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Methodenartikel

Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse

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DOI:

10.3791/63834

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1. April 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus sezierten Gesichtsbehandlungen von Mausembryonen oder kultivierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus und zur Durchführung eines anschließenden Western Blotting zur Beurteilung des phosphorylierten Proteinspiegels vor.

Zusammenfassung

Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Diese morphologischen Veränderungen werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Hier werden zwei Beispiele für physiologisch relevante Kontexte zur Untersuchung der Phosphorylierung von Proteinen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren gegeben: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale Gaumendickkörperzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen. Um die übliche Barriere der Dephosphorylierung während der Proteinisolierung zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung von Phosphoproteinen ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung von Phosphoproteinen nach dem westlichen Blotting von Ganzzellproteinlysaten bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Phosphoproteine zu erhalten, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.

Einleitung

Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Bei der Maus beginnt dieser Prozess am embryonalen Tag (E) 9,5 mit der Bildung der frontonasalen Prominenz und Paaren von Oberkiefer- und Unterkieferprozessen, von denen jeder postmigratorische kraniale Neuralleistenzellen enthält. Die lateralen und medialen Nasenfortsätze entstehen aus der frontonasalen Prominenz mit dem Auftreten der Nasengruben und verschmelzen schließlich zu den Nasenlöchern. Darüber hinaus verschmelzen die medialen Nasenfortsätze und Oberkieferfortsätze zur Erzeugung der Oberlippe. Gleichzeitig wird die Palatogenese mit der Bildung von deutlichen Auswüchsen - den sekundären palatalen Regalen - von der oralen Seite der Oberkieferprozesse bei E11.5 eingeleitet. Im Laufe der Zeit wachsen die Gaumenböden auf beiden Seiten der Zunge nach unten, heben sich in eine entgegengesetzte Position über der Zunge und verschmelzen schließlich an der Mittellinie, um einen kontinuierlichen Gaumen zu bilden, der die Nasen- und Mundhöhle durch E16.51 trennt.

Diese morphologischen Veränderungen während der kraniofazialen Entwicklung werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Zum Beispiel werden Zellmembranrezeptoren, wie Unterfamilien von TGF)-β-Rezeptoren (transforming growth factor), einschließlich knochenmorphogenetischer Proteinrezeptoren (BMPRs), und verschiedener Rezeptortyrosinkinase (RTK) -Familien, bei Ligandenbindung und Aktivierung in kranialen Neuralleistenzellen autophosphoryliert 2,3,4 . Darüber hinaus wird der G-Protein-gekoppelte Transmembranrezeptor Smoothened in kranialen Neuralleistenzellen und kraniofazialen Ektoderm stromabwärts des Sonic Hedgehog (SHH) -Liganden, der an den Patched1-Rezeptor bindet, phosphoryliert, was zu einer geglätteten Akkumulation an der Ziliarmembran und SHH-Signalwegaktivierungführt 5. Solche Liganden-Rezeptor-Interaktionen können durch autokrine, parakrine und/oder juxtacrine Signalgebung in kraniofazialen Kontexten auftreten. Zum Beispiel ist bekannt, dass BMP6 während der Chondrozytendifferenzierung6 autokrin signalisiert, während der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) 8 im Rachenbogenektoderm exprimiert wird und an Mitglieder der FGF-Familie von RTKs bindet, die im Pharynxbogenmesenchym parakrin ausgedrückt werden, um die Strukturierung und das Auswachsen der Pharynxbögeneinzuleiten 7, 8,9,10 Darüber hinaus wird die Notch-Signalgebung sowohl in Chondrozyten als auch in Osteoblasten während der kraniofazialen Skelettentwicklung durch Juxtacrin-Signalisierung aktiviert, wenn Transmembran-Delta- und/oder Jagged-Liganden an Transmembran-Notch-Rezeptoren auf benachbarten Zellen binden, die anschließend gespalten und phosphoryliertwerden 11. Es gibt jedoch andere Liganden- und Rezeptorpaare, die für die kraniofaziale Entwicklung wichtig sind und die Flexibilität haben, sowohl bei der autokrinen als auch bei der parakrinen Signalgebung zu funktionieren. Als Beispiel wurde während der Morphogenese des murinen Zahns gezeigt, dass der von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF)-AA-Ligand autokrin signalisiert, den RTK PDGFRα im Schmelzorganepithel12 zu aktivieren. Im Gegensatz dazu werden bei murinen Gesichtsprozessen während der mittleren Schwangerschaft Transkripte, die für die Liganden PDGF-AA und PDGF-CC kodieren, im kraniofazialen Ektoderm exprimiert, während der PDGFRα-Rezeptor im zugrunde liegenden Schädelneuralkamm-abgeleiteten Mesenchym exprimiert wird, was zu einer parakrinen Signalgebung 13,14,15,16,17 führt. . Unabhängig vom Signalmechanismus führen diese Rezeptorphosphorylierungsereignisse häufig zur Rekrutierung von Adapterproteinen und/oder Signalmolekülen, die häufig selbst phosphoryliert werden, um intrazelluläre Kinasekaskaden wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) -Signalweg18,19 zu initiieren.

Die terminalen intrazellulären Effektoren dieser Kaskaden können dann eine Reihe von Substraten phosphorylieren, wie Transkriptionsfaktoren, RNA-bindende, zytoskelettale und extrazelluläre Matrixproteine. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 und Sox9 26 gehören zu den Transkriptionsfaktoren, die im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert werden. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) kann sich unter anderem direkt auf die Anfälligkeit für alternative PTMs, Dimerisierung, Stabilität, Spaltung und/oder DNA-bindende Affinität auswirken20,21,25,26. Zusätzlich wird das RNA-bindende Protein Srsf3 im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert, was zu seiner Kerntranslokation27 führt. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von RNA-bindenden Proteinen ihre subzelluläre Lokalisation, Protein-Protein-Interaktionen, RNA-Bindung und / oder Sequenzspezifität beeinflusst28. Darüber hinaus kann die Phosphorylierung von Actomyosin während der kraniofazialen Entwicklung zu zytoskelettalen Umlagerungen führen 29,30, und die Phosphorylierung extrazellulärer Matrixproteine, wie kleine integrinbindende Liganden-N-verknüpfte Glykoproteine, trägt zur Biomineralisierung während der Skelettentwicklungbei 31. Durch die oben genannten und zahlreiche andere Beispiele ist es offensichtlich, dass es weitreichende Implikationen für die Proteinphosphorylierung während der kraniofazialen Entwicklung gibt. Durch Hinzufügen einer zusätzlichen Regulierungsebene wird die Proteinphosphorylierung durch Phosphatasen weiter moduliert, die Kinasen entgegenwirken, indem sie Phosphatgruppen entfernen.

Diese Phosphorylierungsereignisse sowohl auf Rezeptor- als auch auf Effektormolekülebene sind entscheidend für die Ausbreitung von Signalwegen und führen letztendlich zu Veränderungen der Genexpression im Zellkern, die spezifische Zellaktivitäten wie Migration, Proliferation, Überleben und Differenzierung vorantreiben, die zu einer ordnungsgemäßen Bildung des Säugetiergesichts führen. Angesichts der Kontextspezifität von Proteininteraktionen mit Kinasen und Phosphatasen, der daraus resultierenden Veränderungen der PTMs und ihrer Auswirkungen auf die Zellaktivität ist es wichtig, dass diese Parameter in einem physiologisch relevanten Umfeld untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis des Beitrags von Phosphorylierungsereignissen zur kraniofazialen Entwicklung zu erhalten. Hier werden Beispiele für zwei Kontexte geliefert, in denen die Phosphorylierung von Proteinen und damit die Aktivierung von Signalwegen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren untersucht werden kann: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale palatale Mesenchymzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen - sowohl primär32 als auch immortalisiert33 . Bei E11.5 verschmelzen die Oberkieferfortsätze mit den lateralen und medialen Nasenfortsätzen1 und stellen damit einen kritischen Zeitpunkt während der kraniofazialen Entwicklung der Maus dar. Darüber hinaus wurden hier Oberkieferprozesse und Zellen aus den palatalen Regalen ausgewählt, da letztere Strukturen Derivate der ersteren sind, was den Forschern die Möglichkeit bietet, die Proteinphosphorylierung in vivo und in vitro in verwandten Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll gilt jedoch auch für alternative Gesichtsprozesse und Entwicklungszeitpunkte.

Ein kritisches Problem bei der Untersuchung phosphorylierter Proteine besteht darin, dass sie während der Proteinisolierung durch reichlich vorhandene Umweltphosphatasen leicht dephosphoryliert werden können. Um diese Barriere zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung phosphorylierter Proteine ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung phosphorylierter Proteine bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Signalwege zu gewinnen, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Weibliche 129S4-Mäuse im Alter von 1,5-6 Monaten, die bei einer subthermoneutralen Temperatur von 21-23 ° C untergebracht waren, wurden für die Embryonenernte verwendet. Ein schematischer Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten, Software, Reagenzien und Tieren, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Ernte von E11.5 Mausembryonen

  1. Euthanasie schwangere weibliche Maus 11,5 Tage nach dem Nachweis eines Vaginalpfropfens während der zeitgesteuerten Paarung in einer CO 2-Kammer unter Verwendung der IACUC-zugelassenen CO 2-Flussrate, die für eine Verschiebung von etwa 50% (2,95 l / min ineiner 360 in 3 Kammer) und die Dauer der Exposition erforderlich ist (siehe Materialtabelle). Führen Sie Zervixdislokationen als sekundäre Methode der Euthanasie durch. Fahren Sie sofort mit der Sezierung fort.
  2. Legen Sie den Mauskörper mit der Bauchseite nach oben auf ein Sezierbrett. Besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie die Haut annektieren und anheben Sie sie mit gerader Semken-Pinzette zur Vaginalöffnung und schneiden Sie die angehobene Haut und die darunter liegenden Schichten mit einer geraden chirurgischen Schere in einem Winkel von 45 ° auf beiden Seiten, um eine "V" -Form zu erzeugen, die sich etwa auf halbem Weg zwischen den Vorder- und Hinterbeinen auf jede laterale Oberfläche erstreckt.
  4. Mit der Semken-Pinzette eines der Gebärmutterhörner greifen und mit der chirurgischen Schere unterhalb des Eileiters und oberhalb des Gebärmutterhalses schneiden. Schneiden Sie das Mesometrium weg, um eine vollständige Entfernung des Gebärmutterhorns zu ermöglichen.
  5. Überführen Sie das sezierte Uterushorn auf 10 ml histologische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4 monobasic, 10,14 mM Na2HPO 4 dibasic, pH7,4] in einer 10 cm Petrischale.
  6. Entfernen Sie das zweite Uterushorn auf der gegenüberliegenden Seite der Bauchhöhle mit dem gleichen Verfahren, das in den Schritten 1.4-1.5 beschrieben ist.
  7. Legen Sie die 10 cm große Petrischale mit beiden Uterushörnern auf Eis, wenn Sie nicht sofort mit der Sezierung einzelner Embryonen fortfahren (d.h. wenn eine zweite weibliche Maus seziert wird).
  8. Sezieren Sie unter einem sezierenden Stereomikroskop vorsichtig jeden Embryo mit einer feinen Pinzette von Dumont #5 aus den Gebärmutterhörnern. Ziehen Sie das Myometrium, die Dezidua und das Chorion langsam weg. Reißen und entfernen Sie das relativ durchsichtige Amnion, das den Embryo umgibt, und durchtrennen Sie die Nabelschnur, die den Embryo mit der Plazenta verbindet.
  9. Transfer jedes sezierten Embryos auf 2,5 ml Histologie PBS in einem individuellen Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette oder einem Embryolöffel.
    HINWEIS: Wenn Sie mit einem Wurf arbeiten, der Embryonen von mehr als einem Genotyp enthalten kann, bewahren Sie das Amnion, das jeden Embryo umgibt, für die Genotypisierung auf, indem Sie jeden in sein eigenes vorbeschriftetes 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis legen.

2. Sezieren von Oberkieferfortsätzen aus E11.5-Mausembryonen

  1. Bereiten Sie drei 10-cm-Petrischalen mit 10 ml Histologie-PBS vor und bewahren Sie sie auf Eis auf, um sie in Rotation zwischen Embryonen zu verwenden.
  2. Übertragen Sie einen Embryo aus einer individuellen Vertiefung der 12-Well-Zellkulturplatte auf eine der 10 cm Petrischalen mit Histologie-PBS auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette oder einem Embryolöffel.
  3. Trennen Sie unter dem Seziermikroskop jeden Oberkieferfortsatz mit der feinen Pinzette vom Gesicht. Schneiden Sie zunächst die vordere Seite eines Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Vertiefung ab, die den lateralen Nasenfortsatz und den Oberkieferfortsatz trennt (Abbildung 2A).
  4. Zweitens schneiden Sie die hintere Seite des Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Einkerbung, die den Oberkieferfortsatz und den Unterkieferfortsatz trennt (Abbildung 2A).
  5. Drittens, um den Oberkieferprozess vollständig zu trennen, machen Sie einen vertikalen Schnitt von der vorderen zur hinteren Seite des Oberkieferfortsatzes auf der Augenseite des Oberkieferfortsatzes, wo die oben genannten natürlichen Einkerbungen enden (Abbildung 2A-C).
  6. Wiederholen Sie diese drei Schnitte für den Oberkieferfortsatz auf der gegenüberliegenden Seite des Gesichts.
  7. Übertragen Sie das sezierte Paar von Oberkieferfortsätzen und einen kleinen Tröpfchen von etwa 30 μL Histologie-PBS mit einer 9-Zoll-Pasteur-Pipette mit einer kleinen 2-ml-Latexflasche auf eine beschriftete 35-mm-Petrischale auf Eis (Abbildung 2D).
  8. Befolgen Sie die Schritte 2.3-2.7 für jeden Embryo und drehen Sie die drei 10 cm langen Petrischalen mit Histologie-PBS auf Eis zwischen den Embryonen. Legen Sie einzelne Paare von sezierten Oberkieferfortsätzen in separate 35 mm Petrischalen auf Eis.
    HINWEIS: Die Trennung des Oberkieferfortsatzes Ektoderm und Mesenchym (Schritte 2.9-2.17) kann nach der Sezierung der Oberkieferfortsätze aller Embryonen im Wurf durchgeführt werden. Wenn intakte Oberkieferfortsätze, die sowohl das Ektoderm als auch den Mesenchym enthalten, erwünscht sind, fahren Sie mit Schritt 2.18 fort.
  9. Bereiten Sie 250 μL frisches 2% Trypsin in Gewebekultur PBS und 250 μL 10% fetales Rinderserum (FBS) in Gewebekultur PBS vor und lagern Sie es auf Eis.
  10. Geben Sie ein zweites, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL 2% Trypsin in die 35-mm-Petrischale, getrennt von dem ersten, kleinen Tröpfchen der Histologie PBS, das die Oberkieferprozesse enthält. Übertragen Sie das Paar der Oberkieferfortsätze mit der Pasteur-Pipette auf das kleine Tröpfchen von 2% Trypsin (Abbildung 2D).
  11. Die Schale 15 min auf Eis ausbrüten.
  12. Die 35 mm Petrischale aus dem Eis nehmen und unter das Seziermikroskop stellen.
  13. Mit der feinen Pinzette ziehen Sie langsam und vorsichtig die Schicht des Ektoderms von jedem Oberkieferprozess ab (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Wenn sich das Ektoderm in einer intakten Schicht nicht vom Mesenchym trennt, inkubieren Sie 2% Trypsin bei Raumtemperatur (RT) für bis zu 5 weitere Minuten, bevor Sie mit der Trennung fortfahren. Wenn das Gewebe im 2% igen Trypsin zu zerfallen beginnt, bewegen Sie die Oberkieferprozesse wie unten beschrieben auf das 10% FBS, um das Trypsin zu neutralisieren und die Trennung von Ektoderm und Mesenchym zu beenden.
  14. Sobald der Oberkieferfortsatz Ektoderm und Mesenchym getrennt sind (Abbildung 2F), übertragen Sie die gewünschten Gewebe aus dem Paar der Oberkieferprozesse mit der Pasteur-Pipette auf ein drittes, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL von 10% FBS - getrennt von den beiden vorherigen kleinen Tröpfchen - (Abbildung 2D).
  15. Stellen Sie die 35 mm Petrischale auf Eis, um die Trypsinisierung zu stoppen.
  16. Inkubieren Sie das Oberkieferprozessgewebe auf Eis in 10% FBS für 1-2 min und übertragen Sie dann das Gewebe aus beiden Oberkieferprozessen auf ein viertes, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL vorgekühlter Histologie PBS auf Eis - getrennt von den drei vorherigen kleinen Tröpfchen - mit der Pasteur-Pipette (Abbildung 2D).
  17. Inkubieren Sie das Oberkieferprozessgewebe in Histologie PBS für 1 Minute, während Sie das Histologie-PBS vorsichtig um das Oberkieferprozessgewebe mit der Spitze der Pasteur-Pipette wirbeln, um sicherzustellen, dass alle FBS vom Gewebe abgespült werden.
  18. Übertragen Sie das Paar Oberkieferprozessgewebe mit der Pasteur-Pipette auf ein markiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, wodurch der Transfer von Histologie-PBS minimiert wird. Entfernen Sie überschüssiges Histologie-PBS im 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Pasteur-Pipette.
  19. Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Oberkieferprozesse von jedem Embryo im Wurf zu sezieren.
  20. Verarbeiten Sie die Proben sofort, um Ganzzellproteinlysate (unten) zu isolieren oder langfristig bei -80 °C zu lagern. Vor der Langzeitlagerung das 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem Bad mit 100% EtOH auf Trockeneis für 5 min einfrieren.

3. Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Oberkieferprozessen der Maus

  1. Waren Oberkiefer zuvor bei -80 °C eingefroren, tauen Sie sie auf Eis auf.
  2. 0,1 ml eiskalten NP-40-Lysepuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; gelagert bei 4 °C) mit Protease- und Phosphataseinhibitoren (1x kompletter Mini-Proteaseinhibitor-Cocktail [in Wasser gelöst; gelagert bei -20 °C], 1 mM PMSF [gelöst in Isopropanol; gelagert bei 4 °C], 10 mM NaF [gelagert bei -20 °C; Frost/Tauwetter vermeiden], 1 mMNa3VO 4 [gelagert bei -20 °C], 25 mM β-Glycerophosphat [gelagert bei4 °C]) unmittelbar vor der Verwendung auf Eis hinzugefügt.
    HINWEIS: Die Zellfraktionierung kann alternativ durchgeführt werden, um zytoplasmatische, nukleare, Membran- oder mitochondriale Proteinfraktionen zu isolieren.
  3. Mit einem 200 μL Pipetman 10 Mal auf und ab pipettieren.
  4. Wirbeln Sie für 10 s und pipettieren Sie dann 10 Mal mit einem 200-μL-Pipetman auf und ab. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen.
  5. Inkubieren Sie bei 4 °C für 2 h und drehen Sie sich Ende über Ende mit einem 1,5 ml/2 ml Paddel mit einem Rohrrevolver.
  6. Die Proben werden bei 13.500 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
  7. Sammeln Sie den Überstand zu einem neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem 200-ml-Pipetten.
  8. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Proteinassay-Kit unter Verwendung von 10 μL Proteinlysat + 10 μL NP-40-Lysepuffer für experimentelle Proben und 3-5 Verdünnungen von Rinderserumalbumin (Fraktion V) (BSA) im NP-40-Lysepuffer in einem Bereich von 0,25-2,0 mg / ml als Proteinstandards.
  9. Fahren Sie mit der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) fort (Schritt 5) oder frieren Sie die restlichen Lysate schnell auf Trockeneis ein und lagern Sie sie langfristig bei -80 °C.

4. Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus primären und/oder immortalisierten embryonalen mesenchymzellen (MEPM) der Maus

HINWEIS: Die Isolierung und Kultur von primären MEPM-Zellen aus E13.5-Mausembryonen und immortalisierten MEPM-Zellen wurde zuvorbeschrieben 32,33,34. Die Stimulation von Zellen mit Wachstumsfaktor (Schritte 4.1-4.7) kann vor der Zelllyse durchgeführt werden. Wenn nicht stimulierte Zellen gewünscht werden, fahren Sie mit Schritt 4.8 unten fort.

  1. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium [Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 10% FBS] aus den MEPM-Zellen bei ~70% Zusammenfluss in einer 6 cm Zellkulturschale mit einer 5,75" Pasteur-Pipette, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist.
  2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml Gewebekultur-PBS.
  3. 3 ml Serumhungermedium [DMEM mit 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 0,1% FBS] in einem 37 °C warmen Wasserbad zugeben.
  4. Inkubieren bei 37 °C und 5% CO2 für 23 h.
  5. Ersetzen Sie das Serumhungermedium durch 3 ml frisches, vorgewärmtes Serumhungermedium.
  6. Inkubieren bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h.
  7. Stimulieren Sie die Zellen mit dem Wachstumsfaktor Ihrer Wahl in einer empirisch bestimmten Konzentration für die gewünschte Zeitspanne.
  8. Aspirieren Sie das Medium aus den MEPM-Zellen bei 80% -100% Konfluenz mit einer 5,75" Pasteur-Pipette, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist.
  9. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Gewebekultur-PBS (1 ml für eine 6 cm Zellkulturschale); Kippen Sie die Platte während der letzten Wäsche zur Seite, um sicherzustellen, dass das gesamte PBS der Gewebekultur abgesaugt wird.
  10. Lysieren Sie die Zellen, indem Sie einen eiskalten NP-40-Lysepuffer mit Protease- und Phosphatasehemmern hinzufügen, die unmittelbar vor dem Gebrauch hinzugefügt werden (0,1 ml für eine 6 cm Zellkulturschale) auf Eis.
  11. Inkubieren Sie die Platte für 5 Minuten auf Eis mit einer Rotation von etwa jeder Minute, um eine vollständige Abdeckung der Platte zu gewährleisten.
  12. Kratzen Sie die Zellen mit einem vorgekühlten Zelllifter von der Platte und übertragen Sie die Zellsuspension auf ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
  13. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C für 30 Minuten, während Sie sich Ende über Ende mit einem 1,5 ml/2 ml Paddel mit einem Rohrrevolver drehen.
  14. Fahren Sie mit den oben beschriebenen Schritten 3.6-3.9 fort.

5. Westliches Blotting von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder MEPM-Zellen für Phosphoproteine

  1. Bereiten Sie Ganzzellprotein-Lysatproben für SDS-PAGE vor.
    1. Bestimmen Sie die Menge des zu ladenden Proteins, abhängig von der Proteinhäufigkeit im Gewebe / in der Zelle; 12,5 μg reichen in der Regel für robust exprimierte Proteine in Ganzzellproteinlysaten.
    2. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Laemmli-Puffer [20% Glycerin, 4% SDS, 0,004% Bromphenolblau, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] mit 10% β-Mercaptoethanol hinzu, das unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt wird.
      ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist haut- oder augenätzend, giftig, gefährlich, wenn es verschluckt wird, und hat aquatische Toxizität. Behandeln Sie Handschuhe, einen Laborkittel, einen Gesichtsschutz und eine Schutzbrille in einer chemischen Abzugshaube. Entsorgen Sie gemäß den Richtlinien für Umweltgesundheit und Sicherheit.
    3. Mischen durch Wirbeln.
    4. Erhitzen Sie die Proben bei 100 °C für 5 min in einem Mini-Trockenbad.
    5. Mischen Sie durch Vortexing und legen Sie die Proben auf Eis.
    6. Zentrifuge bei 9.400 × g für 5 min bei 4 °C.
    7. Die Proben vor dem Einlegen in SDS-PAGE Gel kurz auf Eis legen oder bei -20 °C langfristig lagern.
  2. Führen Sie SDS-PAGE mit einer Elektrophoresezelle mit einem 4%-15% vorgefertigten Proteingel und Elektrophoresepuffer35 durch.
  3. Elektrotransfer der Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran unter Verwendung eines Transferpuffers mit 0%-20% Methanol (0%-10% für Proteine größer als 100 kDa; 20% für Proteine unter 100 kDa), die unmittelbar vor der Verwendung35 zugegeben werden.
  4. Blockieren Sie die Membran und Sonde für Phosphoprotein von Interesse.
    1. Nach dem Transfer waschen Sie die Membran in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] für 5 min in einer westlichen Blot-Box.
    2. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml Sperrpuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; gut gemischt und durch einen 25 mm Spritzenfilter mit 0,2 μm Poren mit einer 10 ml Spritze mit Luerspitze] für 1 h in einer Western Blot Box mit Rührung auf einem Orbitalschüttler filtriert.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei der Charakterisierung von Phosphoproteinen keine Milch als Blockiermittel, da sie das Phosphoprotein Casein enthält, das ein hohes, unspezifisches Hintergrundsignal verursachen kann.
    3. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 min in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in einer Western Blot-Box mit Rührung auf einem Orbitalschüttler.
    4. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml primärem Antikörper, verdünnt im blockierenden Puffer bei 4 ° C über Nacht in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einem 50 ml Paddel mit einem Röhrenrevolver.
      HINWEIS: Die geeignete Konzentration für Western Blotting finden Sie im Antikörper-Datenblatt.
    5. Waschen Sie die Membran dreimal bei RT für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    6. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml geeigneter Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter sekundärer Antikörper, verdünnt im Blockpuffer für 1 h in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    7. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    8. Inkubieren Sie die Membran in ECL-Western-Blotting-Substrat (Enhanced Chemiluminescence) [Mischen gleicher Volumina aus den Flaschen 1 und 2; jeweils 0,5 ml für große (8,6 cm x 6,7 cm) Membranen] für 1 min und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran kontinuierlich dem ECL-Western-Blotting-Substrat ausgesetzt wird.
    9. Entwässern Sie die Membran des überschüssigen ECL-Western-Blotting-Substrats und entwickeln Sie sich sofort mit einem Chemilumineszenz-Imager.
  5. Entfernen Sie die Membran und resonde für das gesamte Protein von Interesse.
    1. Legen Sie die PVDF-Membran in einen transparenten Beutel mit Polyethylenauskleidung, der 5 ml Stripping-Puffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] enthält, wobei unmittelbar vor Gebrauch 8 μL/ml β-Mercaptoethanol hinzugefügt werden.
    2. Inkubieren bei 50 °C für 30 min mit Schaukeln in einem Hybridisierungsofen bei 11 Umdrehungen pro Minute.
    3. Waschen Sie die Membran dreimal bei RT für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    4. Fahren Sie mit den oben beschriebenen Schritten 5.4.2-5.4.9 fort.
  6. Quantitieren Sie die Western-Blot-Banddichten mit der ImageJ-Software und normalisieren Sie die Spiegel des phosphorylierten Proteins von Interesse auf die Spiegel des Gesamtproteinsvon Interesse 36.

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Ergebnisse

Beim Versuch, die Phosphorylierung von Proteinen zu charakterisieren, die aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert wurden, zeigen die repräsentativen Ergebnisse idealerweise eine deutliche, reproduzierbare Bande nach westlichem Blotting mit einem Anti-Phosphoprotein-Antikörper, der auf oder nahe der Höhe der entsprechenden Gesamtproteinbande verläuft (Abbildung 3 ). Wenn jedoch eine ausgedehnte Phosphorylierung des Proteins auftritt, kann es zu ...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Forschern, kritische phosphorylierungsabhängige Signalereignisse während der kraniofazialen Entwicklung robust und reproduzierbar zu untersuchen. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, die eine ordnungsgemäße Erfassung von Daten und die Analyse der Ergebnisse sicherstellen. Unabhängig davon, ob Phosphoproteine aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert werden, ist es unerlässlich, sich schnell und effizient zu ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

129S4-Mäuse waren ein Geschenk von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 und K02 DE028572 bis K.A.F., F31 DE029976 bis M.A.R. und F31 DE029364 bis B.J.C.D. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
Block für Mini-TrockenbadResearch Products International Corp400783
ChemiDoc XRS+ Bildgebungssystem mit Image Lab-SoftwareBio-Rad1708265Chemilumineszenz-Imager
CO2 Inkubator, LuftmantelVWR10810-902
Präparieren Platine, 11 x 13 ZollFisher Scientific09 002 12
Elektrophoresezelle, 4-Gel, für Mini-Fertiggele mit Mini-Trans-Blot-ModulBio-Rad1658030
HybridisierungsofenFisher ScientificUVP95003001
Mikrozentrifuge 5415 D mit F45-24-11 Rotor (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini-TrockenbadForschung Produkte International Corp400780
OrbitalschüttlerVWR89032-092
pH-MessgerätVWR89231-662
Netzteil für SDS-PAGEBio-Rad1645050
Rechteckige Eispfanne, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 Stereomikroskop mit Stativ K LAB, LED-RinglichtZeiss4350649020000000Präpariermikroskop
TimerVWR62344-641
RöhrenrevolverFisher Scientific11 676 341
Vortex-MischerFisher Scientific02 215 414
WasserbadVWR89501-472
Western-Blot-BoxFisher ScientificNC9358182
Materialien
Zellkulturschalen, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Zellkulturplatten, 12 WellFisher Scientific07-200-82
ZellheberFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Konische Röhrchen, Polypropylen, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 feine PinzetteFine Science Tools11254-20
EmbryolöffelFine Science Tools10370-17
Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mLVWR89000-010
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mLVWR20170-038
Pasteurpipette, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Pasteurpipette, 9"VWR14672-380
Petrischale, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Petrischale, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Beutel, transparent, Polyethylen-AuskleidungFisher Scientific01-812-25B
PVDF-MembranFisher WissenschaftlicheIPVH00010
Semken PinzetteFine Science Tools11008-13
Kleine Latexbirne, 2 mLVWR82024-554
Chirurgische SchereFine Science Tools14002-12
Spritzenfilter, 25 mm, 0,2 μ m PorengrößeFisher Scientific09-740-108
Spritze mit Luerspitze, 10 mLVWRBD309604
TransferpipetteFisher Scientific13-711-22
Western-Blot-KassettenöffnungshebelBio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr ChromatographiepapierFisher Scientific05-714-5
Reagenzien
4-15% Vorgefertigte Proteingele, 10-Well, 30 & Mikro; LBio-Rad4561083
β-Glycerophosphat DinatriumsalzhydratSigma AldrichG5422-25GStammkonzentration 1 M
β-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-100ML
Rinderserumalbumin, Fraktion V, Hitzeschock getestetFisher ScientificBP1600-100
BromphenolblauFisher Scientific
Kompletter Mini-Protease-Inhibitor-CocktailSigma Aldrich11836153001Stammkonzentration 25x
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad500-0112
Gibco11965092mit hohem Glukosegehalt
, monoklonaler Beta-Tubulin-Primärantikörper der Maus, Konzentrat 0,1 mLEntwicklungsstudien Hybridoma BankE71:1.000
ECL Western BlottingSubstrat Fisher ScientificPI32106niedriger Pikogrammbereich
ECL Western Blotting SubstratGenesee Scientific20-302Bniedriger Femtogrammbereich
Elektrophoresepuffer, 5 lBio-Rad1610772Stammkonzentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 GalloneDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Ethylendiamintetraessigsäure, Di Na-Salzdihydr. (kristalliner Powd./Elektrophor.)FisherScientific BP120-500EDTA
Fötales Rinderserum, charakterisiert, US-Herkunft, 500 mLHyCloneSH30071,03
Glycerol (ACS-zertifiziert)Fisher ScientificG33-4
HRP-konjugierter Sekundärantikörper, Ziegen-Anti-MausJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20.000
HRP-konjugierter Sekundärantikörper, Ziege Anti-Kaninchen-IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20.000
Salzsäurelösung, 6N (zertifiziert)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 nichtionisches DetergensFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-GlutaminGibco25030081Stammkonzentration 200 mM
MethanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) PrimärantikörperCell Signaling Technology9102S1:1.000; Anti-Erk1/2
PDGF-BB rekombinanter Ligand, RatteFisher Scientific520BB050
PDGF Rezeptor Β PrimärantikörperCell Signaling Technology3169S1:1.000
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Stammkonzentration 100 U/ml, 100 & Mikro; g/mL
Phenylmethansulfonylfluorid, 99 %Fisher ScientificAC215740100PMSF; Stammkonzentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primärer AntikörperCell Signaling Technology9101S1:1.000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Rezeptor α /PDGF Rezeptor β primärer AntikörperCell Signaling Technology3170S1:1.000
Kaliumchlorid (weiße Kristalle)Fisher ScientificBP366-500KCl
Kaliumphosphat einbasisch (weiße Kristalle)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4SDS-Lösung
, 10%Bio-Rad161-0416
Natriumchlorid (kristallin/biologisch, zertifiziert)Fisher ScientificS671-3NaCl
Natriumfluorid (Pulver/ACS-zertifiziert)Fisher ScientificS299-100NaF; aliquot für den einmaligen Gebrauch; Stammkonzentration 1 M
Natriumorthovanadat, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; Stammkonzentration 100 mM
Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei (granuliert oder pulver/ACS-zertifiziert)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Gewebekultur PBSFisher Scientific21-031-CV
Transferpuffer, 5 LBio-Rad1610771Stammkonzentration 10x
Tris-Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Molekularbiologie)Fisher ScientificBP152-1
TrypsinBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western Blot MolekulargewichtsmarkerBio-Rad1610374
Software
ImageJ SoftwareNational Institutes of Health
Animals
Weiblich 129S4 MäuseSchenkung von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai
AC403140050DMEM, E7

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Isolierung von Proteinlysatenkraniofaziale EntwicklungProteinphosphorylierungWestern BlotPhosphatase InhibitorenZelllysepufferSignaltransduktion
Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse
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