Method Article

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

DOI:

10.3791/63856

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July 20th, 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

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Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Abstract

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Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten - im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

Introduction

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Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt - und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie mole....

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Protocol

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1. Beladung des Probenhalters für Flüssig-EM

  1. Reinigen Sie die Siliziumnitrid (SiN)-Mikrochips, indem Sie jeden Chip in 150 ml Aceton für 2 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 ml Methanol für 2 min. Lassen Sie die Späne im laminaren Luftstrom trocknen.
  2. Plasmareinigung der getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas betrieben wird.
  3. Legen Sie einen Mikrochip mit trockener Basis in die Spitze des Probenhalters. Fügen Sie ~0,2 μL Probe (0,2-1 mg/ml Virusanordnungen in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM C....

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Results

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Ein Liquid-TEM mit 200 kV wurde für alle Liquid-EM-Bildgebungsexperimente und ein Kryo-TEM mit 300 kV für die gesamte Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Repräsentative Bilder und Strukturen mehrerer Viren werden präsentiert, um den Nutzen der Methoden bei verschiedenen Testpersonen zu demonstrieren. Dazu gehören rekombinante adeno-assoziierte Virus-Subtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2-subvirale Anordnungen, die aus dem Patientenserum abgeleitet sind, und Affenrotavirus-Doppelschichtpartikel (DLPs), SA11-Stamm. Zunächst werden Vergl.......

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Discussion

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Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoebene zu .......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Die Autorin, Madeline J. Dressel-Dukes, ist eine Angestellte von Protochips, Inc. und Michael Spilman ist ein Mitarbeiter von DirectElectron.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Abteilung für Augenheilkunde) für die Bereitstellung von gereinigtem AAV-3. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health und dem National Cancer Institute unterstützt (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 an D.F.K.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonFisher Scientific  A11-11 Liter
Autoloader-Clip-WerkzeugThermoFisher ScientificN/AAuch SubAngstrom-Lieferant
Autoloader-GitterclipsThermoFisher ScientificN/Aobere und untere Clips
Kohlenstoffbeschichtete Gold-EM-GitterElektronenmikroskopie SciencesCF400-AU-50400-Mesh, 5 nm Dicke
COVID-19-PatientenserumRayBiotechCoV-Pos-S-500500 Mikroliter PCR+ Serum
MethanolFisher Scientific  A412-11 Liter
MikrotiterintegradMikrochips Protochips, Inc.EPB-42A1-1010 x 10 mm Fenster-Arrays
TEMWindows MikrochipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 große Fenster, 10 nn dick
TEMWindows MikrochipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 kleine Fenster, 5 nm dick
Top MikrochipsProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm Fenster
Whatman #1 FilterpapierWhatman1001 090100 Stück, 90 mm
Ausstattung 
DirectView DirektelektronendetektorDirekter Elektronendetektor6 Mikrometern Pixelabstand
Falcon 3 EC DirektelektronendetektorThermoFisher Scientific14 Mikrometern Pixelabstand
Gatan 655 Trockene PumpstationGatan, Inc.  Pumpenhalterspitze auf 10-6 Bereich
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientifichochmoderne Probenvorbereitungseinheit 
PELCO easiGlow, GlimmentladungseinheitTed Pella, Inc.  Modus mit negativer Polarität
Poseidon Select ProbenhalterProtochips, Inc.  FEI-kompatibel; Probenhalter
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Flüssig-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Frei verfügbare SoftwareWebsite-Link<>Kommentare (optional)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/weitere Bildverarbeitungssoftware
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF-Suchprogramm
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/Softwarepaket für die Molekularstrukturanalyse
mit mit https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

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  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

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