Das Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus sezierten Gesichtsbehandlungen von Mausembryonen oder kultivierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus und zur Durchführung eines anschließenden Western Blotting zur Beurteilung des phosphorylierten Proteinspiegels vor.
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Methodenartikel
Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Diese morphologischen Veränderungen werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Hier werden zwei Beispiele für physiologisch relevante Kontexte zur Untersuchung der Phosphorylierung von Proteinen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren gegeben: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale Gaumendickkörperzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen. Um die übliche Barriere der Dephosphorylierung während der Proteinisolierung zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung von Phosphoproteinen ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung von Phosphoproteinen nach dem westlichen Blotting von Ganzzellproteinlysaten bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Phosphoproteine zu erhalten, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.
Einleitung
Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Bei der Maus beginnt dieser Prozess am embryonalen Tag (E) 9,5 mit der Bildung der frontonasalen Prominenz und Paaren von Oberkiefer- und Unterkieferprozessen, von denen jeder postmigratorische kraniale Neuralleistenzellen enthält. Die lateralen und medialen Nasenfortsätze entstehen aus der frontonasalen Prominenz mit dem Auftreten der Nasengruben und verschmelzen schließlich zu den Nasenlöchern. Darüber hinaus verschmelzen die medialen Nasenfortsätze und Oberkieferfortsätze zur Erzeugung ....
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Protokoll
Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Weibliche 129S4-Mäuse im Alter von 1,5-6 Monaten, die bei einer subthermoneutralen Temperatur von 21-23 ° C untergebracht waren, wurden für die Embryonenernte verwendet. Ein schematischer Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten, Software, Reagenzien und Tieren, die in diesem Protokoll verwendet ....
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Ergebnisse
Beim Versuch, die Phosphorylierung von Proteinen zu charakterisieren, die aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert wurden, zeigen die repräsentativen Ergebnisse idealerweise eine deutliche, reproduzierbare Bande nach westlichem Blotting mit einem Anti-Phosphoprotein-Antikörper, der auf oder nahe der Höhe der entsprechenden Gesamtproteinbande verläuft (Abbildung 3 ). Wenn jedoch eine ausgedehnte Phosphorylierung des Proteins auftritt, kann es zu .......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Forschern, kritische phosphorylierungsabhängige Signalereignisse während der kraniofazialen Entwicklung robust und reproduzierbar zu untersuchen. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, die eine ordnungsgemäße Erfassung von Daten und die Analyse der Ergebnisse sicherstellen. Unabhängig davon, ob Phosphoproteine aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert werden, ist es unerlässlich, sich schnell und effizient zu .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
129S4-Mäuse waren ein Geschenk von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 und K02 DE028572 bis K.A.F., F31 DE029976 bis M.A.R. und F31 DE029364 bis B.J.C.D. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Block für Mini-Trockenbad | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ Bildgebungssystem mit Image Lab-Software | Bio-Rad | 1708265 | Chemilumineszenz-Imager |
| CO2 Inkubator, Luftmantel | VWR | 10810-902 | |
| Präparieren Platine, 11 x 13 Zoll | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Elektrophoresezelle, 4-Gel, für Mini-Fertiggele mit Mini-Trans-Blot-Modul | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridisierungsofen | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Mikrozentrifuge 5415 D mit F45-24-11 Rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini-Trockenbad | Forschung Produkte International Corp | 400780 | |
| Orbitalschüttler | VWR | 89032-092 | |
| pH-Messgerät | VWR | 89231-662 | |
| Netzteil für SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rechteckige Eispfanne, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 Stereomikroskop mit Stativ K LAB, LED-Ringlicht | Zeiss | 4350649020000000 | Präpariermikroskop |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Röhrenrevolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex-Mischer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Wasserbad | VWR | 89501-472 | |
| Western-Blot-Box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materialien | |||
| Zellkulturschalen, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Zellkulturplatten, 12 Well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Zellheber | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Konische Röhrchen, Polypropylen, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 feine Pinzette | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryolöffel | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteurpipette, 5,75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteurpipette, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petrischale, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petrischale, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Beutel, transparent, Polyethylen-Auskleidung | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF-Membran | Fisher Wissenschaftliche | IPVH00010 | |
| Semken Pinzette | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Kleine Latexbirne, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Spritzenfilter, 25 mm, 0,2 μ m Porengröße | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Spritze mit Luerspitze, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transferpipette | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western-Blot-Kassettenöffnungshebel | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr Chromatographiepapier | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagenzien | |||
| 4-15% Vorgefertigte Proteingele, 10-Well, 30 & Mikro; L | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat | Sigma Aldrich | G5422-25G | Stammkonzentration 1 M |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Rinderserumalbumin, Fraktion V, Hitzeschock getestet | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromphenolblau | Fisher Scientific | ||
| Kompletter Mini-Protease-Inhibitor-Cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | Stammkonzentration 25x |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Gibco | 11965092 | mit hohem Glukosegehalt | |
| , monoklonaler Beta-Tubulin-Primärantikörper der Maus, Konzentrat 0,1 mL | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank | E7 | 1:1.000 |
| ECL Western Blotting | Substrat Fisher Scientific | PI32106 | niedriger Pikogrammbereich |
| ECL Western Blotting Substrat | Genesee Scientific | 20-302B | niedriger Femtogrammbereich |
| Elektrophoresepuffer, 5 l | Bio-Rad | 1610772 | Stammkonzentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 Gallone | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylendiamintetraessigsäure, Di Na-Salzdihydr. (kristalliner Powd./Elektrophor.) | Fisher | Scientific BP120-500 | EDTA |
| Fötales Rinderserum, charakterisiert, US-Herkunft, 500 mL | HyClone | SH30071,03 | |
| Glycerol (ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-konjugierter Sekundärantikörper, Ziegen-Anti-Maus | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20.000 |
| HRP-konjugierter Sekundärantikörper, Ziege Anti-Kaninchen-IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20.000 |
| Salzsäurelösung, 6N (zertifiziert) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 nichtionisches Detergens | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030081 | Stammkonzentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Primärantikörper | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1.000; Anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB rekombinanter Ligand, Ratte | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Rezeptor Β Primärantikörper | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1.000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stammkonzentration 100 U/ml, 100 & Mikro; g/mL |
| Phenylmethansulfonylfluorid, 99 % | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; Stammkonzentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primärer Antikörper | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1.000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Rezeptor α /PDGF Rezeptor β primärer Antikörper | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1.000 |
| Kaliumchlorid (weiße Kristalle) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Kaliumphosphat einbasisch (weiße Kristalle) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4SDS-Lösung |
| , 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Natriumchlorid (kristallin/biologisch, zertifiziert) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Natriumfluorid (Pulver/ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot für den einmaligen Gebrauch; Stammkonzentration 1 M |
| Natriumorthovanadat, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; Stammkonzentration 100 mM |
| Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei (granuliert oder pulver/ACS-zertifiziert) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Gewebekultur PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transferpuffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | Stammkonzentration 10x |
| Tris-Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Molekularbiologie) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western Blot Molekulargewichtsmarker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Weiblich 129S4 Mäuse | Schenkung von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai |
Referenzen
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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Nachdrucke und Genehmigungen
