Verbesserte Reproduzierbarkeit und Präzision der Hochdurchsatz-Quantifizierung von Daten zum Bakterienwachstum mit einem Mikroplatten-Reader

Summary

Hier wird ein Hochdurchsatzprotokoll vorgestellt, um Wachstumsdaten zu messen, einschließlich Wachstumskurven, Wachstumsrate und maximaler Wachstumsrate. Das Protokoll wurde anhand von zwei Biofilm-produzierenden Bakterien verifiziert und validiert. Die Ergebnisse und der in dieser Studie angewandte Ansatz können auf andere Hochdurchsatzprotokolle mit Mikroplatten-Readern ausgeweitet werden.

Abstract

Ziel dieser Studie war es, ein wiederholbares, zuverlässiges Hochdurchsatzprotokoll zu entwickeln, um das Bakterienwachstum in 96-Well-Platten zu überwachen und die maximale Wachstumsrate zu analysieren. Es wurden die Wachstumskurven und maximalen Wachstumsraten von zwei Bakterienarten bestimmt. Untersucht wurden u.a. (i) Deckelkondensation, (ii) Weglängenkorrektur, (iii) Inokulationsgröße, (iv) Abtastzeitintervall und (v) räumliche Verzerrung. Die Wiederholbarkeit des Protokolls wurde mit drei unabhängigen technischen Replikationen bewertet, mit einer Standardabweichung von 0,03 zwischen den Durchläufen. Die maximalen Wachstumsraten von Bacillus mycoides und Paenibacillus tundrae betrugen (mittlere ± SD) 0,99 ^h-1 ± 0,03 ^h-1 bzw. 0,85 ^h-1 ± 0,025 ^h-1. Diese Bakterien sind aufgrund ihrer Affinität, miteinander zu verklumpen, optisch schwieriger zu überwachen. Diese Studie zeigt, wie wichtig die Inokulationsgröße, die Weglängenkorrektur, die Deckelerwärmung, die Probenahmezeitintervalle und die räumliche Verzerrung der Well-Platte sind, um zuverlässige, genaue und reproduzierbare Daten auf Mikroplatten-Readern zu erhalten. Das entwickelte Protokoll und seine Verifizierungsschritte können mit Mikroplatten-Readern und Hochdurchsatzprotokollen auf andere Methoden erweitert werden, wodurch die inhärenten Fehler und Materialkosten der Forscher reduziert werden.

Introduction

Das wachsende Interesse an der Multi-Omics-Manipulation, einschließlich Mechanismus- und Stoffwechselstudien von Bakterien, unterstreicht die Bedeutung von Hochdurchsatz- und automatisierten Methoden wie der Aufzeichnung von Wachstumsdaten ^1,2. Wachstumsdaten, die kinetische Parameter wie maximale Wachstumsraten umfassen, können helfen, bakterielle Reaktionen auf verschiedene physikalische, chemische und antibakterielle Bedingungen zu charakterisieren. Daten zur Wachstumsrate sind eine Standard-Antwortvariable, die verwendet wird, um potenzielle Genotyp-P....

Protocol

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll müssen unter sterilen Bedingungen (d. h. zwischen zwei Flammen oder einer Biosicherheitswerkbank) durchgeführt werden. Alle Materialien und Werkzeuge werden für 20 min autoklaviert. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Behandschuhte Hände werden desinfiziert, mindestens 1 Minute lang mit Händedesinfektionsmittel oder 70%iger Alkohollösung feucht gehalten und danach nicht aus dem Sicherheitsschrank genommen. Andernfalls muss der Desinfektionsvorgang wiederholt werden, bevor die Hände wieder in den Sicherheitsschrank eing....

Results

Validierung des OD-Messwerts und Faktor für die Weglängenkorrektur
Geteilte Proben der B . mycoides-Kultur wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und mit dem Mikroplatten-Reader und dem Spektralphotometer gemessen (Abbildung 1A). Dieser Schritt wurde unternommen, um die Ergebnisse auf verschiedenen Geräten zu validieren. Die Daten von OD₆₀₀ korrelierten, stimmten aber nicht überein (Abbildung 1B). Die Korrelatio.......

Discussion

Mikroplatten-Reader ermöglichen es, konsistente und wiederholbare Wachstumsraten zu erzielen. Diese Technologie minimiert menschliche Fehler und ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz. Die geringe Menge an Kultur, die pro Probe benötigt wird, macht diesen Ansatz zu einer attraktiven und kostengünstigen Alternative zur Zellzählung mit Kolben oder Reagenzgläsern. Mikroplatten-Reader ermöglichen eine große Stichprobengröße, erhöhen die statistische Aussagekraft und erleichtern ansch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zentrifuge	Eppendorf	5810 R
Zentrifugenröhrchen - 15 mL	ThermoFisher - Wissenschaftlich	339650	Sterile
Zentrifugenröhrchen - 50 mL	ThermoFisher - Wissenschaftlich	339652	Sterile
Einweg-Impfschlaufe, 10 & Mikro; L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Sterile
Erlenmeyerkolben - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Glas
Isopropanol	ThermoFisher - Wissenschaftlich	396982500	99.0
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P4417
Pipettenspitzen 1.000 & Mikro; L	ThermoFisher - Wissenschaftlich	UZ-25001-76
Pipettenspitzen 10 mL	ThermoFisher - Wissenschaftlich	UZ-25001-83
Pipettenspitzen 200 & Mikro; L	ThermoFisher - Wissenschaftlich	UZ-25001-85
Pipettenspitzen 5 mL	ThermoFisher - Wissenschaftlich	UZ-25001-80
Pipette 1.000 & Mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipettierer 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipette 200 & Mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipette 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Tryptische Sojabrühe	Millipore	22091	Geeignet für die Mikrobiologie