Summary
De senaste framstegen inom humaninducerade pluripotenta stamcellsdifferentieringsprotokoll möjliggör stegvis härledning av organspecifika celltyper. Här ger vi detaljerade steg för underhåll och expansion av iPSC-härledda luftvägsbasalceller och deras differentiering till ett mucociliärt epitel i luft-flytande gränssnittskulturer.
Abstract
Sjukdomar i den ledande luftvägarna som astma, cystisk fibros (CF), primär ciliär dyskinesi (PCD) och virala luftvägsinfektioner är viktiga orsaker till sjuklighet och dödlighet över hela världen. In vitro-plattformar som använder humana bronkialepitelceller (HBECs) har varit avgörande för vår förståelse av luftvägsepitelet vid hälsa och sjukdom. Tillgång till HBECs från individer med sällsynta genetiska sjukdomar eller sällsynta mutationer är en flaskhals inom lungforskningen.
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genereras lätt genom "omprogrammering" av somatiska celler och behåller den unika genetiska bakgrunden hos den enskilda givaren. De senaste framstegen möjliggör riktad differentiering av iPSC till lungepitelceller, alveolära typ 2-celler, liksom cellerna i det ledande luftvägsepitelet via basalceller, de viktigaste luftvägsstamcellerna.
Här beskriver vi ett protokoll för underhåll och expansion av iPSC-härledda luftvägsbasalceller (nedan kallade iBC) samt deras trilineagedifferentiering i luft-vätskegränssnitt (ALI) -kulturer. iBC bibehålls och expanderas som epitelsfärer suspenderade i droppar av extracellulär matris odlad i ett primärt basalcellsmedium kompletterat med hämmare av TGF-ß- och BMP-signalvägar. iBC inom dessa epitelsfärer uttrycker viktiga basalmarkörer TP63 och NGFR, kan renas genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), och när de pläteras på porösa membran under standard ALI-odlingsförhållanden, differentieras till ett funktionellt luftvägsepitel. ALI-kulturer som härrör från friska givare består av basala, sekretoriska och multicilierade celler och visar epitelbarriärintegritet, rörliga flimmerhår och slemsekretion. Kulturer som härrör från individer med CF eller PCD rekapitulerar den dysfunktionella CFTR-medierade kloridtransporten eller immotile cilia, respektive sjukdomsframkallande epitelfel.
Här presenterar vi ett protokoll för generering av mänskliga celler som kan tillämpas för modellering och förståelse av luftvägssjukdomar.
Introduction
Kroniska lungsjukdomar står för en stor börda av sjuklighet och dödlighet över hela världen1. Tillstånd som påverkar de ledande luftvägarna, såsom astma, cystisk fibros (CF), primär ciliär dyskinesi (PCD) och virusinfektioner representerar både vanliga och sällsynta sjukdomar, förvärvade och genetiska, som bidrar till denna världsomspännande börda. De viktigaste funktionerna i de ledande luftvägarna är att: 1) fungera som en ledning för det laminära luftflödet och 2) tillhandahålla mucociliary clearance av patogener och skräp. Sekretoriska, multicilierade och basala celler representerar de viktigaste epitelcellstyperna i den ledande luftvägarna. Sällsynta epitelcelltyper inkluderar jonocyter, tuftceller och neuroendokrina celler och har granskats någon annanstans2.
I stort sett har ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och utveckla terapeutiska metoder varit en konsekvent brist på mänsklig primär vävnad för användning i prekliniska modeller. HBECs anses allmänt vara den guldstandard in vitro-modellen för human luftvägsepitelbiologi och har spelat nyckelroller i CF-forskning i synnerhet3. De isoleras emellertid vanligtvis antingen från bronkoskopiska biopsier, från lungvävnad efter operation eller från lungor som avvisas för transplantationsändamål. Tillgång till HBECs från individer med genetiska sjukdomar, inklusive forskningsprioriteringar för CF och PCD, är sällsynt och oförutsägbar. Att övervinna denna flaskhals till patient-härledda luftvägsepitelceller behövs. iPSCs genereras lätt från vilken individ som helst, de behåller donatorns unika genetiska bakgrund och har en anmärkningsvärd förmåga att sprida sig och överleva på lång sikt under cellodlingsförhållanden 4,5,6. Genom att rekapitulera viktiga embryologiska steg genomgår iPSCs "riktad differentiering" till organspecifika celltyper. Vi och andra har utvecklat protokoll för att generera iPSC-härledda lungprogenitorer, alveolära typ 2-celler 7,8 och cellerna i den ledande luftvägen inklusive luftvägsbasceller 9,10,11,12.
Luftvägsbasalcellen är stamcellen i den ledande luftvägen13. I tidigare publicerat arbete har vår grupp genererat iPSC-härledda luftvägsepitelceller, inklusive en delmängd (iBC) som uttrycker kanoniska basalcellsmarkörer inklusive TP63, KRT5 och NGFR. Efter ledtrådar från vuxen basalcellsbiologi leder hämning av dubbla SMAD-vägar (TGF-β och BMP) till uppreglering av NGFR + iBC11,14. NGFR+ iBC:er återsuspenderas som enstaka celler i droppar av extracellulär matris och odlas i ett basalcellsmedium. De förnyar sig själv för att upprätthålla en iBC-population och bilda epitelsfäroider; emellertid differentieras en andel också till sekretoriska celler i detta format (kallad 3D-kultur). I följande protokoll beskriver vi stegen för att underhålla och utöka dessa iBC i 3D-kulturen, liksom de steg som krävs för att generera en funktionell 2-D mucociliary ALI-kultur.
De första stegen i detta differentieringsprotokoll har publicerats tidigare och kommer inte att granskas här 11,12. Detta manuskript kommer att fokusera på expansion och rening av iBC och deras efterföljande differentiering till funktionella sekretoriska och multicilierade celler i ALI-odling.
Protocol
Var och en av följande steg bör utföras med steril teknik i en biosäkerhetsnivå 2 laminär flödeshuv. Alla medier ska värmas till rumstemperatur (22 °C) innan de tillsätts i cellerna, om inte annat uttryckligen anges. Varje centrifugeringssteg ska utföras vid rumstemperatur (ca 22 °C). Figur 1 beskriver schemat för protokollet.
1. Beredning av erforderliga medier
OBS: Se tilläggsfil 1 för mer information.
- Basalcell medium
- Förbered basmediet enligt tillverkarens instruktioner.
- Tillsätt 5 μl A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 5 μL Primocin (50 mg/ml) till varje 50 ml A83-01 (10 mM), 5 μl DMH1 (10 mM), 50 μl Y-27632 (10 mM) och 100 μl Primocin (50 mg/ml). Nedan kallas detta medium basalcellsmedium.
- Förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad.
- ALI Differentiering Medium
- Förbered mediet enligt tillverkarens instruktioner.
- Till varje 50 ml ALI Differentiering Medium, tillsätt 100 μL Primocin (50 mg/ml).
- Förvaras skyddat från ljus vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Sortera buffert
- För varje 50 ml sorteringsbuffert, kombinera 47,5 ml Hanks balanserade saltlösning, 1 ml FBS, 200 μl EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-buffert (1 M), 50 μl Y-27632 (10 mM) och 100 μl Primocin (50 mg / ml).
- Filtersterilisera med en porstorlek på 0,4 μm.
- Förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Kryokonservering Medium
- För varje 50 ml kryokonserveringsmedium, kombinera 45 ml basalcellmedium och 5 ml dimetylsulfoxid (DMSO).
- Filtersterilisera med en porstorlek på 0,4 μm.
- Förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad.
2. Upptining av kryokonserverade iBC: er
- Tina (på is) en tillräcklig volym 3-D-tillväxtfaktorreducerad extracellulär matris (nedan kallad 3-D-matris). Håll på is tills den är klar att användas.
OBS: Vid upptining av en injektionsflaska (innehållande 250 000 celler), tina 100-200 μl 3D-matris. - Tina en injektionsflaska med tidigare kryokonserverade encellssuspensioner av iBC genom att inkubera i ett 37 °C vatten- eller pärlbad tills det inte finns något synligt fryst medium (1-2 min).
- Använd en 5 ml serologisk pipett och tillsätt cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 6-10 ml DMEM / F12 droppvis till cellsuspensionen, blanda försiktigt och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter för att pelletera cellerna.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml basalcellsmedium med en P1000-mikropipett. Ta bort en alikvot på 10 μl och utför ett cellantal.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med en densitet av 4 000 celler/μl i tidigare tinad 3D-matris med en P1000-mikropipett.
Det är viktigt att undvika att lägga till bubblor i 3D-matrisen. Pipettera matrisen långsamt och försiktigt. - Med en P200-mikropipett, tillsätt en droppe (25 eller 50 μL) till basen av varje brunn i en 12-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta. Om man börjar med 250 000 frysta celler är det förväntade antalet droppar i detta steg mellan 3-4 (25 μl droppar), beroende på cellviabiliteten.
- Inkubera plattan vid 37 °C i cirka 15 minuter och tillsätt sedan tillräckligt med basalcellsmedium till varje brunn för att helt sänka ner droppen (1,5 ml för 50 μl; 1 ml för 25 μl) med hjälp av en 5 ml serologisk pipett. Sätt tillbaka plattan till en fuktad inkubator.
- Foderceller var 2: e dag med färskt basalcellmedium. Tillsätt färskt medium på sidan av brunnen med 5 ml serologisk pipett, var försiktig så att du inte stör celldroppen.
OBS: Tätheten av celler som pläteras i detta steg är 10 gånger högre än rutinmässig passaging av iBC i avsnitt 3.
3. Dissociation av sfäroider och expansion av iBC i 3D-kultur
- Tina (på is) en tillräcklig volym 3D-matris. Håll på is tills den är klar att användas.
Volymen av 3D-matris som krävs varierar beroende på hur många celler användaren behöver. - Cirka 5-7 dagar senare, aspirera mediet från varje brunn och med en P1000-mikropipett, tillsätt 1 ml Dispase II (1 U / ml) direkt på sfäroiderna för att dissociera från matrisens droppe.
- Placera plattan i 37 °C inkubator i 10-15 min.
- Använd en P1000-mikropipett och pipettera Dispase upp och ner 1-2 gånger och bryta upp stora klumpar av 3D-matris. Sätt tillbaka plattan till 37 °C i ytterligare 30-40 minuter, så att matrisen kan lösas upp helt.
- När droppen av 3-D-matris inte längre är synlig under ljusmikroskopet, lägg till de fritt flytande sfäroiderna till en 15 ml konisk med en 5 ml serologisk pipettspets. Tillsätt DMEM/F12 för en slutlig volym på 10 ml per konisk och centrifugera vid 200 x g i 3 min för att pelletera sfäroiderna.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml 0,05 % trypsin (37 °C) för varje initial droppe som dissocieras (t.ex. tillsätt 4 ml trypsin till den koniska kolven om du börjar med fyra droppar).
- Inkubera vid 37 °C, triturera ofta (var 2-3: e minut).
- Utvärdera med ljusmikroskopet med några minuters mellanrum. När majoriteten (>90%) av sfäroiderna har dissocierats till enstaka celler, lägg till 10% Fetal Bovine Serum (i DMEM / F12) med ett volymförhållande på 1: 1 till trypsinet.
- Filtrera cellerna genom en 40 μm cellsil och centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Utför ett cellantal och resuspendera cellerna jämnt med en densitet av 400 celler / μL tinad 3D-matris. Undvik att införa luftbubblor. Resuspendera så många droppar som behövs för nedströms applicering. Upprepa steg 2.6-2.9 för varje brunn.
4. Utvärdering och rening av NGFR+ iBC:er
- Efter 10-14 dagar efter den senaste passagen, dissociera sfäroiderna till en enda cellsuspension som i steg 3.2-3.5 och utför en cellräkning.
OBS: Olika iPSC-linjer beter sig annorlunda; Därför kan intervallet 10-14 dagar variera för olika iBC. Se figur 2 för typiska utseenden av 3D iBC efter 1, 4, 8 och 14 dagar, när de är tillräckliga för NGFR+-cellsortering. Sortering tidigare än rekommenderat (t.ex. dag 8 som i figur 2C) resulterar i ett totalt sett lägre cellantal med mindre frekvent NGFR-uttryck. Sortering senare än rekommenderat (t.ex. mer än 14 dagar efter den senaste passagen) leder till dålig cellöverlevnad efter sortering. - Resuspendera cellerna med en densitet av 1 x 106 celler / 100 μL i Sort Buffer (huvudpopulation). Överför en liten alikvot (25-50 μl) till ett separat rör (mindre population).
- Tillsätt konjugerad anti-NGFR-antikropp (1:100 utspädning) till huvudcellpopulationen.
- Lägg till isotypkontrollantikropp (1:200 utspädning) till den mindre cellpopulationen.
- Skydda cellerna från ljus och håll på is i 30 minuter, intermittent (var 5-10: e minut) triturera cellerna för att förhindra pelletering.
- Efter 30 minuter lägger du till sorteringsbufferten i förhållandet 1:1 till varje cellrör. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten, återsuspendera de pelleterade cellerna i sorteringsbufferten med en densitet av 10 x 106 celler / ml och tillsätt levande eller död cellfläck.
- Använd lämplig NGFR+-gatingstrategi (baserad på isotypkontroll, se figur 3) och sortera tillräckligt många levande NGFR+-celler för nödvändiga nedströmsapplikationer.
OBS: Om du använder iBC med fluorescerande reportrar (dvs. NKX2-1GFP TP63tdTomato) rekommenderas att sortera efter "trippelpositiva" celler (dvs. NKX2-1GFP +, TP63tdTomato +, NGFR +), med lämpligt grindval och kompensation (figur 3). Under denna expansion av iBC kan en andel celler differentieras till sekretoriska celler och mycket liten andel multicilierade celler kan också detekteras. Båda dessa populationer är NGFR-.
5. Generering av mucociliära ALI-kulturer
- Förbered 6,5 mm porösa membraninsatser genom att tillsätta en 200 μL matris till apikalkammaren (human embryonal stamcellskvalificerad matris eller rekombinant humant laminin-521) enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera vid 37 °C i minst 2 timmar innan det behövs.
- Aspirera beläggningsmatrisen från insatsens apikala kammare. Tillsätt 500 μL basalcellsmedium till basolateralkammaren.
- Resuspendera minst 30 000 sorterade NGFR+-celler (från steg 4.5) i 100-200 μL Basal Cell Medium och överför till apikalkammaren med hjälp av en P200-mikropipett. Upprepa för så många brunnar som önskas (och tillgängliga celler). Placera plattan i fuktad 37 °C inkubator.
- På 2-3 dagar, aspirera apikala och basolaterala kamrar och mata med färskt basalcellmedium (500 μl till apikalt, 100 μl till basolateralt).
- Övervaka den apikala kammaren dagligen med ljusmikroskopi. När celler är >80% konfluenta (vanligtvis 3-7 dagar), ersätt basalcellsmedium med ALI-differentieringsmedium (inte förvärmt) i både apikala och basolaterala kamrar. När du arbetar med ALI Differentiation Medium, skydda mot ljus genom att hålla mediebehållare inslagna i folie och genom att stänga av taklampor när det är möjligt.
- Nästa dag, aspirera mediet från den apikala kammaren och utsätt därmed den apikala ytan för luft.
- Byt ut ALI Differentiation Medium-mediet i basolateralkammaren var 2-3: e dag.
- Övervaka kulturens utseende var 1-2: e dag. Aspirera försiktigt all ackumulerad vätska från apikalkammaren utan att störa cellskiktet.
- Bedöm det transepiteliella elektriska motståndet (TEER) för epitelial integritet.
OBS: TEER kan bedömas under dagarna efter luftexponering för att ge en avläsning av epitelskiktets integritet. Den ideala tiden för att mäta TEER har inte fastställts, även om värden som överensstämmer med högkvalitativ mucociliär differentiering vanligtvis är >500 x cm2. - Om det är nödvändigt att avlägsna skräp eller slem, tillsätt försiktigt 100 μL PBS (utan Ca2+ eller Mg2+) till apikalkammaren. Inkubera vid 37 °C i 10 minuter och aspirera sedan försiktigt PBS.
- Efter 7-10 dagars luftexponering uppträder vanligtvis rörliga cilia och kan ses med ljusmikroskopi. Beroende på det planerade experimentet och avläsningen kan celler analyseras efter 14-28 dagars luftexponering.
OBS: Om fluorescerande reporterceller har använts, och om ett levande cellfluorescerande mikroskop är tillgängligt, kan celler spåras med ljusmikroskopi samt reporterfluorescens.
6. Valfri (men rekommenderad) kryokonservering av iBC
- Efter 10-14 dagar efter den senaste 3D-odlingspassagen dissocierar du sfäroiderna till encellssuspension som i steg 3.2-3.5. Utför en cellräkning.
- Resuspend i kryokonserveringsmedium med en densitet av 250 000 celler/500 μL i en kryomedialt.
- Placera kryoceller i en behållare för att säkerställa ett stadigt temperaturfall (1 °C/min) och överför till -80 °C i 24–48 timmar, följt av överföring till -150 °C för långtidsförvaring.
OBS: Upprepad kryokonservering samt kryokonservering av tidigare NGFR+ sorterade celler har utförts, men dessa har inte bedömts tillräckligt för cellviabilitet och förmågan att bilda funktionella ALI-kulturer. Speciellt med utökad cellpassage rekommenderas det att bedöma för karyotypen eftersom detta har noterats variera i iPSCs och iPSC-härledda celler.
Representative Results
Efter detta protokoll tinades 200 000 kryokonserverade iBC (tidigare bekräftat att de hade en normal 46XY karyotyp)11 och expanderades i 3D-kultur. Fem dagar senare dissocierades de resulterande sfäroiderna, räknades och passerade igen för ytterligare expansion. Cirka 480 000 celler erhölls och suspenderades på nytt i 3D-matris (12 x 50 μL droppar, densitet 400 celler/μL). Färskt basalcellmedium applicerades var 2-3: e dag. Tio dagar senare dissocierades cellerna återigen och räknades. Totalt 19,7 x 106 celler skördades och förbereddes för FACS. 106 celler färgades med den APC-konjugerade IgG1κ isotypkontrollen och de återstående 18,7 x 106 cellerna färgades med den APC-konjugerade anti-NGFR-antikroppen i 30 minuter skyddad från ljus (figur 3).
NGFR+ gating utfördes efter jämförelse med isotypkontrollcellerna och ställdes in avsiktligt för att samla in de högst uttryckande NGFR+ cellerna (Figur 3). Med denna grindteknik var 28% av levande, enskilda celler NGFR+. Medan fler celler var tillgängliga samlades 750 000 celler in för nedströms odling. Sorterade celler återsuspenderades i Basal Cell Medium i en koncentration av 50 000 celler/100 μL. 50 000 celler såddes sedan på varje 6,5 mm porös membraninsats, som hade belagts med humant rekombinant laminin-521 (2 μg/200 μL) enligt tillverkarens riktlinjer. 500 μL basalcellsmedium tillsattes till basolateralkammaren i varje insats och plattan placerades i en 37 °C fuktad inkubator. Tre dagar senare aspirerades media i den apikala kammaren och cellerna var ~ 90% sammanflytande genom ljusmikroskopi (figur 4B). Media från basolateralkammaren aspirerades; ALI Differentiering Medium tillsattes till apikala (100 μL) och basolaterala (500 μL) kamrarna. Nästa dag aspirerades media från den apikala kammaren.
Under de följande 21 dagarna utvärderades cellerna regelbundet med ljusmikroskopi och matades med färskt ALI-differentieringsmedium (endast basolateral kammare) var 2-3: e dag. Enskilda celler var initialt lätt identifierbara (figur 4A), hade ett långsträckt och spindelformat utseende och bildade ett löst packat monolager (figur 4B). Under de följande dagarna till veckorna bildade cellerna ett tätt packat, mycket cellulärt, epitelskikt, och efter 7-10 dagar var det den tydliga uppkomsten av att slå cilia och slemproduktion. TEER av proverna beräknades och liknade primära cellkontroller (intervall från 700-1600 Ω x cm2)11. Efterföljande fixering (dag 21-28) med paraformaldehyd och immunmärkning för kanoniska luftvägsepitelcellmarkörer utfördes bland annat för MUC5AC och acetylerat α-tubulin (figur 4C). Sammantaget, med vår observation av rörliga cilia, slemproduktion samt bekräftande immunfärgning av multicilierade och sekretoriska celler som liknar den hos primära HBECs, drog vi slutsatsen att vi framgångsrikt genererade luftvägsepitelceller från inducerade pluripotenta stamceller.
Figur 1: Övergripande schema över protokoll. Kryokonserverade iBC:er tinas, expanderas och FACS renas före plätering på porösa membraninsatser, där de differentieras till ett funktionellt mucociliärt epitel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Representativa faskontrastbilder. Representativa faskontrastbilder som visar vanligt utseende av iBC i 3D-kultur efter (A) 1 dag, (B) 4 dagar, (C) 8 dagar och (D) 14 dagar (bara före NGFR-sortering). Skalstreck representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa FACS-diagram. Representativa FACS-tomter för icke-reporter och fluorescerande reporter iBC. Exempel på isotypkontroller visas och användes för att välja för de högst uttryckande NGFR+-cellerna. Fluorescerande reporterinnehållande iPSC-linjer är "trippelsorterade" för NKX2-1GFP + TP63tdTomato + NGFR + -celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder av iBC-kulturer på porösa membran. Faskontrastbilder visas (A) 1 dag och (B) 3 dagar efter plätering. Representativ immunomärkning av mucociliära kulturer som visas i (C); acetylerat-alfa tubulin (grönt) och MUC5AC (rött). Skalstreck representerar 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Mediekomponenttabell. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
HBECs är guldstandardcelltypen för att studera sjukdomar i luftvägsepitelet. På grund av deras begränsningar (inklusive tillgänglighet och svårigheter att genetiskt manipulera) har vi genererat ett protokoll för härledning av iBC och ALI-kulturer. Dessa celler kan härledas från vilken givare som helst och behålla sin unika genetiska bakgrund, vilket möjliggör grundläggande utvecklingsstudier, sjukdomsmodellering och ny terapeutisk utveckling.
Medan varje enskilt steg i det beskrivna protokollet är nödvändigt, finns det flera som förtjänar extra omnämnande. För det första, vid varje steg som kräver dissociation av sfäroider i enskilda celler, är det viktigt att undvika överdriven pipettering; enzymatisk matsmältning (med dispas eller trypsin) främjar bättre cellöverlevnad, medan överdriven pipettering leder till signifikant celldöd. För det andra, vid rening av NGFR + iBC: er är användningen av isotypkontrollen avgörande och vi rekommenderar att du väljer för de högst uttryckande NGFR + -cellerna med FACS (figur 3). Detta tillvägagångssätt resulterar i optimala ALI-kulturer med lämplig mucociliär differentiering. Slutligen är beredning och sådd av porösa membran exakt som dokumenterat i protokollet grundläggande för ALI-kulturens överlevnad. Medan vi vanligtvis sår 30 000-60 000 celler per insats, har vi haft framgång med så få som 20 000 celler. Medan framgångsrika kulturer kan genereras med hjälp av den humana embryonala stamcellskvalificerade matrisbeläggningen, har vi nyligen använt humant rekombinant laminin-521 med en signifikant högre hållbarhet hos ALI-kulturerna.
Mycket sällan kan iPSC-differentieringar misslyckas med att uppreglera en tillräcklig procentandel ngfr+ iBC. I detta fall kan seriell passaging av iBC (i 3D-kultur) resultera i en ökad NGFR-frekvens över tid. Begränsningar i detta protokoll inkluderar tid, kostnad och expertis som behövs för att generera dessa celler. Dessutom inser vi att många forskare är intresserade av de mindre vanliga celltyperna i luftvägsepitelet (t.ex. jonocyter, neuroendokrina celler). Medan vi har upptäckt några av dessa sällsynta celltyper, som i primära HBEC-kulturer, identifieras de inte reproducerbart, troligen på grund av ofullständig kunskap om de utvecklingssignaler som krävs för att generera dessa celler.
Som det är skrivet börjar ovanstående protokoll med upptining av redan kryokonserverade iBC. Detaljerna före denna kryokonservering är tidigare beskrivna och utanför ramen för detta manuskript 11,12.
Vår luftvägsepitel ALI-odlingsmetod möjliggör generering av funktionella luftvägsepitelceller från nästan vilken givare som helst. Detta ökar kraftigt tillgängligheten till värdefulla genetiskt kontrollerade luftvägsepitelceller som kan användas för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening, framtida cellbaserade terapier, samt för att förbättra förståelsen för utvecklingsmönstret i luftvägsepitelet.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna i laboratorierna Hawkins, Kotton och Davis för deras hjälpsamma bidrag genom åren angående detta och andra projekt. Vi står också i tacksamhetsskuld till Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) för hans engagemang och tekniska expertis, och vi är tacksamma mot Greg Miller och Marianne James från Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) för deras support och tekniska expertis inom underhåll och karakterisering av patientspecifika iPSCs, med stöd av NIH-bidrag NO1 75N92020C00005 och U01TR001810. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 och R01HL095993 till D.N.K, R01HL139876 till B.R.D, R01 HL139799 till F.H. och Cystic Fibrosis Foundation (CFF) beviljar CFF 00987G220 och CFF WANG20GO till D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 till B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 till S.S, CFF BERICA2010 till AB, och CFF HAWKIN20XX2 till F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
