Ein integrierter Ansatz zur Identifizierung und Sequenzanalyse von Mikroproteinen

Omar Brito-Estrada; Keira R. Hassel; Catherine A. Makarewich

doi:10.3791/63841

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Methodenartikel

Ein integrierter Ansatz zur Identifizierung und Sequenzanalyse von Mikroproteinen

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DOI:

10.3791/63841

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12. Juli 2022

Omar Brito-Estrada^*¹ , Keira R. Hassel^*¹ , Catherine A. Makarewich¹^,²

¹The Heart Institute, Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ²Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Analyse genomischer Regionen von Interesse auf Mikroprotein-kodierendes Potenzial mit PhyloCSF im benutzerfreundlichen UCSC Genome Browser. Darüber hinaus werden mehrere Werkzeuge und Ressourcen empfohlen, um die Sequenzeigenschaften identifizierter Mikroproteine weiter zu untersuchen und Einblicke in ihre mutmaßlichen Funktionen zu erhalten.

Zusammenfassung

Next-Generation-Sequencing (NGS) hat das Gebiet der Genomik vorangetrieben und ganze Genomsequenzen für zahlreiche Tierarten und Modellorganismen hervorgebracht. Trotz dieser Fülle an Sequenzinformationen haben sich umfassende Genannotationsbemühungen als schwierig erwiesen, insbesondere für kleine Proteine. Insbesondere wurden konventionelle Proteinannotationsmethoden entwickelt, um mutmaßliche Proteine absichtlich auszuschließen, die durch kurze offene Leserahmen (sORFs) mit einer Länge von weniger als 300 Nukleotiden kodiert werden, um die exponentiell höhere Anzahl falscher nichtkodierender sORFs im gesamten Genom herauszufiltern. Infolgedessen wurden Hunderte von funktionellen kleinen Proteinen, die Mikroproteine genannt werden (<100 Aminosäuren lang), fälschlicherweise als nicht-kodierende RNAs klassifiziert oder ganz übersehen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um kostenlose, öffentlich verfügbare bioinformatische Werkzeuge zu nutzen, um genomische Regionen nach Mikroprotein-kodierendem Potenzial auf der Grundlage evolutionärer Konservierung abzufragen. Insbesondere bieten wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Untersuchung der Sequenzerhaltung und des Kodierungspotenzials mit phylogenetischen Codon-Substitutionsfrequenzen (PhyloCSF) im benutzerfreundlichen Genome Browser der University of California Santa Cruz (UCSC). Darüber hinaus beschreiben wir Schritte zur effizienten Generierung mehrerer Speziesausrichtungen identifizierter Mikroproteinsequenzen, um die Erhaltung der Aminosäuresequenz zu visualisieren, und empfehlen Ressourcen zur Analyse von Mikroproteineigenschaften, einschließlich vorhergesagter Domänenstrukturen. Diese leistungsstarken Werkzeuge können verwendet werden, um mutmaßliche Mikroprotein-kodierende Sequenzen in nicht-kanonischen genomischen Regionen zu identifizieren oder das Vorhandensein einer konservierten kodierenden Sequenz mit translationalem Potenzial in einem nicht-kodierenden Transkript von Interesse auszuschließen.

Einleitung

Die Identifizierung des gesamten Satzes kodierender Elemente im Genom ist seit Beginn des Humangenomprojekts ein wichtiges Ziel und bleibt ein zentrales Ziel für das Verständnis biologischer Systeme und die Ätiologie genetisch bedingter Krankheiten 1,2,3,4. Fortschritte in der NGS-Technik haben zur Produktion ganzer Genomsequenzen für eine große Anzahl von Organismen geführt, darunter Wirbeltiere, Wirbellose, Hefen und Pflanzen⁵. Darüber hinaus haben transkriptionelle Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden die Komplexit....