Hier beschreiben wir die Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Protein-basierten Organellenmarkern in der Lebendzellbildgebung der knospenden Hefe (Saccharomyces cerevisiae).
Methodenartikel
Visualisierung von Hefeorganellen mit fluoreszierenden Proteinmarkern
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die knospende Hefe, Saccharomyces cerevisiae, ist ein klassisches Modellsystem zur Erforschung der Funktion und Dynamik von Organellen. In unseren früheren Arbeiten haben wir fluoreszierende proteinbasierte Marker für wichtige Organellen und Endomembranstrukturen konstruiert, darunter den Zellkern, das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat, Endosomen, Vakuolen, Mitochondrien, Peroxisomen, Lipidtröpfchen und Autophagosomen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verfahren zur Verwendung dieser Marker in Hefe, einschließlich der DNA-Vorbereitung für die Hefetransformation, der Auswahl und Bewertung von Transformanten, der fluoreszierenden mikroskopischen Beobachtung und der erwarteten Ergebnisse. Der Text richtet sich an Forscher, die aus anderen Bereichen in das Gebiet der Hefeorganellenforschung einsteigen. Es werden die wichtigsten Schritte sowie technische Hinweise zu Überlegungen zur Mikroskophardware und einige häufige Fallstricke behandelt. Es bietet einen Ausgangspunkt für Menschen, um subzelluläre Einheiten von Hefen durch Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen zu beobachten. Diese Werkzeuge und Methoden können verwendet werden, um die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen zu identifizieren und Organellen von Interesse in der Zeitrafferbildgebung zu verfolgen.
Einleitung
Die subzelluläre Kompartimentierung in membrangebundene Organellen ist ein gängiges Prinzip in der Organisation eukaryotischer Zellen. Jedes Organell erfüllt bestimmte Funktionen. Wie in vielen anderen Bereichen der eukaryotischen Biologie war die knospende Hefe, Saccharomyces cerevisiae, ein klassisches Modellsystem zur Aufklärung der Grundprinzipien der Organellenorganisation und -dynamik. Beispiele hierfür sind die bahnbrechenden Entdeckungen des Proteinsekretionswegs, des peroxisomalen Proteinimportwegs und des Autophagiewegs 1,2,3
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Protokoll
1. Aufbau des Hefestamms
- Besorgen Sie sich Marker-Plasmide und einen geeigneten Hefestamm.
HINWEIS: Die Plasmide sind bei Addgene erhältlich. Dieses Protokoll verwendet TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) und DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) als Beispiele. Ein wichtiger Aspekt bei der Wahl des Stammes, abgesehen von der Art der wissenschaftlichen Frage, ist die Kompatibilität der Selektionsmarker. Die hier beschriebenen Organellenmarker-Plasmide verwenden URA3 und TRP1 als Selektionsmarker. Daher muss der Genotyp d....
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Ergebnisse
Die Morphologie und Dynamik der Organellen kann sich ändern, da Hefezellen auf externe und interne Signale reagieren. Hier zeigen wir repräsentative Bilder von Hefeorganellen in der Mid-log-Phase (Abbildung 3A,B). Wie bereits erwähnt, haben mehrere Organellen ihre unterschiedlichen morphologischen Merkmale und sind daher ohne umfangreichen Vergleich mit anderen Organellenmarkern leicht zu erkennen. Dazu gehören ER, Mitochondrien und Vakuolen. Beachten Sie, dass in einigen La.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet einen einfachen Einstieg für Personen, die aus anderen Forschungsbereichen einsteigen, um die Bildgebung von Hefeorganellen zu erforschen. Bevor wir zu spezifischen Themen übergehen, möchten wir noch einmal betonen, dass man auf den übermäßigen Gebrauch von automatischen Funktionen in Imaging-Software verzichten muss. Mikroskopiebilder sind nicht nur hübsche Bilder, sie sind wissenschaftliche Daten, und daher sollte ihre Erfassung und Interpretation.......
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Danksagungen
Die Autoren danken den Mitgliedern des Xie-Labors für ihre großzügige Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss 91957104), der Shanghai Municipal Education Commission (Zuschuss 2017-01-07-00-02-E00035) und der Shanghai Municipal Science and Technology Commission (Zuschuss 22ZR1433800).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
| Casaminosäure | Sangon Biotech | A603060 | |
| Concanavalin A aus canavalia ensiformis (Jack Bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
| D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
| Fidschi | https://fiji.sc/ | ||
| Petrischale | mit GlasbodenNEST | 706001 | Φ 35 mm |
| ImajeJ | https://imagej.net/ | ||
| Inverses Fluoreszenzmikroskop | Olympus | IX83, ausgestattet mit UPLXAPO 100X Ölimmersionsobjektiv, Lumencor Spectra X Lichtquelle und Hamamatsu Orca Flash4.0 LT Kamera. | |
| L-Histidin | Sangon Biotech | A604351 | |
| L-Leucin | Sangon Biotech | A100811 | |
| L-Lysin | Sangon Biotech | A602759 | |
| L-Methionin | Sangon Biotech | A100801 | |
| L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
| Mikroskop Deckglas | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0,16 x 0,19 mm |
| Objektträger | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1– 1,2 mm |
| Pepton | Sangon Biotech | A505247 | |
| Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
| Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
| Hefeextrakt | Sangon Biotech | A100850 | |
| Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren | Sangon Biotech | A610507 | |
| YNB ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat | Sangon Biotech | A600505 |
Referenzen
- Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
- Spang, A.
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