm-1 zu erreichen.
4. Schalten Sie das Licht des Mikroskops vom Hellfeld (Okular) in den Laserscan-Modus, indem Sie auf die LSM-Taste klicken, und öffnen Sie den SRS-Laserauslöser, indem Sie die Auslösertaste auf dem Laserbedienfeld drücken. Drücken Sie die LIVE-Taste in der Mikroskopsoftware, um die Echtzeit-Bildaufnahme zu starten.
5. Finden Sie den richtigen Fokus, indem Sie den z-Wert ändern, während Sie das SRS-Bild bei kurzer Pixelverweilzeit (12,5 μs/Pixel) und niedriger Bildauflösung (256 Pixel x 256 Pixel) betrachten. Sobald die ideale Z-Position gefunden ist, ändern Sie die Scangröße und die Pixelverweilzeit, indem Sie den entsprechenden Balken in der Mikroskopsoftware ziehen.
6. Erfassen Sie das Bild, indem Sie die LSM-Taste unter Verwendung der Super-Sampling-Bedingung (1024 Pixel x 1024 Pixel) mit einer längeren Pixelverweilzeit (80 μs/Pixel) drücken, die der Zeitkonstante des Lock-in-Verstärkers entspricht. Erfassen Sie volumetrische Bilder, indem Sie einen Z-Stapel mit einer Schrittweite von 1 μm in z-Richtung aufnehmen. Verarbeiten und analysieren Sie die gespeicherte OIR-Datei aus der Software mit ImageJ.
   HINWEIS: Über die detaillierte SRS-Einrichtung wurde kürzlich in Mutlu et ^al.24 berichtet. Hier wurde ein durchstimmbarer Pikosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 MHz und einer Bandbreite von 2 ps für Pump (770-990 nm) und Stokes (1031,2 nm) in ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop geleitet (siehe Materialtabelle). Optimieren Sie die zeitliche und räumliche Überlappung der beiden Strahlen für Signale mit reinem D₂O. Es erfordert einige Anstrengungen, das richtige z für die expandierte Probe im Hellfeld zu finden, da der Brechungsindex im gesamten Gel sehr homogen ist.
7. Bestimmen Sie die Auflösung von VISTA, indem Sie ein SRS-Bild von Polystyrolkügelchen (100 nm) sowohl mit einem 25x-Objektiv als auch mit einem 60x-Objektiv aufnehmen. Stellen Sie den Pumplaser auf 784,5 nm ein, was einer Raman-Verschiebung von 3050 cm⁻¹ entspricht, die für die aromatischen C-H-Dehnungsschwingungen von Polystyrol charakteristisch ist.
   HINWEIS: Die hier verwendete Wellenlänge des Pumplasers ähnelt derjenigen, die in VISTA für Proteine verwendet wird.
8. Mit dem 60-fach-Objektiv betrug das experimentelle Halbwellenmaximum (FWHM, d. h. die Breite der Linienform bei halber Amplitude) des Perlenbildes 276,17 nm. Modellieren Sie die Funktion des Perlenobjekts als Halbkreis.
   HINWEIS: Wenn die PSF-Gauß-Funktion ein c (σ) = 269 nm/2,35 aufweist, hätte das gefaltete Perlenbild eine gemessene Halbwertsmenge von 276,17 nm. Infolgedessen beträgt die Auflösung des SRS-Systems 269 nm × 1,22 = 328 nm nach dem Rayleigh-Kriterium. Da VISTA eine durchschnittliche 4,2-fache Ausdehnung der Zellproben aufweist, beträgt die effektive Auflösung nur noch 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. Korrelative VISTA- und Fluoreszenzbildgebung von immunmarkierten und expandierten Gewebeproben

1. Nach der Denaturierung inkubieren Sie die in das Hydrogel eingebetteten Proben (z. B. 150 μm Hirnkoronalschnitt) 15 Minuten lang in 1 % (v/v) Triton X-100 (PBST). Den Inkubationspuffer mit Primärantikörper in einer Verdünnung von 1:100 auf PBST umstellen. Wenn mehrere Proteinziele für die Multiplex-Bildgebung benötigt werden, verdünnen Sie die jeweiligen Primärantikörper für verschiedene Ziele auf die richtigen Konzentrationen im selben Cocktail und inkubieren Sie gleichzeitig mit den Proben.
2. Inkubieren Sie die Gele mit verdünnten Primärantikörpern bei 37 °C unter leichtem Schütteln bei 80 U/min für 16-18 h, gefolgt von ausgiebigem Waschen 3x mit PBST für 1-2 h bei 37 °C. Drehen Sie das Gel während der Inkubation um, um eine inhomogene Antikörpermarkierung hier und in allen folgenden Inkubationen zu vermeiden.
3. Inkubieren Sie die Proben mit Sekundärantikörpern entsprechender Speziesziele bei Verdünnungen von 1:100 mit PBST bei 37 °C für 12-16 h und schützen Sie sie vor Licht. Beschriftete Hydrogelproben 3x mit PBST für 1-2 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln waschen.
4. Verdünnen Sie DAPI auf 3 μM Endkonzentration in PBS. Geben Sie ein ausreichendes Volumen DAPI-Lösung in das Probenhydrogel, so dass das Gel in die Lösung eingetaucht wird. 1-2 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bei 80 U/min inkubieren. Waschen Sie die Probe 3x mit PBS.
5. Erweitern Sie die immunmarkierten Gelproben, indem Sie mit einem großen Volumen doppelt deionisiertem H₂O inkubieren. Wechseln Sie das Wasser alle 1 h 3x und inkubieren Sie die Proben über Nacht lichtgeschützt in H₂O. Während der Markierung sollte sich das Gel im Vergleich zum PBS-Puffer um das 1,5-fache ausdehnen.
6. Bereiten Sie die Bildgebungsprobe wie in Schritt 5.1 beschrieben vor. Platzieren Sie die Bildgebungsprobe auf dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit dem 25x, 1,05 NA, Wasserimmersionsobjektiv für die Fluoreszenzbildgebung.
7. Wählen Sie den richtigen Kanal mit dem jeweiligen Anregungslaser (405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm) und PMT-Paar entsprechend den Zielantikörpern im Dropdown-Menü der Mikroskopsoftware aus. Drücken Sie die LIVE-Taste, um die Bildaufnahme in Echtzeit zu erhalten.
8. Stellen Sie die Fokusposition mit einem manuellen Knopf basierend auf dem Echtzeit-Fluoreszenzsignal ein. Optimieren Sie die Laserleistung, die Pixelverweilzeit und die PMT-Verstärkung in der Mikroskopsoftware entsprechend dem Echtzeit-Fluoreszenzsignal, um ein schwaches Signal oder eine Übersättigung zu vermeiden.
   HINWEIS: Bewerten Sie das Erscheinungsbild und die Merkmale auf der Grundlage der berichteten Strukturen verschiedener Antikörper, um potenzielle Antikörper-Kreuzreaktionen auszuschließen und ein Übersprechen zwischen verschiedenen Fluoreszenzkanälen zu vermeiden.
9. Klicken Sie auf die LSM-Taste , um korrelative SRS- und Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Sammeln Sie zunächst volumetrische Fluoreszenzbilder an immunmarkierten Proben. Sobald die Fluoreszenzbildgebung abgeschlossen ist, schalten Sie den Strahlengang des Mikroskops auf den transparenten Infrarot (IR)-Zustand um.
10. Ändern Sie den Detektionskanal in der Mikroskopsoftware von Fluoreszenz-PMT auf SRS. Öffnen Sie den Verschluss für den SRS-Laser und führen Sie die volumetrische SRS-Bildgebung im Sichtfeld derselben Probe mit demselben Bereich von z durch. Der normale Bereich liegt zwischen 100 und 200 μm und kann bis zu 700 μm reichen.
    HINWEIS: Es gibt eine leichte chromatische Aberration, die aufgrund des Wellenlängenunterschieds bei den Anregungslasern zu einer Verschiebung der Z-Position zwischen den Fluoreszenzbildern und den SRS-Bildern führt. Ein manueller Vergleich zwischen dem SRS und den Fluoreszenz-Z-Stapel-Bildern ist erforderlich. Suchen Sie sowohl vom SRS als auch vom Fluoreszenzkanal nach genau übereinstimmenden Merkmalen, um die Z-Position genau abzugleichen.

7. Aufbau, Schulung und Validierung der U-Net-Architektur

HINWEIS: Die Installation unter Linux wird empfohlen. Benötigt wird eine Grafikkarte mit >10 GB RAM.

1. Einrichten der Umgebung
   1. Installieren Sie Anaconda oder Miniconda auf einem 3-5.3.0-linux-x86_64. Klonen Sie die folgenden Dateien oder laden Sie sie herunter: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Erstellen Sie eine Conda-Umgebung für die Plattform mit der folgenden Befehlszeile:
      conda env create -f environment.yml
2. Trainieren des Vorhersagemodells
   1. Koppeln Sie die Verzeichnisse der entsprechenden SRS-Bilder mit Ground-Truth-Bildern in einer CSV-Datei. Platzieren Sie die Verzeichnisse der SRS-Bilder unter path_signal und die Ground-Truth-Bilder unter path_target Spalten.
   2. Legen Sie die CSV-Datei in den Ordner data/csvs. Ändern Sie die Konfiguration bei Bedarf in Skripten/train_model_2d.sh. Aktivieren Sie die Umgebung über die Befehlszeile:
      Conda Activate FNET
   3. Initiieren Sie das Modelltraining über die Befehlszeile:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      Anschließend startet das Training. Die Verluste für jede Iteration werden in der Befehlszeile angezeigt und mit dem Modell im Ordner save_models/ gespeichert.
3. Überprüfen Sie die Bilder im Trainingssatz und Testsatz mithilfe der Befehlszeile:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Die Vorhersageergebnisse werden im Ordner results/ gespeichert.

8. VISTA kombiniert mit U-Net-Vorhersagen für proteinspezifische Multiplexität in markierungsfreien Bildern

1. Ändern Sie die CSV-Datei unter data/csvs//test.csv. Ersetzen Sie die Verzeichnisse von path_signal und path_target durch das Verzeichnis der neuen SRS-Images.
2. Entfernen Sie die Vorhersageergebnisse aus dem Training, d. h. dem Ordner results/. Führen Sie Vorhersagen über die Befehlszeile aus:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Die Vorhersageergebnisse werden im Ordner results//test gespeichert.

Ergebnisse

Nach der Etablierung des Funktionsprinzips der Bildgebungs- und Analysemethode wurde eine Bildregistrierung durchgeführt, um das Expansionsverhältnis zu bewerten und die isotrope Expansion während der Probenverarbeitung sicherzustellen (Abbildung 1A,B). Sowohl unbehandelte als auch ^VISTA-Proben wurden abgebildet, wobei die Bindungsschwingung bei 2940 cm−1 anvisiert wurde, die von CH₃ endogener Proteine stammt. In unbehandelten Proben waren die proteinre...

Diskussion

Zusammenfassend stellen wir das Protokoll für VISTA vor, das eine markierungsfreie Modalität zur Abbildung proteinreicher zellulärer und subzellulärer Strukturen von Zellen und Geweben darstellt. Durch die gezielte Ausrichtung auf endogenes CH₃ aus Proteinen in Hydrogel-eingebetteten Zellen und Geweben erreicht die Methode eine effektive Bildgebungsauflösung von bis zu 78 nm in biologischen Proben und löst kleinere Extrusionen in Huntingtin-Aggregaten und Fibrillen in Aβ-Plaqu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	15710	verdünnt auf 4% in PBS
25x Wasserimmersionsobjektiv	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mäuse	Mutant Maus Ressourcen- und Forschungszentren und das Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/mmjax	Alzheimer-Gehirn
60x Wasser-Immersionsobjektiv	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamid	Sigma-Aldrich	A9099
Ammoniumpersulfat	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
Borosilikat-Deckglas #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normale Mäuse
D2O	Sigma-Aldrich	151882	für SRS-Kalibrierung
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
Glasobjektträger 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
Anti-Hühner-IgG für Ziegen, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
Anti-Maus-IgG für Ziegen, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Anti-Ratten-IgG für Ziegen, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal Silikon-Isolatoren	Sigma-Aldrich	GBL664108	Mikroskop-Spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Geschenk von Prof. R. Kopito und Prof. F.-U.Hartl.
Laser-Scanning-Mikroskop	Olympus	FV3000	Laser-Scanning-Konfokalmikroskop
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	Transfektionsmittel
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (Lektin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Mikroskop-Spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-Methylenbisacrylamid (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	gekauft als 2% Lösung in Wasser
Nukleasefreies Wasser	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
Poly-Strene-Kügelchen	Sigma-Aldrich	43302	für die Auflösungscharakterisierung
Natriumacrylat	Sigma-Aldrich	408220
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	71725
Weichwollpinsel #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	PICOEmerald	2ps Pulsbreite
Tetramethylethylendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
Gewebekulturflasche 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Pinzette	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotom	Leica	VT1200S	das Vibratom