Summary
Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae'lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae'nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
İç saç hücrelerini ve afferent işitme siniri liflerini birbirine bağlayan şerit sinapsların kaybı, yaşa bağlı işitme kaybının bir nedeni olarak kabul edilir. Şerit sinapslarının kaybını tespit etmek için en yaygın yöntem immünoetiketlemedir, çünkü bireysel bir kokleadaki çeşitli tonotopik konumlardan kantitatif örneklemeye izin verir. Bununla birlikte, ilgilenilen yapılar kemikli kokleanın derinliklerine gömülüdür. Gerbiller, yaşa bağlı işitme kaybı için bir hayvan modeli olarak kullanılır. Burada, fiksasyon, gerbil koklear bütün montajların immüno-etiketlenmesi, konfokal görüntüleme ve şerit sinaps sayılarının ve hacimlerinin ölçülmesi için rutin protokoller açıklanmaktadır. Ayrıca, değerli yaşlanan bireylerden iyi malzeme elde etmekle ilgili özel zorluklar vurgulanmaktadır.
Gerbiller ötenazi yapılır ve ya kardiyovasküler olarak perfüze edilir ya da timpanik bülleri kafatasından dikkatlice diseke edilir. Koklealar tepe ve tabanda açılır ve doğrudan fiksatif bölgeye aktarılır. İlk yöntemden bağımsız olarak, koklealar sonradan sabitlenir ve daha sonra kireçten arındırılır. Doku daha sonra sinaptik öncesi ve sonrası yapılara ve saç hücrelerine karşı birincil antikorlarla etiketlenir. Daha sonra, kokleae, kendi birincil antikorlarına karşı spesifik olan ikincil floresan etiketli antikorlarla inkübe edilir. Yaşlı gerbillerin kokleaları daha sonra yaşlı hayvanların dokularının tipik olarak önemli arka plan floresansını azaltmak için bir otofloresan söndürücü ile muamele edilir.
Son olarak, koklealar 6-11 segmente ayrılır. Tüm koklear uzunluk, belirli koklear konumların bireyler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebileceği şekilde yeniden yapılandırılır. Sırayla elde edilen konfokal görüntü yığınları, seçilen konumlardaki saç hücrelerini ve sinapsları görselleştirmeye yardımcı olur. Konfokal yığınlar deconvolved edilir ve sinapslar ya ImageJ kullanılarak manuel olarak sayılır ya da Matlab'da özel olarak yazılmış görüntü analizi prosedürleri ile sinaptik yapıların daha kapsamlı bir şekilde ölçülmesi gerçekleştirilir.
Introduction
Yaşa bağlı işitme kaybı, 65 yaş ve üstü dünya nüfusunun üçte birinden fazlasını etkileyen, dünyanın en yaygın hastalıklarından biridir1. Altta yatan nedenler hala tartışılmakta ve aktif olarak araştırılmaktadır, ancak iç saç hücrelerini (IHC'ler) afferent işitme siniri lifleri ile bağlayan özel sinapsların kaybını içerebilir2. Bu şerit sinapslar, kendisine bağlı nörotransmitter glutamat ile dolu veziküllerin yanı sıra postsinaptik α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) glutamat reseptörleri 3,4,5 olan presinaptik bir yapıyı içerir. Gerbilde, ~ 20 afferent işitme siniri lifi bir IHC 6,7,8 ile temas eder. IHC'deki modiolusa bakan lifler büyük sinaptik şeritlere karşıyken, IHC'nin sütun tarafına bağlanan lifler küçük sinaptik şeritlerle karşı karşıya kalır (yani, kedilerde9, gerbiller7, gine domuzları 10 ve farelerde 3,11,12,13,14). Ayrıca gerbilde presinaptik şeritlerin ve postsinaptik glutamat yamalarının büyüklüğü pozitif korelasyongösterir 7,14. IHC'nin modiolar tarafındaki büyük şeritlere karşı çıkan lifler kalibre olarak küçüktür ve düşük spontan oranlara ve yüksek eşiklere sahiptir15. Düşük spontan oranlı liflerin, gürültüye maruz kalma 10 ve ototoksik ilaçlara karşı16, IHC15'in sütun tarafında bulunan yüksek spontan düşük eşikli liflerden daha savunmasız olduğuna dair kanıtlar vardır.
Şerit sinapslarının kaybı, koklear nöral yaşa bağlı işitme kaybında en erken dejeneratif olaydır, spiral ganglion hücrelerinin ve bunların afferent işitme siniri liflerinin kaybı 17,18'in gerisinde kalmaktadır. Elektrofizyolojik korelasyonlar, işitsel beyin sapı yanıtlarınınkayıtlarını içerir 17 ve bileşik aksiyon potansiyelleri8; Bununla birlikte, bunlar sinaps kaybının inceliklerini yansıtmaz, çünkü düşük spontan oranlı lifler bu önlemlere katkıda bulunmaz16. Daha umut verici elektrofizyolojik metrikler, kütle potansiyelinden türetilmiş nöral indeks19 ve peristimulus zaman yanıtı20'dir. Bununla birlikte, bunlar yalnızca hayvanın işitme siniri lifi kaybının ötesinde, kalan işitme siniri liflerinin aktivitesini etkileyen başka koklear patolojileri yoksa güvenilirdir8. Ayrıca, gerbildeki davranışsal olarak değerlendirilen eşikler sinaps sayıları21 ile ilişkili değildi. Bu nedenle, hayatta kalan şerit sinapslarının ve dolayısıyla fonksiyonel işitme siniri liflerinin sayısının güvenilir bir şekilde ölçülmesi ancak koklear dokunun doğrudan incelenmesiyle mümkündür.
Moğol gerbili (Meriones unguiculatus), yaşa bağlı işitme kaybını incelemek için uygun bir hayvan modelidir. Kısa bir ömre sahiptir, insanlara benzer düşük frekanslı işitmeye sahiptir, bakımı kolaydır ve yaşa bağlı işitme kaybıile ilgili insan patolojileriyle benzerlikler gösterir 2,22,23,24. Gerbiller, ortalama yaşam süreleri22'nin sonuna yakın olan 36 aylıkken yaşlı olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, yaşa bağlı bir şerit sinaps kaybı, sessiz ortamlarda yetiştirilen ve yaşlanan gerbillerde gösterilmiştir 8,21.
Burada, genç yetişkinlerden yaşlılara kadar farklı yaşlardaki gerbillerden kokleaları immünoetiketlemek, diseke etmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır. Presinapsın (CtBP2), postsinaptik glutamat reseptör yamalarının (GluA2) ve IHC'lerin (myoVIIa) bileşenlerine yönelik antikorlar kullanılır. Yaşlı koklealarda arka planı azaltan ve floresan sinyalini sağlam bırakan bir otofloresan söndürücü uygulanır. Ayrıca, hem duyusal epiteli hem de stria vascularis'i incelemek için kokleanın nasıl diseke edileceğine dair bir açıklama verilmiştir. Koklear uzunluk, belirli en iyi frekanslara karşılık gelen farklı koklear konumların seçilmesini sağlamak için ölçülür25. Sinaps sayılarının nicelleştirilmesi, serbestçe kullanılabilen ImageJ26 yazılımı ile gerçekleştirilir. Bireysel HC içindeki sinaps hacimlerinin ve konumlarının ek nicelleştirilmesi, Matlab'da özel olarak yazılmış yazılımla gerçekleştirilir. Bu yazılım, yazarlar profesyonel dokümantasyon ve destek sağlayacak kaynaklardan yoksun oldukları için kamuya açık hale getirilmemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm protokoller ve prosedürler, AZ 33.19-42502-04-15/1828 ve 33.19-42502-04-15/1990 izin numaralarıyla Almanya'nın Aşağı Saksonya eyaletinin ilgili makamları tarafından onaylanmıştır. Bu protokol her iki cinsiyetten Moğol gerbilleri (M. unguiculatus) içindir. Genç yetişkin 3-12 aylık yaşı ifade ederken, gerbiller 36 ay ve üstü olarak kabul edilir. Aksi belirtilmediğinde, tamponlar ve çözeltiler hazırlanabilir ve buzdolabında birkaç aya kadar (4-8 ° C) saklanabilir. Kullanmadan önce, tamponların ve çözeltilerin çökelmediğinden emin olun.
1. Fiksasyon ve organ toplama
NOT: Sadece kokleae'ye ihtiyaç duyulursa, daldırma yoluyla biraz daha basit bir sabitleme prosedürünün uygulanması önerilir. Bununla birlikte, iyi korunmuş bir beyne de ihtiyaç duyulursa, transkardiyal perfüzyon tek seçenektir. Her iki durumda da fiksatif fosfat tamponlu salinde (PBS) %4 paraformaldehittir (PFA). Bu taze yapılmalıdır, ancak kullanıma kadar dondurulmuş olarak saklanabilir. Transkardiyal perfüzyon için ~300 mL veya daldırma yoluyla fiksasyon için koklea başına ~50-100 mL alikotlar kullanın.
DİKKAT: PFA tehlikeli bir maddedir; genel laboratuvar güvenlik prosedürlerine göre ele alın.
- Transkardiyal perfüzyon ile fiksasyon
- Perfüzyon ayarını, boru herhangi bir hava kabarcığından temizlenene kadar yıkayın. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için perfüzyon tüpünü heparin içeren PBS (100 mL PBS'de 0.2 mL) ile doldurun. Boru PBS ile doldurulduktan ve sıvı saklama şişesi yeni boşaldıktan sonra akışı durdurun; içine 200 mL çözülmüş PFA dökün.
NOT: Kurulum artık hayvan için hazırdır. Borudaki kalan PBS, kanı temizlemek için yeterlidir ve akış devam ettirildiğinde otomatik olarak fiksatif tarafından takip edilecektir. - PFA'nın çıkışı için bir atık toplama sisteminin mevcut olduğundan emin olun. Taze bir kanül (19 G) kullanın ve büyük makas, forseps (düzleştirilmiş uçlu), hemostatlar, neşter veya keskin kanül ve pimleri kullanışlı bir lastik paspas kullanın.
- Gerbili intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın (160 mg / mL, hayvan başına 0.3 mL, vücut ağırlığı aralığı: 50-120 g). Hayvanı tekrar kafesine koyun. Solunum durması, solunumun 30 s veya daha uzun aralıklarla düzensiz hale gelmesine neden olduğunda, gerbili sırt üstü kauçuk paspasın üzerine yerleştirin ve hem ön pençeleri hem de bir arka pençeyi pimlerle sabitleyin (perfüzyon başarısının daha iyi değerlendirilmesi için bir arka pençeyi hareket ettirmek için serbest bırakın; adım 1.1.7'den sonraki nota bakın).
- Göğüs boşluğunu açmak için, cildi forseps ile sternumun üzerine kaldırın ve beyaz renkli processus xiphoideus görünene kadar cildi sternumun yaklaşık 0,5 cm altında makasla kesin. Sternumu processus xiphoideus'ta forseps ile tutun ve göğüs boşluğuna iyi bir görünüm elde etmek için diyafram boyunca kesin. Kalbe iyi erişim olana kadar kaburgaları her iki tarafta yanal olarak kesin. Organlara zarar vermemek için makas açısının gerbilin gövdesine göre paralel ve düz olduğundan emin olun ve böylece kapalı bir dolaşım sistemi sağlayın.
- Bir hemostatı sternuma kelepçeleyin, göğüs kafesini kaldırın ve kan akışını engellememek için hemostatı herhangi bir vücut parçasına koymadan hemostatı gerbilin omzuna yerleştirin.
- Yaklaşık her 2 saniyede bir PBS damlası kanülden (19 G) akana kadar sıvı akışını hafifçe açın. Kalbi forseps ile tutun ve sol ventrikülün açıkça görülebilmesi için biraz sola çevirin. Kanülü sol ventriküle, septuma nüfuz etmekten kaçınacak bir açıyla yerleştirin. İğneyi elle veya başka bir hemostatla yerinde tutun.
NOT: Sol ve sağ ventriküller farklı renk tonlarıyla ayırt edilebilir; sol ventrikül, kalp dokusunun geri kalanından daha açık renkli görünür. - Sıvı akışının basıncını yavaşça artırın ve sağ atriyumu ince makas, neşter veya başka bir kanülle açın. Damlama odasında yaklaşık 2-3 damla/sn gözlenene kadar sıvı akışını daha fazla açın veya pompa için 4 mL/dak'lık bir akış ayarlayın. Kalbin sabitlenmesi başladıktan sonra, perfüzyon kanülünün daha fazla tutulmadan yerinde kalmasını sağlayın.
NOT: Başarılı perfüzyon belirtileri yavaş kas kasılmaları, boyun ve ekstremitelerin sertleşmesi, karaciğerin soluklaşması ve pembe akciğerlerdir. Başarısız perfüzyonun belirtisi, akciğerlerin beyazlamasıdır, bu da pulmoner dolaşımın septumun delinmesi nedeniyle perfüze edildiğini gösterir. - Başarısız perfüzyon durumunda, kanülü daha yukarıya, aortun içine doğru hareket ettirmeye çalışın ve bir hemostat ile yerine kelepçeleyin.
- Gerbilin başını kes. Bullaları çıkarın ve adım 1.2.2'de açıklandığı gibi kemiğini kesin ve kırın.
NOT: Doku yeterince sabitlenmemişse, duyusal epitel diseksiyon sırasında Corti organından çıkacaktır. - Perfüzyon 5-10 dakika içinde fiksasyon belirtisi göstermiyorsa, iptal edin ve daldırma yoluyla fiksasyon için hemen aşağıdaki prosedürü izleyin. Bunun için, kokleayı adım 1.2.2'deki gibi tedavi edin ve dokuyu vidalı kapaklı kaplarda yaklaşık 50-80 mL% 4 PFA'ya 8 ° C'de bir 2D çalkalayıcı üzerinde 1-2 gün boyunca sabitleyin.
NOT: Perfüzyon sırasında fiksasyon kalitesini nihai olarak derecelendirmek zor olabileceğinden, kokleaların tarif edildiği gibi rutin olarak postfiksasyonu önerilir.
- Perfüzyon ayarını, boru herhangi bir hava kabarcığından temizlenene kadar yıkayın. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için perfüzyon tüpünü heparin içeren PBS (100 mL PBS'de 0.2 mL) ile doldurun. Boru PBS ile doldurulduktan ve sıvı saklama şişesi yeni boşaldıktan sonra akışı durdurun; içine 200 mL çözülmüş PFA dökün.
- Doku daldırma ile fiksasyon
- Gerbilleri intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital (160 mg / mL, hayvan başına 0.3 mL, vücut ağırlığı aralığı: 50-120 g) ile ötenazileştirin. Gerbil nefes almayı bıraktığında, hayvanın kafasını kesin.
- Bullaları çıkarın ve kokleae'ye ulaşmak için sırasıyla makas ve forseps ile kemiğini kesin ve kırın. Maellus, incus ve yarım daire şeklindeki kanalları çıkarın. Koklear kemiğin üzerini forseps ile dikkatlice çizerek tepede ve bazal dönüşte küçük delikler açın. Bullaları derhal aşırı miktarda soğuk fiksatif (en az 50 mL) içine aktarın ve dokuyu 2 gün boyunca nazik ajitasyon (2D-shaker [100 rpm]) altında soğukta (4-8 ° C) sabitleyin.
NOT: Doku sabitlendikten sonra, kokleae hemen işlenebilir veya PBS'de %0,05 sodyum azid ile saklanabilir. DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Depolama uzunluğunun lekelenme kalitesini olumsuz yönde etkileyebileceğini unutmayın. Sınırlı çalışmalar, immün boyamanın dokuyu sodyum azid içinde 2 yıl sakladıktan sonra daha zayıf göründüğünü ileri sürmüştür.
2. Doku hazırlama ve immünoetiketleme
- pH 8'de 0,5 M'lik bir çözelti üretmek için PBS'de etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tozunu çözün. Bunun için, manyetik bir karıştırıcı üzerine bir beher yerleştirin, toplam PBS miktarının yaklaşık yarısı ile doldurun ve uygun miktarda EDTA tozu ekleyin, bu da asidik bir süspansiyonla sonuçlanır. pH değerini bir pH metre ile izlerken konsantre sodyum hidroksit çözeltisini (NaOH) dikkatlice ekleyin. PBS ile istenen son hacme kadar doldurun ve mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için çözeltiyi filtreleyin.
NOT: EDTA tozu, yalnızca süspansiyon nötr pH değerine ulaştığında tamamen çözülecektir. - Dekalsifikasyon için, kokleae'yi PBS'de 80 mL'lik 0,5 M EDTA'ya aktarın. Dokuyu soğukta (4-8 ° C) 2D çalkalayıcıda (100 rpm) 2 gün boyunca nazik ajitasyon altında inkübe edin.
NOT: Kireç çözme adımından sonra, doku kalan işlem adımlarına devam etmeden önce PBS'de 3 haftaya kadar birkaç gün saklanabilir. Stria vascularis'i etiketleyen antikorlar için, antikorların kendi hedeflerine düzgün erişimini sağlamak için kokleaların bu noktada (yani immünoboyamadan önce) modiolar eksen boyunca ikiye bölünmesi önerilir. Bu antikora bağımlıdır ve burada sinaptik yapıları ve IHC'leri etiketlemek için kullanılan antikorlar için geçerli değildir. Kesim için bir parça kırılabilir tıraş bıçağı ve bir bıçak tutucu (adım 4.2'de açıklandığı gibi) kullanın. - 2 mL emniyetli sızdırmazlık reaksiyon tüplerinde aşağıdaki adımları (adım 3.2'ye kadar) uygulayın. Doku parçası tüpün içine sığmayacak kadar büyükse, fazla dokuyu makasla kesin. Antikorların penetrasyonunu arttırmak için, önce dokuyu 1 saat boyunca oda sıcaklığında 2D çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde PBS'de% 1 tritonluk (Triton X-100) 1 mL'lik bir permeabilite edin. Doku 3x'i PBS'de PBS'de 1 mL% 0,2 triton (Triton X-100) ile oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkayın.
- Spesifik olmayan antijenleri bloke etmek için, kokleae'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2D çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde 1 mL bloke edici çözelti (% 3 sığır serum albümini [BSA], % 0.2 triton, PBS'de) inkübe edin.
NOT: Blokaj çözeltisi önceden hazırlanabilir, ancak ~ 10 günden daha eski olmamalıdır. - Aşağıdaki birincil antikorları, bloke edici çözeltinin aynı alikotunda taze olarak seyreltin: IHC'leri (IgG poliklonal tavşan) etiketlemek için anti-myoVIIa (miyozin VIIa), seyreltilmiş 1:400; presinaptik şeritleri (IgG1 monoklonal fare) etiketlemek için anti-CtBP2 (C-terminal bağlayıcı protein 2), seyreltilmiş 1:400; ve postsinaptik reseptör yamalarını (IgG2a monoklonal fare) etiketlemek için anti-GluA2, seyreltilmiş 1:200. Kokleaların antikor çözeltisi (tipik olarak 0,4 mL) ile tamamen kaplandığından emin olun ve 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Daha sonra, 5x mendili PBS'de% 0,2 triton ile oda sıcaklığında 2D çalkalayıcıda (100 rpm) her biri 5 dakika yıkayın. Birincil meslektaşlarının konakçı türlerine uyacak ikincil antikorları seçin ve PBS'de% 3 BSA,% 0.2 tritonda taze olarak seyreltin: keçi anti-fare (IgG1)-Alexa florofor (AF) 488, seyreltilmiş 1: 1.000; keçi anti-fare (IgG2a)-AF568, seyreltilmiş 1:500; ve eşek anti-tavşan-AF647 (IgG), seyreltilmiş 1:1.000. Floresanın ağartılmasını önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın. Kokleaları 24 saat boyunca 37 °C'de 0,4 mL ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin.
NOT: Sınırlı sayıda çalışma, koklear dokunun 37 °C'de 24 saat boyunca primer ve sekonder antikorlarla inkübasyonunun, daha düşük sıcaklıklara ve daha kısa sürelere sahip daha yaygın inkübasyon prosedürünü izlemekten daha parlak immün boyama ile sonuçlandığını göstermiştir. - Kokleayı 2x'i PBS'de 1 mL'lik %0,2 tritonla oda sıcaklığında 5 dakika ve PBS ile 3x'i 5 dakika boyunca 2D çalkalayıcıda (100 rpm) yıkayın.
NOT: Bu yıkama adımlarından sonra, koklealar buzdolabında ~4 °C'de birkaç gün boyunca PBS'de kalabilir.
3. Otofloresan söndürücü ile tedavi (isteğe bağlı)
NOT: Orta yaşlı ve yaşlı gerbillerden elde edilen kokleae, geniş arka plan otofloresansı gösterir. Genç yetişkin dokuda, otofloresan söndürücü ile tedavi gerekli değildir. Prensip olarak, otofloresan söndürücüyü immün boyama prosedüründen önce uygulamak mümkündür, bu da istenen antikor floresansının yanlışlıkla azaltılmasını önler. Bununla birlikte, üreticinin veri sayfasına göre, deterjanların (mevcut protokoldeki Triton X-100 gibi) kullanımı, söndürücüyü dokudan çıkardıkları için artık mümkün değildir.
- Kokleae'yi, adım 4.2'de açıklandığı gibi bir stereomikroskop altında ikiye bölün.
- %5'lik bir çözelti elde etmek için otofloresan söndürücüyü %70 etanol ile karıştırın ve kokleaları bu çözelti içinde oda sıcaklığında 2D çalkalayıcı üzerinde 1 dakika boyunca inkübe edin. Kokleayı 3x, oda sıcaklığında 2D çalkalayıcıda 1 mL PBS ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
DİKKAT: Otofloresan söndürücü tehlikeli ve zararlıdır. Bu maddeyi kullanırken eldiven giyin.
4. Son ince diseksiyon
- Kokleayı stereomikroskop altında inceleyin. Bir polistirrol Petri kabını ve kapağını PBS ile doldurun ve iki ince forseps, Vannas yaylı makas, bir bıçak tutucu ve kırılabilir bir tıraş bıçağını elinizin altında bulundurun. Diseksiyon adımına bağlı olarak ~ 2-4 mm'lik bir kesme yüzeyi elde etmek için tıraş bıçağından parçaları kırın. Üst üste üç damla montaj ortamı yerleştirerek bir mikroskop slaytı hazırlayın.
NOT: Jilet bıçağının kesme yüzeyi hızla yıpranır. Bıçak, kokleanın yaklaşık her ikinci parçası diseke edildikten ve monte edildikten sonra değiştirilmelidir. - Adım 3.1'de henüz yapılmadıysa, önce kokleayı bir stereomikroskop altında modiolus boyunca ikiye bölün. Bunun için, kokleanın sarmal uzunluğundan daha uzun bir tıraş bıçağı parçasını bir bıçak tutucuya yerleştirin. Kokleayı Petri kabına yerleştirin ve fazla dokuyu tıraş bıçağı parçasıyla kesin. Kokleayı ince forseps ile yerinde tutun ve modiolus boyunca ikiye bölün.
- Bir yarısı ile başlayın, ancak diğer yarısını da Petri kabında bırakın. Koklear yarısını, kesici kenar yukarı bakacak şekilde forseps ile dikkatlice sabitleyin. Kokleanın kemiğini helikotremanın üzerinde kesmek ve tepeyi kaplayan ince yaylı makas kullanın.
- Koklear parçaların ayrılmasına başlamak için, orta dönüşü modiolus ve işitme siniri boyunca, yukarıda (scala vestibuli) ve aşağıda (scala timpani) makasla keserek izole edin.
- Koklear kanal içindeki stria vascularis'i kaplayan koklear kemiği kesin. Koklear kemiğin her iki tarafında Corti organının üzerinde ve stria vascularis boyunca iki kesik yapın ve sonunda koklear parçaları ayırmak için jilet bıçağını kullanın.
NOT: Stria vascularis koyu bir şerit olarak kolayca görülebilir. Stria vascularis boyunca kesmek, Corti'nin organını sağlam bırakır. - İsteğe bağlı: Stria vascularis'i toplamak için, ikisini ayırmak için Corti organı ile stria vascularis arasında dikkatlice kesin. Stria vascularis'i spiral ligamente bağlı bırakın (kokleanın dış yüzeyini kaplayan kemiğe tutturulmuş) ve forseps kullanarak kireçsizleştirilmiş kemiği çıkarın. Parçayı stria tarafı yukarı bakacak şekilde mikroskop sürgüsüne bir damla montaj ortamına yerleştirin.
NOT: Toplanan parça çok güçlü bir şekilde kavisliyse, kızağa monte edilebilecek kadar düz olması için daha küçük parçalara bölünmesi gerekebilir. - Koklear parçaları polistirrol Petri kabının PBS dolgulu kapağına aktararak koklear tüm montajların kızak üzerinde mümkün olduğunca düz durmasını sağlar. Aternal taraftaki spiral ligamentin parçaları ve nöral taraftaki spiral limbusun parçaları gibi fazla dokuyu çıkarın. Tektoryal zarı süper ince forsepslerle dikkatlice çıkarın.
- Koklear parçaları kızağın üzerine bir damla montaj ortamına yerleştirin. Koklear tüm montaj aparatlarını, görüntüleme için optik yoldaki IHC'lerin gizlenmesini önlemek için Corti'nin organı yukarı bakacak şekilde slaytın üzerine yerleştirin. Spiral limbusun IHC'lere yakın bir yerde invaginasyonunu arayın; bu, koklear parçanın yukarı bakacak tarafı tanımlamak için sagital düzleme kaydırılmasıyla görülebilir.
NOT: Daha sonraki işlemler sırasında kokleanın tamamını ayrı parçalarından dijital olarak yeniden yapılandırmak için, parçaların eskizlerinin belgelenmesi ve yer işaretlerinin not edilmesi önemle tavsiye edilir. Ayrıca, parçalar ideal olarak slayt üzerinde doğru sırada düzenlenmelidir. - Tüm koklea mikroskop slaydına aktarılana kadar 4.3 ile 4.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Gerekirse, daha fazla montaj ortamı ekleyin, slaytı örtün ve kapak kaymasını kenarların etrafına boyanmış siyah oje ile yerine kapatın. Oda sıcaklığında karanlıkta kurumasını bekleyin ve ardından slaytı karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
NOT: Duyusal epitelin parçaları yanlışlıkla kaybolsa bile, doğru uzunluk tahmini için koklear parçadan geriye kalanları monte etmek önemlidir.
5. Koklear uzunluk ölçümü
- Kokleanın uzunluğunu, bir epi-floresan mikroskop sistemi ve ilgili yazılımı kullanarak parçalarının parlak alan görüntülerinden ölçün. Her koklear parçadan düşük büyütmeli görüntüleri (4x lens) kaydedin ve görüntülerin her birinde IHC sırası boyunca bir çizgi çizmek için mikroskop yazılımının kement ölçüm aracını kullanın. Tüm parçaların uzunluklarını ekleyerek toplam uzunluğu hesaplayın.
NOT: Bir koklear parça içinde duyusal epitelin parçaları eksik olduğunda, çizgiyi interpolasyon yapın. - Tek bir kokleada analiz edilmesi gereken koklear konumları tanımlamak için, Müller25 tarafından verilen denklemi kullanarak tepeden karşılık gelen mesafelerini hesaplayın. Bu konumları, örneğin, koklear parçalarının çıktısında işaretleyin.
6. Konfokal mikroskopla görüntü toplama
- Yağa daldırma 40x hedefi (sayısal diyafram açıklığı 1.3) ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun yağ içeren bir konfokal mikroskop kullanın.
NOT: Konfokal mikroskopta ters çevrilmiş bir ışık yolu varsa, slayt baş aşağı konumlandırılmalıdır. Bu durumda, son taramaya başlamadan önce numuneye batması ve kapak kapağı üzerinde sabit bir şekilde dinlenmesi için yaklaşık 30 dakika verin. Alternatif olarak, diseksiyon süresi boyunca akışkan olan, ancak daha sonra katılaşan ve aynı anda floresanı koruyan bir montaj ortamı kullanın. - Uygun lazerleri etkinleştirin: Bu protokolde λ = 488 nm ve λ = 522 nm dalga boylarına sahip optik olarak pompalanan iki yarı iletken lazer ve λ = 638 nm dalga boyuna sahip bir diyot lazer kullanılır. Floresan etiketlerinin emisyon aralığını seçin (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Hibrit bir dedektör salınan fotonları sayarken, lazer çizgisini emisyon eğrisinden en az 10 nm uzağa yerleştirin.
NOT: Seçilen dedektör bant genişliklerinin renk kanallarını temiz bir şekilde ayırdığından emin olmak için tek etiketli doku ile ön kontrollerin yapılması önemlidir (yani, kanal çapraz konuşmasına yol açmaz). Radyo dalgaları hibrid dedektöre müdahale ederek maksimum foton sayısına neden olur ve böylece yığında artefakt çizgilere neden olur. Bu nedenle, mikroskop yakınında bir cep telefonu kullanmaktan kaçının. - Görüntü 10 IHC'ye yayılana kadar dokuyu yakınlaştırın. Görüntünün çözünürlüğünü, tipik olarak ~ 40-60 nm / piksel olan Nyquist örneklemesine göre seçin. Z yönündeki adım boyutunu 0,3 μm'ye ve görüntüleme hızını 400-700 Hz'e ayarlayın.
NOT: Her iki ayar da (adım boyutu ve görüntüleme hızı), optimum görüntüleme parametrelerinin kullanılması ile tarama süresinden tasarruf edilmesi arasında ödün verilmesidir. - Görüntüleme süresini kısaltmak için çift yönlü örnekleme gerçekleştirin. 488 nm ve 638 nm kanal 3x ve 522 nm kanal 6x için çerçeveyi biriktirin; Ayrıca, her kanal için satırların ortalaması 3 kattır. z boyutunda yığının başlangıcını ve sonunu seçin.
- Sinyal-gürültü oranının azalmasını önlemek için hibrit dedektörü (sayma modu) kullanırken kazancı 100'e ayarlayın. Lazer gücünü, ilgilenilen bölgede hiçbir pikselin doygun kalmayacağı, ancak yapıların çoğunlukla tam 8 bit aralığını kapsayacak şekilde ayarlayın. % 0,5'lik düşük bir lazer gücüyle başlayın ve yapılar görünene kadar artırın.
NOT: İyi boyama tipik olarak %0,1 ile %5 arasında bir lazer gücüne ihtiyaç duyar. - Teorik bir nokta yayılma işlevi kullanarak küçük floresan yapıların etrafındaki bulanık haleyi gidermek için görüntü yığınlarının post hoc işlenmesi için dekonvolüsyon yazılımı kullanın. Bir denemedeki her yığın için aynı ayarları kullanın. Çözülmüş görüntüleri .tif veya .ics olarak kaydedin.
NOT: myoVIIa-etiketi (IHC'ler) dekonvolüsyondan fayda sağlamaz ve zaman kazanmak için atlanabilir. Yazılım, görüntü dosyalarının meta verilerini kullanır; ancak, ışık yolu, gömme ortamı veya daldırma ortamı gibi çeşitli parametrelerin belirtilmesi gerekir.
7. Sinaps niceliği
- Serbestçe erişilebilen yazılım ImageJ'de, web sitelerinde de bulunan ek Biovoxxel-eklentisi ile deconvolved yığınlarının bir kopyasını açın.
- Kanalları bölerek tek tek kanalların renklerini ayarlama (Görüntü | Renk | Kanalları Bölme) ve birleştirme (Resim | Renk | Kanalları Birleştir) farklı renkler atayarak tekrar onları yeniden adlandırır. Görüntüyü RGB yığınına dönüştürme (Görüntü | Renk | RGB'ye yığınlayın) ve parlaklığı ve karşıtlığı ayarlayın (Görüntü | | ayarlama Parlaklık/Kontrast | Gerekirse Otomatik veya Maksimum ile ilgili kaydırıcı), böylece ön ve son sinaptik yapılar ve IHC etiketi arka plandan hoş bir şekilde farklıdır.
- Beş IHC seçin ve yığın içinde istediğiniz konuma tıklayarak bunları metin aracıyla (IHC1-IHC5) etiketleyin. Yatırım getirisi yöneticisini açın (Analiz | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi); noktaları bir sayı ile etiketlemek için Etiketler onay kutusunu etkinleştirin. İlgilendiğiniz IHC'yi yakınlaştırın.
- Nokta/çok noktalı aracını çok noktalı modda kullanın (nokta veya çok noktalı mod arasında seçim yapmak için araca sağ tıklayın). Z-boyutunda gezinirken işlevsel bir şerit sinapsına (yani, postsinaptik glutamat yamasıyla yakın yan yana duran bir presinaptik şerit) tıklayın.
NOT: Örtüşme miktarlarına ve her kanal için seçilen renge bağlı olarak, paylaşılan pikseller karışık renkte görünür. Genellikle, bireysel fonksiyonel sinapslar arasındaki ayrım basittir, çünkü birbirlerinden yeterince uzaktırlar. - İlgilenilen tüm yapılar işaretlendiğinde, YG yöneticisinin grafik kullanıcı arayüzünde Ekle'yi tıklayın. Rastgele ada tıklayın ve Yeniden Adlandır'ı seçin.
NOT: Nokta aracı seçenekleri menüsünde Tümünü göster onay kutusu seçildiğinde (nokta aracı simgesini çift tıklatın), aynı şerit sinapsının birden çok kez sayılmasını önlemeye yardımcı olan nokta etiketleri yığının tüm düzlemlerinde kalmaya devam eder. - Sayılacak bir sonraki IHC'yi seçerken, görüntüyü el aletiyle bir sonraki İHC'yi tam olarak görüntüleyecek şekilde ayarlayarak yanlışlıkla sayım eklemekten kaçının. Önceden depolanan verilere daha fazla puncta eklemekten kaçınmak için çok noktalı araçtan nokta aracına geçin. Bir sonraki IHC'de ilgilenilen bir yapıya tıklayın ve çok noktalı araca geri dönün. İlgilenilen tüm IHC'ler değerlendirilene kadar 7,4 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
- Verileri kaydetmek için, YG yöneticisinde bir veri kümesine ve ardından ölçü'ye tıklayın. Ölçülen veri noktalarını listeleyen yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin. Bu listeyi elektronik tablo dosyası olarak kaydetme (Dosya | Farklı kaydet). YG yöneticisinde Tümünü Göster'i etkinleştirerek görüntüyü kaydedin. Nokta etiketlerini yığına kalıcı olarak eklemek için Düzleştir'e tıklayın. Görüntü yığınını kapatırken, değişiklikleri kaydetmeyi kabul edin .
8. Sinaps hacminin analizi ve saç hücresi üzerindeki konumu
NOT: Yazarlar Matlab'a dayanan özel programlanmış bir prosedür kullanmışlardır. Kamuya açık olmadığından, burada yalnızca geniş terimlerle özetlenmiştir (ayrıca bkz.7). Kullanmak istiyorsanız lütfen ilgili yazarla iletişime geçin. Prosedür, giriş olarak TIFF formatında üçlü etiketli (IHC'ler, öncesi ve sonrasısinaptik) bir görüntü yığını bekler, kullanıcıyı grafik bir arayüz aracılığıyla çeşitli analiz adımlarında yönlendirir ve sonuçların elektronik tablo biçiminde kapsamlı çıktısını sağlar.
- Sinaptik yapıların konumunu, bireysel IHC'nin sütun-modiolar eksen ve koklear apikal-bazal eksen ve IHC'nin üst (kütiküler plaka) ila alt (sinaptik kutup) ekseni üzerindeki kapsamı tarafından tanımlanan bir 3D koordinat sistemine normalleştirin.
NOT: Sinaptik elemanların hacimleri (hem sinaptik öncesi hem de sonrası ve fonksiyonel sinapsların birleşik hacmi) μm 3 cinsinden sağlanır ve ilgili medyan değer3'e normalleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kokleae, kardiyovasküler perfüzyondan sonra ya tüm hayvanın fiksatif ile hasat edildi ya da hayvanı ötenazi yaptıktan ve daldırma ile sabitlendikten sonra hızla diseke edildi. İkinci yöntemle, IHC'ler diseksiyon sırasında yerinde kalırken, başarısız perfüzyon ve dolayısıyla yetersiz sabit doku durumlarında, duyusal epitel sıklıkla tahrip olmuştur. Yazarların, transkardiyal perfüzyondan sonra kokleaların fiksasyonunun yetersiz olduğu, beynin fiksasyonunun hala yeterli olduğu vakalarla karşılaştıklarını unutmayın. İnferior perfüzyondan kaynaklanan doku, koklear tepe ve tabana delikler açılarak ve kokleae'nin 2 gün boyunca% 4 PFA'ya daldırılarak sabitlenmesiyle hala kurtarılabilir.
Tüm kokleanın uzunluk tayini, IHC'leri ve sinapslarını farklı karakteristik frekanslara eşdeğer belirli koklear pozisyonlarda değerlendirmek için Müller25'e göre yapılmıştır (Tablo 1). Bunun için istenen koklear pozisyonlar, koklear bazdan baziler membran uzunluğunun yüzdeleri olarak hesaplandı. Genç yetişkin gerbillerden elde edilen 13 kokleanın medyan koklear uzunluğu 11.3 mm idi (çeyrekler arası aralık: 11.02-11.52 mm). Yaşlı gerbillerden 24 kokleanın medyan koklear uzunluğu 11,5 mm idi (çeyrekler arası aralık: 11,24-11,73 mm). Genç erişkin ve yaşlı kokleaların uzunluğu arasında anlamlı fark yoktu (Mann-Whitney U-testi: U = -1.62, p = 0.105); genel medyan 11.48 mm idi. Bireysel kokleaların uzunluğundaki bu varyasyonun küçük olduğu ve sabit uzunluk pozisyonlarının (mm cinsinden) kullanılmasının yeterli olduğu iddia edilebilir. Ancak, yer-frekans fonksiyonu doğrusal değildir. Bu nedenle, medyan uzunluktan sapma, bazal koklear lokalizasyonlar için nispeten daha apikal koklear lokalizasyonlardan daha büyük bir hataya neden olur. Örneğin, medyan koklear uzunluğa (yani 11,48 mm) göre hesaplanan 1 kHz'lik bir frekansa eşdeğer koklear konum için, bu örnekteki en kısa (10,36 mm) ve en uzun koklea (12,28 mm) için karşılık gelen frekans sırasıyla 1,16 kHz ila 0,91 kHz arasında değişmiştir. Temel olarak yerleştirilmiş bir frekans için (örneğin, 32 kHz), frekans aralığı, en kısa ve en uzun koklea için sırasıyla 51.62 kHz ila 23.97 kHz idi. Bu nedenle, özellikle bazal koklear lokalizasyonları incelerken, her kokleadaki ayrı ayrı konumların hesaplanması önerilir.
Şekil 1, ideal immünoetiketlere örnek olan genç bir yetişkinden (10 ay, Şekil 1A) ve yaşlı bir gerbilden (38 ay, Şekil 1B) kokleae'nin maksimum yoğunluk z boyutlu projeksiyonlarını göstermektedir. Genç yetişkin gerbil kokleasını tasvir eden görüntüde, burada mavi renkle gösterilen myoVIIa etiketli IHC'ler, siyah arka planla keskin bir kontrast içindedir. Bu nedenle, bireysel IHC'ler kolayca tespit edilebilir. Ön ve postsinaptik yapılar sırasıyla yeşil ve kırmızı elementler olarak açıkça görülebilir. Yakın yan yana olduklarında fonksiyonel bir sinaps oluşturdukları varsayılır (Şekil 1A', B'). Yaşlı gerbillerin koklealarında nadiren eşlenmemiş presinaptik yapılar (yetim kurdeleler) vardı. Eski gerbilden gelen koklea (Şekil 1B) otofloresan susturucu ile muamele edildi. IHC etiketi daha zayıf görünmektedir, ancak bu örnekte kullanılan lazer gücü, genç yetişkin gerbilinden koklea için kullanılandan üç kat daha yüksektir. Bununla birlikte, IHC'ler hala arka plandan farklıdır. Ön ve postsinaptik yapılar açıkça görülebilir ve her iki kanal için kullanılan lazer gücü, genç yetişkin örneği için benzer veya hatta daha düşüktü. Yaşlı hayvanlardan elde edilen doku tipik olarak önemli ölçüde daha spesifik olmayan görünümlü floresan sinyal gösterdi. Bu nedenle, genç yetişkin ve yaşlı materyal için protokoldeki temel fark, bir otofloresan söndürücü ile tedavidir. Bunun, floresan etiketli antikorlarla immün boyama işleminden sonra gerçekleştirildiğini ve prensip olarak, amaçlanan antikor etiketini de etkileyebileceğini unutmayın. Bununla birlikte, tedavi, spesifik olmayan kökenli yabancı floresansı etkili bir şekilde azaltırken, ilgilenilen yapıların spesifik etiketinin yeterli sinyalini bıraktı (Şekil 1B ile Şekil 2B'yi karşılaştırın). Bununla birlikte, ön sonuçlar, stria vascularis'te, yaşlı gerbillerden alınan örneklerde yabancı floresanın ortaya çıkmadığını göstermiştir.
Optimum olmayan şekilde işlenmiş yığın örnekleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Şekil 2A , eski bir gerbilden (36 ay) bir yığının maksimum yoğunluklu z-projeksiyonunu göstermektedir; burada da doğal olmayan bir şekilde bükülmüş veya parçalanmış, tamamen taranmamış olan IHC'ler bulunmaktadır. Sonuç olarak, bu taramada sadece IHC'lerin apikal ve bazal kutupları görülebilir. IHC'lerin eksik orta kısmına daha fazla sinaps yerleştirildiği göz ardı edilemez ve bu nedenle güvenilir bir analiz mümkün değildir. Bu nedenle, değerlendirilen tüm IHC'lerin konfokal yığında tamamen taranması çok önemlidir. Şekil 2B, yaşlı bir gerbilde (38 ay) örneklenen bir yığının maksimum yoğunluklu z-projeksiyonunu göstermektedir. Bu durumda otofloresan söndürücü kullanılmadığı için kaynağı belirsiz floresan yüksektir. Bununla birlikte, yabancı floresan büyük ölçüde oldukça tipik olan GluA2 etiketi ile ilişkili (kırmızı) kanalla sınırlıydı. Bu gibi durumlarda, şeritlerin CtBP2 etiketi nispeten temiz ve spesifik ise, fonksiyonel sinapsları saymak hala mümkün olabilir. Şekil 2C , yaşlı bir gerbilden (42 ay) elde edilen bir yığının maksimum yoğunluklu z-projeksiyonunu göstermektedir. Burada, sinapslar bireysel IHC'lere tahsis edilemez, çünkü IHC'ler büyük ölçüde parçalanmıştır; Gerçekten de, kaç tane İHC'nin temsil edildiğinden emin olmak zordur. Şekil 3A'da gösterilen örnekte, tarama sırasında konfokal mikroskobun yakınında bir cep telefonu kullanılmıştır. Çizgiler mavi kanalda (IHC etiketi) görünür. Neyse ki, bu durumda, bu sinaptik kanalları etkilemedi ve IHC'lerin sadece üst kısmını etkiledi, bu nedenle bir analiz hala geçerliydi.
Şekil 3, immün boyama işleminden sonra 3 ay (Şekil 3A, A') ve 29.5 ay (Şekil 3B, B') elde edilen genç yetişkin bir gerbilden aynı koklea parçasından alınan yığınların maksimum yoğunluklu z-projeksiyonlarını göstermektedir. Karşılaştırılabilir kalmak için, görüntüler tam olarak aynı yerden (önceki taramada ağartma geçirmiş olabilir) değil, aynı koklear parçadan alınmıştır. Daha sonraki zaman noktasında alınan tarama için, lazer gücünün ~ 2 ila 3 kat arttırılması gerekiyordu. Bununla birlikte, etiketli yapılar hala açıktır. Özellikle postsinaptik ve IHC yapıları gösteren kanallarda sinyal-gürültü oranı azalırken, presinaptik etiketli kanal daha az etkilendi. IHC başına fonksiyonel sinapsların nicelleştirilmesi hala mümkündür.
IHC üzerindeki sinaps hacminin ve konumunun analizi için tipik sonuçlar, Şekil 1A'da gösterilen konfokal yığın kullanılarak Şekil 4'te gösterilmiştir. Ayrı ayrı tanımlanmış IHC'ler, her birine tahsis edilen fonksiyonel sinapslarla (ön ve postsinaptik etiketlerin birlikte lokalizasyonu ile tanımlanan) veya bunlar olmadan, farklı renklerde ızgara rekonstrüksiyonları olarak grafiksel olarak görüntülenir. Bu ekran, çeşitli görüş açıları elde etmek için 3D olarak serbestçe döndürülebilir (Şekil 4A, B). IHC'ler grafik görüntüleme için de seçilebilir (Şekil 4B). IHC merkezli koordinat sistemi içindeki sinaptik hacimlerin dağılımının farklı yönlerini gösteren çok çeşitli veri grafikleri üretilir (örnekler Şekil 4C-E'de). Her IHC ve her sinaptik eleman için ham nicel veriler, daha sonra örneğin daha fazla istatistiksel analiz için birkaç konfokal yığında birleştirilebilen elektronik tablolar olarak da mevcuttur.
Şekil 1: Başarıyla işlenmiş kokleae örnekleri. (A) 1 kHz'e karşılık gelen koklear bir yerde elde edilen genç yetişkin bir gerbilden (10 ay) ve (B) 500 Hz'e eşdeğer bir koklear lokasyonda elde edilen yaşlı bir gerbilden (38 ay, panel B) konfokal yığınların maksimum yoğunluklu z-projeksiyonları. İHC'ler myoVIIa'ya (mavi) karşı bir antikor ile boyandı, presinaptik şeritler anti-CtBP2 (yeşil) ile etiketlendi, ve postsinaptik glutamat yamaları anti-GluA2 (kırmızı) ile etiketlendi. Yaşlı gerbilin kokleası, immün boyama sonrası otofloresan söndürücü ile tedavi edildi. Netlik için, IHC'lerin ana hatları kesikli çizgilerle gösterilir. Paneller (A') ve (B'), (A) ve (B) panellerinden karşılık gelen koklealardaki kareler tarafından özetlenen alanların genişletilmesini gösterir. Sarı ok uçları fonksiyonel sinapslara işaret eder. Sinaptik öncesi ve sonrası yapıları gösteren kanallar (ancak IHC kanalını değil) dekonvolüsyona uğradı. Ölçek çubukları = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Kısaltmalar: IHC = iç saç hücresi; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bağlayıcı protein 2; GluA2 = iyonotropik glutamat reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Optimal olmayan şekilde işlenmiş kokleae örnekleri. İşlemenin yetersiz olduğu konfokal yığınların maksimum yoğunluklu z-projeksiyonları, (A) 36 aylık ve (B, C) 38 aylık gerbillerden ve sırasıyla 16 kHz, 8 kHz ve 32 kHz'e karşılık gelen koklear konumlardan. (A) ve (C) panellerindeki kokleaların türetildiği gerbiller transkardiyal olarak perfüze edildi ve panelden (C) koklea ek olarak% 4 PFA'da 3 gün boyunca postfikte edildi. (B)'den gelen koklea 2 gün boyunca %4 PFA'ya daldırılarak sabitlendi. (A) ve (C)'den gelen kokleae'ler otofloresan susturucu ile muamele edildi. IHC'ler myoVIIa'ya (mavi) karşı bir antikor ile boyandı, presinaptik şeritler anti-CtBP2 (yeşil) ile etiketlendi ve postsinaptik glutamat yamaları anti-GluA2 (kırmızı) ile etiketlendi. Tüm kanallar deconvolved. Parlaklık ve kontrast, konfokal taramadan sonra daha da ayarlandı. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: PFA = paraformaldehit; IHC = iç saç hücresi; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bağlayıcı protein 2; GluA2 = iyonotropik glutamat reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uzun süreli depolamadan sonra immünoetiketin stabilitesi. Genç yetişkin bir gerbilden (10 ay) konfokal yığınların maksimum yoğunluklu z-projeksiyonları, 16 kHz koklear lokalizasyonda, (A) boyamadan 3 ay sonra ve (B) boyamadan 29,5 ay sonra aynı koklear parça üzerinde biraz daha bazal koklear bir yerde alınır. Koklea 2 gün boyunca %4 PFA'ya daldırma ile sabitlendi. Netlik için, (A') ve (B'), sırasıyla (A) ve (B)'deki karelerle gösterilen alanlardan yalnızca birkaç işlevsel sinapsı yakınlaştırır. IHC'ler myoVIIa'ya (mavi) karşı bir antikor ile boyandı, presinaptik şeritler anti-CtBP2 (yeşil) ile etiketlendi ve postsinaptik glutamat yamaları anti-GluA2 (kırmızı) ile etiketlendi. IHC kanalları için lazer gücü sırasıyla% 1.3 ve% 3, presinaptik kanallar için% 0.4 ve% 1.1 ve postsinaptik kanallar için% 1.1 ve% 2 idi. (A) harfinde, IHC'lerin üst kısmında, konfokal mikroskopa yakın bir yerde bir cep telefonu kullanımından kaynaklanan mavi çizgilerin görülebildiğini unutmayın. Ölçek çubukları = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Kısaltmalar: PFA = paraformaldehit; IHC = iç saç hücresi; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bağlayıcı protein 2; GluA2 = iyonotropik glutamat reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sinaps hacminin nicelleştirilmesinin temsili sonuçları . (A) On IHC, myoVIIa immünoetiketine dayanan farklı renkli ızgara rekonstrüksiyonları olarak gösterilmiştir. Kolokalize CtBP2-(yeşil) ve GluA2 etiketli elemanlar (kırmızı) ile tanımlanan ilişkili fonksiyonel sinapsları, netlik için IHC'lerle birlikte ve ayrıca aşağıda ayrı ayrı görüntülenir. Görüş açısının IHC'lerin uzun eksenine dik olacak şekilde seçildiğini ve bu nedenle orijinal konfokal görüntüden farklı olduğunu unutmayın (Şekil 1A). (B) IHC'lerden biri 90° döndürülmüş olarak seçilmiş ve gösterilmiştir. Siyah düzlem kullanıcı tarafından manuel olarak tanımlandı ve IHC'yi sütun-modiolar ekseni boyunca ikiye böler. (C) Bu konfokal yığındaki tüm fonksiyonel sinapsların yerini, ilgili IHC'lerinin normalleştirilmiş üç eksenine göre gösteren kabarcık grafiği. sembollerin boyutu, presinaptik elemanın hacmi ile orantılıdır. Görüş açısının panele (B) benzer olacak şekilde seçildiğini unutmayın. (D) Fonksiyonel sinapsların presinaptik (sol 2 kutu) ve postsinaptik (sağ 2 kutu) ortakları için ayrı ayrı ve ayrıca kendi IHC'lerinin modiolar veya sütun yarısındaki konumlarına göre ayrılmış (farklı renkler) sinaptik elemanların normalleştirilmiş hacimlerinin kutu grafiği. Kutular, medyanlar çizgilerle gösterilen çeyrekler arası aralıkları temsil eder. Kesikli bıyıklar, çeyrekler arası aralığın 1,5 katını gösterir ve çarpılar bunun ötesindeki dış değerleri gösterir. (E) Fonksiyonel sinapsların sinaptik öncesi ve sonrası partnerlerinin normalleştirilmiş hacimlerinin dağılım grafiği. Farklı semboller, ilgili IHC'lerinin modiolar veya sütun yarısındaki konumu gösterir. Kısaltmalar: IHC = iç saç hücresi; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bağlayıcı protein 2; GluA2 = iyonotropik glutamat reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Farklı uzunluklardaki koklealardaki belirli hedef frekanslara eşdeğer olan tepe noktasından uzaklıklar. Eşdeğer en iyi frekanslar, Müller25 tarafından verilen denkleme dayanarak hesaplandı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde özetlenen yöntemle, koklealardaki IHC'leri ve sinaptik yapıları genç yetişkin ve yaşlı gerbillerden immüno-etiketlemek, sinaptik öncesi ve sonrası elemanların birlikte lokalizasyonu ile varsayılan fonksiyonel sinapsları tanımlamak, bunları bireysel İHC'lere tahsis etmek ve sayılarını, hacimlerini ve konumlarını ölçmek mümkündür. Bu yaklaşımda kullanılan antikorlar ayrıca dış saç hücrelerini (OHC'ler; myoVIIa) ve presinaptik şeritlerini de etiketledi. Ayrıca, hem IHC'lerin hem de OHC'lerin immüno-etiketlenmesi için uygun bir alternatif, otoferline karşı bir antikordur ve OHC'ler IHC'lerden çok daha sönük görünmektedir.
Perfüzyon iki farklı kurulum kullanılarak gerçekleştirilebilir. 1) Ticari bir damlama hattını besleyen tek bir şişenin, hayvanın yaklaşık 1,5 m yukarısındaki bir kasnak tekerleği üzerinde asılı olduğu yerçekimi beslemeli bir damlama hattı sistemi. Sıvılar, üstte açık olan şişeyi indirdikten sonra art arda verilir. 2) Dijital değişken hızlı peristaltik pompa kullanan, sıvıyı almak için bir ucunda ince, uzun bir tüp ve diğer ucuna kolayca takılabilen bir iğne bulunan bir sistem. Her ikisi de eşit derecede iyi çalışır ve ince farklılıklar burada detaylandırılmayacaktır. Bununla birlikte, yazarlar özellikle, hayvanın delikli bir platformda ve dumanların aşağıda çekildiği aşağı taslak tarzı bir tezgah önermektedir. Bu, egzoz fonksiyonundan ödün vermeden cerrahi alana iyi erişim sağlar (açık duman dolabında çalışmanın aksine).
Dokunun uygun şekilde sabitlenmesi kritik öneme sahiptir, çünkü aksi takdirde duyusal epitel diseksiyon sırasında ayrılacak ve parçalanacaktır. Gerbilde, fiksatife yaygın olarak kullanılandan daha uzun süre maruz kalmak gereklidir (örneğin, fareleriçin 17,27,13 veya gine domuzları 28). Gerbiller için tercih edilen yöntem, hayvanın ölümünden sonra kokleanın hızlı bir şekilde çıkarılması ve en az 1,5 gün boyunca daldırılmasıdır. Kardiyovasküler perfüzyon tercih edilirse, fiksasyonun birkaç dakika içinde başlaması ve iyi ilerlemesi çok önemlidir. Perfüzyon sırasında fiksasyon kalitesini nihai olarak derecelendirmek zor olabileceğinden, kokleae'nin tarif edildiği gibi rutin olarak postfiksiyonu önerilir.
Yıkama adımlarına uymak önemlidir, bu sayede son yıkama adımı (adım 2.7) en önemlisidir. Yeterince yıkanmazsa, doku yapışkandır ve diseksiyon aletlerine yapışır, bu da diseksiyonu zorlaştırır. Spesifik olmayan floresanı azaltmak için yaşlı gerbillerden toplanan koklealarda otofloresan söndürücü kullanılması da önerilir. Otofloresan, 29,30,31 yaşlarındaki hayvanların dokularında yaygın olan lipofussinden kaynaklanabilir ve geniş çapta yayıldığı kadar geniş çapta heyecanlı görünmektedir. UV spektrumunda bir dalga boyu ile uyarıldığında (λ = 364 nm), lipofuscin geniş bir emisyon aralığına sahiptir (λ = 400-700 nm, maksimum ~λ = 568 nm)32. İnsan miyokard dokusunda, lipofussin λ = 555 nm uyarılma ve λ = 605 nm33 emisyon ile görülebilir. Benzer şekilde, gerbillerin IHC'lerinde, yazarlar, lipofuscin granüllerinden otofloresan öneren AF568 antikoru için kullanılan kanalda en belirgin şekilde spesifik olmayan floresanda bir artış olduğunu fark etmişlerdir. Bu nedenle, hayvanlardan alınan dokularla çalışırken genel bir öneri, en az kritik immüno-etiket için 550-600 nm civarında uyarma bant genişliğini kullanmaktır.
Toplam koklear uzunluğun ölçülmesi ve belirli koklear pozisyonların doğru tanımlanması ancak tüm uzunluğu korunduğunda mümkündür. Duyusal epitelin parçaları diseksiyonda kaybolursa, kalan parçanın veya hatta sadece spiral ganglion parçasının monte edilmesi ve ayrıntılı notlar tutulması önerilir. Daha sonra eksik bölümü makul bir doğrulukla tahmin etmek genellikle mümkündür. Kokleanın apikal kısımları tamamen korunmuşsa, ancak bazal uç eksikse, apikal kısımdaki spesifik koklear yerler, gerçek değerden sapma küçük olduğu için, kullanılan gerbil popülasyonu içindeki medyan koklear uzunluğa dayalı pozisyonlar hesaplanarak tanımlanabilir.
Sinaps hacim niceliğinin önemli bir sınırlaması, ortaya çıkan mutlak hacimlerin farklı konfokal yığınlar arasında karşılaştırılabilir olmamasıdır. Ortaya çıkan sinaptik eleman hacimlerini belirleyen kritik adım, ilk algılama için yoğunluk eşiğinin seçimidir. Bununla birlikte, bu yoğunluk eşiğinin seçimi, mevcut protokoldeki kullanıcı ve diğerleritarafından öznel olarak yapılır 3,27,34. Ayrıca, konfokal görüntüdeki immünofloresanın parlaklığı, doku kalınlığı, dokunun optik yola göre oryantasyonu, lazere maruz kalma süresi ve hassas konfokal ve dekonvolüsyon ayarları gibi örnekler arasında standartlaştırılması çok zor olan birçok faktöre bağlıdır. Tüm bu uyarılar, yaşlanan gerbiller için tipik olduğu gibi, nadir materyalin önemli bir süre boyunca elde edilmesi durumunda daha da kötüleşir. Birlikte, bu, havuza alınmış verilerde önyargıların hariç tutulmasının çok zor olduğu ve en iyi durum senaryosunun yüksek varyanslı bir veri kümesi olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, sinaptik hacimlerin, Liberman ve ark.3 tarafından tanıtıldığı gibi, bireysel konfokal yığının ilgili medyan hacmine rutin olarak normalleştirilmesi önerilir. Belirgin dezavantajı, sinaptik hacimlerin yalnızca belirli bir görüntü yığını içinde, örneğin IHC'deki farklı konumlar arasında, ancak farklı koklear konumlar veya örnek yaşları arasında karşılaştırılamamasıdır.
Ön ve postsinaptik yapıların ikili etiketlenmesi ve birlikte lokalizasyon gerekliliği, fonksiyonel sinaps sayısının tek başına her iki etiketi kullanmaktan daha güvenilir bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Yalnızca bir etiket uygulanabilirse, iki nedenden dolayı AF488 veya benzer dalga boyu özelliklerine sahip floresan etiketlerle birleştirilmiş presinaptik anti-CtBP2'nin kullanılması önerilir. İlk olarak, yetim şeritler, yani birlikte lokalize bir postsinaptik etiketi olmayan CtBP2 etiketli elemanlar, nadirgörülen 17 gibi görünmektedir ve yazarlar bunu yaşlı gerbiller için doğrulamıştır. Bu nedenle, postsinaptik bir ortakla birlikte lokalizasyonu doğrulayamamanın getirdiği hata küçüktür. Bununla birlikte, gürültüye maruz kalan kulakları incelerken bunun daha önemli bir sorun haline geldiği belirtilmelidir (örneğin, 28). İkincisi, kaynağı belirsiz yüksek floresan sinyaline sahip durumlarda, gürültü tipik olarak kanalı 568 nm civarında bir uyarma dalga boyu kullanarak en büyük ölçüde etkiledi (örneğin, GluA2 etiketini temsil eden Şekil 2B'de). Bu gürültünün en azından bir kısmı, yaşlı hayvanlardan elde edilen dokularda, lipofuscin otofloresan olabilir. Bu nedenle, temiz, tek bir anti-CtBP2 etiketi şansını en üst düzeye çıkarmak için, bu dalga boyu kanalından kaçınmanız önerilir. Son olarak, uygun serin ve karanlık depolama koşullarıyla, burada kullanılan immünoetiketlemenin, en az 2,5 yıla kadar uzun süreler boyunca stabil olduğu gösterilmiştir (Şekil 3B), bu da yaşlı gerbiller gibi değerli dokuların yeniden değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.
IHC afferent sinaps sayısının nicelleştirilmesi, periferik işitme sisteminin durumunu, yaşa bağlı işitme kaybı da dahil olmak üzere birçok bağlamda değerlendirmek için önemli bir metrik haline gelmiştir. Şu anda yayınlanan çeşitli protokoller vardır (örneğin, gerbiller 21, fareler17,13, kobaylar 10,28 ve insanlar35). Burada özetlenen yöntem, ayrıntılarında, genç yetişkin ve yaşlı gerbillere özgüdür, ancak diğer türlerde de kullanılabilecek bazı genel öneriler türetilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Lichun Zhang'a yöntemin kurulmasına yardımcı olduğu için ve görüntüleme tesislerinin kullanımı için Oldenburg Carl von Ossietzky Üniversitesi, Floresan Mikroskopi Hizmet Birimi'ne teşekkür eder. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi -EXC 2177/1 kapsamında finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
