Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Zusammenfassung

Entomopathogene Nematoden leben in Symbiose mit Bakterien und zusammen infizieren sie erfolgreich Insekten, indem sie ihr angeborenes Immunsystem untergraben. Um die Erforschung der genetischen Grundlagen der Nematodeninfektion zu fördern, werden Methoden zur Erhaltung und genetischen Manipulation entomopathogener Nematoden beschrieben.

Zusammenfassung

Entomopathogene Nematoden der Gattungen Heterorhabditis und Steinernema sind obligate Parasiten von Insekten, die im Boden leben. Das Hauptmerkmal ihres Lebenszyklus ist die mutualistische Assoziation mit den Bakterien Photorhabdus bzw. Xenorhabdus. Die Nematodenparasiten sind in der Lage, geeignete Insektenwirte zu lokalisieren und in sie einzudringen, die Immunantwort der Insekten zu untergraben und sich effizient zu vermehren, um die nächste Generation zu produzieren, die aktiv neue Insektenbeute jagen wird, um sie zu infizieren. Aufgrund der Eigenschaften ihres Lebenszyklus sind entomopathogene Nematoden beliebte biologische Bekämpfungsmittel, die in Kombination mit Insektiziden zur Bekämpfung zerstörerischer landwirtschaftlicher Insektenschädlinge eingesetzt werden. Gleichzeitig stellen diese parasitären Nematoden ein Forschungsinstrument zur Analyse der Nematodenpathogenität und der Anti-Nematoden-Reaktionen dar. Diese Forschung wird durch die jüngste Entwicklung genetischer Techniken und transkriptomischer Ansätze zum Verständnis der Rolle von Nematoden-sezernierten Molekülen während der Infektion unterstützt. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Aufrechterhaltung entomopathogener Nematoden und zur Verwendung eines Gen-Knockdown-Verfahrens bereitgestellt. Diese Methoden fördern die funktionelle Charakterisierung entomopathogener Nematodeninfektionsfaktoren.

Einleitung

Die Forschung an entomopathogenen Nematoden (EPN) hat sich in den letzten Jahren vor allem aufgrund des Nutzens dieser Parasiten in integrierten Schädlingsbekämpfungsstrategien und ihrer Beteiligung an der biomedizinischen Grundlagenforschung^{intensiviert 1,2}. Neuere Studien haben EPN als Modellorganismen etabliert, in denen die genetischen Komponenten des Fadenwurms untersucht werden können, die in den verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses aktiviert werden. Diese Informationen liefern wichtige Hinweise auf die Art und Anzahl der Moleküle, die von den Parasiten abgesondert werden, um die Physiologie des Wirts zu verändern und die angeborene Immunantwort des Insekts zu destabilisieren ^3,4. Gleichzeitig wird dieses Wissen häufig durch neue Details über die Art der Immunsignalwege des Insektenwirts und die Funktionen, die sie regulieren, um den Eintritt und die Ausbreitung der Krankheitserreger einzuschränken, ergänzt ^5,6. Das Verständnis dieser Prozesse ist entscheidend, um sich beide Seiten des dynamischen Zusammenspiels zwischen EPN und ihren Insektenwirten vorzustellen. Eine bessere Wertschätzung der EPN-Insekten-Wirtsbeziehung wird zweifellos ähnliche Studien mit parasitären Nematoden von Säugetieren ermöglichen, die zur Identifizierung und Charakterisierung von Infektionsfaktoren führen können, die das menschliche Immunsystem stören.

Die EPN-Nematoden Heterorhabditis sp. und Steinernema sp. können eine Vielzahl von Insekten infizieren, und ihre Biologie wurde zuvor intensiv untersucht. Die beiden Nematodenparasiten unterscheiden sich in ihrer Fortpflanzungsweise, wobei Heterorhabditis selbstbefruchtet wird und Steinernema eine amphimiktische Fortpflanzung durchläuft, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass sich S. hermaphroditum durch Selbstbefruchtung von Hermaphroditen oder durch Parthenogenese^fortpflanzt 7,8,9. Ein weiterer Unterschied zwischen Heterorhabditis und Steinernema-Nematoden ist ihr symbiotischer Mutualismus mit zwei verschiedenen Gattungen gramnegativer Bakterien, Photorhabdus bzw. Xenorhabdus, die beide starke Krankheitserreger von Insekten sind. Diese Bakterien befinden sich im frei lebenden und nicht fütternden infektiösen Jungtierstadium (IJ) des EPN, das anfällige Wirte erkennt, Zugang zum Insektenhämocoel erhält, wo sie ihre assoziierten Bakterien freisetzen, die sich schnell replizieren, und Insektengewebe besiedeln. Sowohl das EPN als auch ihre Bakterien produzieren Virulenzfaktoren, die die Insektenabwehr entwaffnen und die Homöostase beeinträchtigen. Nach dem Insektentod entwickeln sich die Nematoden-IJs zu erwachsenen EPN und vervollständigen ihren Lebenszyklus. Eine neue Kohorte von IJs, die als Reaktion auf Nahrungsentzug und Überfüllung innerhalb des Insektenkadavers gebildet wurde, taucht schließlich im Boden auf, um geeignete Wirte^zu jagen 9,10,11,12.

Hier wird ein effizientes Protokoll zur Erhaltung, Verstärkung und genetischen Manipulation von EPN-Nematoden beschrieben. Insbesondere beschreibt das Protokoll die Replikation von symbiotischen H. bacteriophora und S. carpocapsae IJs, die Erzeugung von axenischen Nematoden-IJs, die Produktion von H. bacteriophora Hermaphroditen für die Mikroinjektion, die Herstellung der dsRNA und die Mikroinjektionstechnik. Diese Methoden sind essentiell für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Nematodenpathogenität und der Anti-Nematoden-Immunität des Wirts.

Protokoll

1. Produktion von symbiotischen Nematoden-infektiösen Jungtieren

1. Eine Petrischale (10 cm) mit einem Stück Filterpapier abdecken und ca. 10-15 Galleria mellonella-Larven hinzufügen (Abbildung 1A).
2. Geben Sie mit einer Pipette 2 ml Wasser mit etwa 25-50 IJs pro 10 μL Suspension auf die Wachswürmer ab. Lagern Sie die Petrischale in einem Cabinet bei Raumtemperatur.
3. Abhängig von der Feuchtigkeit des Filterpapiers fügen Sie alle 2 Tage 1-2 ml Wasser hinzu. Wachswürmer, die mit IJs infiziert sind, sterben normalerweise innerhalb von 48 h ab.
4. Bereiten Sie Whites Wasserfallen etwa 10 Tage nach der Infektion der Wachswürmer mit den IJs⁸ vor (Abbildung 1B, C). Legen Sie die toten Insekten vorsichtig auf den undurchnässten Teil des Filterpapiers. Verwenden Sie Leitungswasser, um die untere Petrischale zu füllen, und legen Sie eine Kappe aus einem 15-ml-Schlauch als Abstandshalter für die Belüftung.
5. Übertragen Sie die weichen und zerbrechlichen Wachswürmer vorsichtig, indem Sie sie mit einer Kunststoffpinzette langsam aus dem Filterpapier heben. Verwenden Sie Leitungswasser anstelle von demineralisiertem oder deionisiertem Wasser. Letztere verursachen Nematodenaggregation.
   1. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand in der Wasserfalle etwa die Hälfte der Höhe der Petrischale erreicht. Erwarten Sie, dass sich der Wasserstand im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von den Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen im Raum ändert.
6. Wenn das Wasser in der kleinen Petrischale durch das Vorhandensein von Nematoden trüber wird, verwenden Sie eine Pipette, um die neue Generation von IJs in einen T25- oder T75-Zellkulturkolben zu bringen.
7. Fügen Sie Leitungswasser bis zu etwa 40% des Volumens hinzu, bis die entsprechende Dichte erreicht ist (Abbildung 1C). Vermeiden Sie eine Verstopfung des Fadenwurms und lagern Sie die Zellkulturkolben horizontal.
8. Geben Sie mehr Wasser in die untere Petrischale und wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7, bis IJs in etwa 3-5 Tagen nicht mehr aus den Insektenkadavern austreten.

2. Produktion von axenischen Nematoden-infektiösen Jungtieren

HINWEIS: Axenische Nematoden werden verwendet, weil nach der Dissoziierung des Nematoden-Bakterien-Komplexes im Insekt jeder mutualistische Partner eine eigene Immunantwort des Wirts auslöst⁵. Der mutierte Stamm Ret16 von Photorhabdus temperata wird verwendet, weil diese Bakterien das Wachstum von H. bacteriophora unterstützen, aber den Nematodendarm^13,14 nicht besiedeln^.

1. Heterorhabditis bacteriophora infektiöse Jungtiere
   1. Mit einer sterilen Pipettenspitze oder einem Spachtel mehrere Flocken einer gefrorenen Kultur von P. temperata Ret16 auf eine MacConkey-Platte kratzen und für einzelne Kolonien streichen. Inkubieren Sie die Platte für 2-3 Tage bei 28 °C.
   2. Beimpfen Sie 10 ml LB-Brühe mit einer Kolonie in einem 50-ml-Röhrchen und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 ° C in einem Schüttelinkubator. Verwenden Sie nur die primären Phasenkolonien, die auf MacConkey-Agar rot sind. Die Kolonien der sekundären Phase werden auf MacConkey-Agar cremefarben sein.
   3. Waschen Sie 100 μL Übernachtkultur mit 900 μL 1x PBS durch Zentrifugieren in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.900 x g. Dekantieren Sie den Überstand. Verdünnen Sie die Kultur 10x in 1x PBS. Lassen Sie die Röhre auf Eis.
   4. Tauchen Sie die Wachswürmer in eine 70% ige Ethanollösung, trocknen Sie die Insekten mit einem Papiertuch und legen Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen.
   5. Legen Sie die Röhre für 20 Minuten auf Eis, um die Wachswürmer zu immobilisieren.
   6. Verwenden Sie ein Filterpapier, um die obere und untere Hälfte einer Petrischale (10 cm) abzudecken. Verwenden Sie den mit Filterpapier überzogenen Petrischalendeckel als Basisstütze für die Injektion. Befeuchten Sie das Filterpapier der unteren Petrischale und übertragen Sie es auf Eis, damit sich die injizierten Wachswürmer erholen können.
   7. Pipettieren Sie 50 μL eiskalte Bakterien auf ein Stück Parafilm und bereiten Sie die 22 G Nadelspritze vor. Drücken Sie den Kolben vorsichtig, um die Luft an der Spitze der Nadel zu entfernen.
   8. Halten Sie einen Wachswurm nahe am hinteren Ende unter dem Stereoskop (Abbildung 2).
   9. Injizieren Sie 50 μL der Bakterienkultur in die dorsale Seite des Thorax, vorzugsweise an der Verbindung zwischen zwei Segmenten. Um innere Schäden zu minimieren, injizieren Sie direkt unter die Nagelhaut, so parallel wie möglich zum Wachswurm. Es ist natürlich, dass ein Hämolymptröpfchen ausblutet, wenn der Wachswurm durchbohrt wird
   10. Übertragen Sie die injizierten Insekten in die Wiederherstellungs-Petrischale.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.7-2.1.9, bis alle Insekten mit den Bakterien injiziert wurden. Um die Insekten zu betäuben, legen Sie sie für 5 Minuten auf Eis.
   12. Stellen Sie die Petrischale ins Dunkel (z. B. Schublade oder Schrank) und geben Sie Leitungswasser auf das Filterpapier, wenn es trocken erscheint. Wachswürmer erliegen 2 Tage nach der Injektion und erscheinen nach etwa 3-4 Tagen ziegelrot. Wenn die Insekten braun erscheinen, war die bakterielle Infektion erfolglos.
   13. Übertragen Sie die Insekten mit der charakteristischen ziegelroten Farbe 7 Tage nach der Infektion auf eine mit frischem Filterpapier ausgekleidete Petrischale und fahren Sie mit "Produktion symbiotischer Nematoden-infektiöser Jungtiere" aus Schritt 1 fort. Wenn Sie symbiotische Nematoden verwenden, wiederholen Sie den Vorgang aus Schritt 2.1. mit den neu produzierten IJs aus der ersten Runde.
   14. Oberflächensterilisierende H. bakteriophora IJs
       1. Sammeln Sie ausreichend symbiotische H. bakteriophora und geeignete axenische IJs durch Zentrifugation, um ein 100-μL-Pellet in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen.
       2. 500 μL 5% Bleichmittel in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben und umkehren. 10 min inkubieren Zentrifuge bei 17.900 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
       3. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml sterilem Wasser und wiederholen Sie die Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt vier weitere Male.
   15. Überprüfen der Axenizität
       1. Pipette 400 μL steriles Wasser an die gewaschenen symbiotischen und kandidatenaxenischen H. bacteriophora Nematoden.
       2. Legen Sie die Nematoden über die Insekten in die Petrischale und kennzeichnen Sie die Behandlungen entsprechend.
       3. Stellen Sie die Petrischalen mit den infizierten Insekten ins Dunkel und überprüfen Sie regelmäßig, ob die Wachswürmer rot werden.
          HINWEIS: Wachswürmer, die mit H. bacteriophora symbiotischen Nematoden infiziert sind, werden innerhalb von 2 Tagen nach der Infektion rot. Die Verfärbung des Wachswurms ist auf die Sekretion verschiedener Verbindungen zurückzuführen, die von mutualistischen Photorhabdus-Bakterien während des Infektionsprozesses produziert werden. Der Mangel an roter Farbe in den infizierten Wachswürmern 4 Tage nach der Infektion bestätigt, dass die H. bakteriophora axenisch sind. Dies liegt daran , dass P. temperata Ret16-Bakterien im Nematodendarm nicht vorhanden sind.
   16. Alternative Methode zur Überprüfung der Axenizität
       1. Oberflächensterilisierende symbiotische H. bakteriophora IJs und kandidatenaxenische H. bakteriophora IJs, wie in Schritt 2.1.14 beschrieben.
       2. Homogenisieren Sie ca. 500 IJs in 500 μL sterilem 1x PBS in Mikrofugenröhrchen mit sterilen Stößeln. Drehen Sie das Homogenat nach unten, dekantieren Sie den Überstand und verteilen Sie ihn auf LB-Agar. Inkubieren Sie die Platten bei 28 °C für 24 h.
       3. Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (CFU) für jede Platte. Proben von axenischen H. bacteriophora bilden keine Kolonien der symbiotischen P. luminescens-Bakterien.
2. Steinernema carpocapsae Infektiöse Jungtiere
   1. Herstellung von Lipidagarplatten (300 ml Lösung ergeben ca. 20 gespaltene Platten)
      1. Wiegen Sie 2,4 g Nährstoffbrühe, 4,5 g Hefeextrakt und 1,5 g Agar und fügen Sie sie zu 267 ml entionisiertem Wasser hinzu. Autoklavieren Sie die Lösung.
      2. Fügen Sie 3 ml 1 M MgCl 2,_1,2 ml Maisöl und 28,8 ml 7% Maissirup hinzu.
      3. Bereiten Sie 300 μL 30 mg/ml Kanamycin und 300 μL 50 mg/ml Ampicillin (sterilisiert mit 0,2 μm-Filter) vor und fügen Sie sie der Lösung hinzu.
      4. Dekantieren Sie die Mischung auf eine Hälfte einer geteilten Petrischale/geteilten Platte.
   2. Herstellung von X. nematophila (Stamm ΔrpoS) Bakterienrasen
      1. Kultur X. nematophila (Xn) ΔrpoS direkt aus einem gefrorenen Bakterienbestand 2 ml LB/kan/amp-Lösung auf einem Shaker bei 30 °C über Nacht.
      2. Beimpfen Sie 5 ml LB-Medium mit 30 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Ampicillin mit 250 μL der Übernachtkultur und züchten Sie die Bakterien über Nacht auf einem Shaker.
         HINWEIS: Xn-Bakterien wachsen nicht gut, wenn sie direkt auf Selektionslipid-Agar-Medien aus einer gefrorenen Brühe gestreift werden. Bei Bedarf kann die primäre und sekundäre Phase Xn zunächst auf NBTA-Medien (Nährstoffagar mit 25 mg Bromthymolblau l−1 und 40 mg Triphenyltetrazoliumchlorid l⁻¹⁾ bestätigt werden, bevor eine frische Flüssigkultur beginnt.
      3. 100 μL der Kultur auf die Lipidagarplatten pipettieren und mit einer sterilen Impfschleife auf der gesamten Platte verteilen. Inkubieren Sie die Platten für 24 h bei 30 °C.
   3. Oberflächensterilisierende S. carpocapsae IJs
      1. Lassen Sie einen Kolben mit IJs in einem Winkel stehen, so dass die IJs in eine Ecke des Kolbens sinken. 1 ml der abgesetzten IJs in ein Mikrozentrifugenröhrchen abpumpen. Zentrifuge bei 17.900 x g für 10 s. Entfernen Sie den Überstand.
      2. Fügen Sie 1 ml 1% frisch zubereitete Bleichlösung hinzu. Invertieren Sie Rohre, um gründlich zu mischen. Inkubation für 1 min (längere Bleichmittelinkubation führt zum IJ-Tod). Drehen Sie erneut für 10 s. Entfernen Sie den Überstand.
      3. Um Bleichmittelrückstände zu entfernen, waschen Sie die Nematoden mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie für 10 s. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche vier weitere Male.
      4. Schätzen Sie die IJ-Anzahl pro ml, indem Sie 10-20 μL der gewaschenen IJs unter dem Stereoskop zählen und die Konzentration der IJs entsprechend anpassen.
   4. Aufzucht von S. carpocapsae IJs
      1. Transfer mit einer Pipette um 1000 IJs auf die Lipidagar-gespaltenen Platten (Abbildung 3, linkes Bild). Legen Sie die Platten in einen befeuchteten Schrank oder eine Schublade. Verwenden Sie feuchte Papiertücher, um die Feuchtigkeit zu erhöhen. Halten Sie die Platten bei Raumtemperatur (22-25 °C).
      2. Überprüfen Sie die Papierhandtücher jeden zweiten Tag, um sicherzustellen, dass sie feucht bleiben. Falls erforderlich, fügen Sie den Papiertüchern jeden zweiten Tag Wasser hinzu, um die Feuchtigkeit im Schrank oder in der Schublade aufrechtzuerhalten. Alternativ platzieren Sie ein Wasserbad am Boden des Schranks, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen.
      3. Wenn nur IJs auftreten, fügen Sie Wasser auf die andere Seite der Platte hinzu und legen Sie eine Schicht Filterpapier über die Mitte der Platte (Wasserfalle, Abbildung 3, rechtes Bild). Sammeln Sie dieses Wasser mit den IJs der ersten Runde in einem T75-Zellkulturkolben. Dies sind die Round I S. carpocapsae Nematoden.
      4. Erneut mit Bleichmittel (Schritt 2.2.3) sterilisieren und den Vorgang aus Schritt 2.2 mit den Nematoden Round 1 S. carpocapsae wiederholen. Das Ergebnis wird Round 2 S. carpocapsae Nematoden sein.
      5. Überprüfen Sie alle paar Tage unter einem Stereoskop, um die Entwicklung der Nematoden zu verfolgen.
   5. Überprüfung des axenischen Zustands von S. carpocapsae IJs
      1. Die IJs der Runde 1, der Runde 2 und der symbiotischen S. carpocapsae werden mit Bleichmittel auf der Oberfläche sterilisiert, wie in Schritt 2.2.3 beschrieben.
      2. Homogenisieren Sie ca. 400-700 IJs in Mikrofugenröhrchen mit sterilen Kunststoffstößeln. Das Homogenat zentrifugieren, den Überstand dekantieren und die Lösung auf LB-Agarplatten verteilen. Halten Sie die Agarplatten in einem Inkubator-Set bei 28 °C für 24 h.
      3. Zählen Sie die Bildung von CFU für jede Platte. Proben von axenischen Nematoden erzeugen kein Bakterienwachstum.
   6. Überprüfung des axenischen Zustands von S. carpocapsae IJs mittels PCR
      1. Die IJs der Runde 1, der Runde 2 und der symbiotischen S. carpocapsae werden mit Bleichmittel auf der Oberfläche sterilisiert, wie in Schritt 2.2.3 beschrieben.
      2. Extrahieren Sie DNA aus dem Homogenat. Ein detailliertes Extraktionsverfahren wird in Abschnitt 4.1.2 unten beschrieben.
      3. Durchführung der PCR mit den XptA2-Grundierungen bei einer Glühtemperatur von 61 °C:
         XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
         XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGGGCACTCC-3′.
         HINWEIS: Diese Primer verstärken das insektizide Gen XptA2 von X. nematophila und produzieren ein Amplikon von 231 bp. Das Radfahrprogramm war wie folgt: 95 °C für 2 min, 34 Zyklen à 95 °C für 30 s, Glühtemperatur von 61 °C für 1 min und 73 °C für 1 min, gefolgt von 72 °C für 10 min.
      4. Visualisieren Sie die verstärkten Fragmente durch Trennung in einem 1,5% igen Agarosegel. Axenische oberflächensterilisierte Proben bilden keine Bänder.

3. Erhöhung von H. bacteriophora Hermaphroditen für die Mikroinjektion

1. Bereiten Sie 6 cm Petrischale Teller mit NA + chol (1,5x Nährbrühe, 1,5% Agar und 10 μg / ml Cholesterin) vor.
2. Bereiten Sie 3 ml PP3-Lösung (2% Protease Pepton #3, PP3) in einem 10 ml Kulturröhrchen vor.
3. Verwenden Sie eine sterile 20-μL-Spitze, um die Oberseite des P. luminescens-Glycerinvorrats (25% vol / vol steriles Glycerin), das bei -80 ° C gehalten wird, zu kratzen und in das Kulturrohr fallen zu lassen.
4. Inkubieren Sie das Rohr über Nacht in einem temperaturgesteuerten Shaker-Set bei 28 °C, 200 U/min.
5. Am nächsten Tag wird die Kultur hellrot gefärbt. Platte 50 μL der Kultur auf eine 6 cm NA+chol Petrischale und verteilen Sie sie mit einem Bakterienstreuer kreisförmig.
6. Legen Sie die Platten in einen 28 °C Inkubator. Der P. luminescens Rasen wird in 24-36 h fertig sein und hellrot erscheinen.
7. Beimpfen Sie die Platte mit 50-100 oberflächensterilisierten IJs und halten Sie die Platte bei 28 °C.
8. Gesunder L4-Hermaphrodit beginnt etwa 48-54 h nach der Impfung zu erscheinen. Gesunde, nicht ausgehungerte späte L4 H. Bacteriophora Hermaphroditen sind für die Injektion erforderlich.

4. Präparation von dsRNA

1. Primer-Design
   1. Design-Primer für dsRNA, um ~ 500 Basenpaar-Exon-Regionen von H. bakteriophora DNA anzusprechen.
      1. Primer für Regionen von Interesse können mit Primer3 (https://primer3.ut.ee) oder einem ähnlichen Programm bestimmt werden, wobei eine optimale Produktlänge von 500 Basenpaaren, Tm von 60 °C und eine Primerlänge von 22 Nukleotiden ausgewählt werden.
      2. Fügen Sie eine T7-Site (TAATACGACTCACTATAGGG) an den 5'-Enden jedes Vorwärtsprimers hinzu, um eine In-vitro-Transkription zu ermöglichen.
2. Genomische DNA-Isolierung
   1. Verwenden Sie genomische DNA, die aus gefrorenen Pellets von ~ 50.000 H. bakteriophora IJs für die dsRNA-Synthese isoliert wurde.
   2. Verwenden Sie ein IJ-Pellet, das in 50 μL Lysepuffer (50 mM KCl, 0,05% (w/v) Gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/ml Proteinase K, 2,5 mM MgCl₂) bei −80 °C für mindestens 30 min resuspendiert wird.
   3. Homogenisieren Sie das Pellet mit einem kleinen Schlauchstößel.
   4. Die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und bei 60 °C für 2 h inkubieren, alle 15 Minuten vorwirbeln.
   5. Denaturierung der Proteinase K durch Inkubation des homogenisierten Gewebes für 15 min bei 95 °C.
   6. Die Probe wird auf 4 °C abgekühlt und 1 min bei 3.400 x g zentrifugiert.
   7. Verwenden Sie den resultierenden Überstand als Vorlage für eine nachfolgende PCR.
   8. Richten Sie eine 50-μL-PCR-Reaktion unter Verwendung eines kommerziellen Mastermixes mit 200 ng Template-DNA, 0,2 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und den vom Hersteller vorgeschlagenen Zyklusbedingungen ein.
   9. Analysieren Sie die PCR-Reaktion auf einem 1,2% igen Agarosegel, um zu überprüfen, ob die Reaktionen einzelne Banden der vorhergesagten Größe erzeugt haben.
3. dsRNA-Synthese
   1. Verwenden Sie ein kommerzielles Transkriptionskit.
   2. Verwenden Sie eine 5-μL-PCR-Reaktion für die In-vitro-Transkription. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
   3. Inkubieren Sie die Reaktion für 16 h bei 37 °C.
   4. Reinigen Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktionen mit einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Ammoniumacetat / Ethanolfällung, um die dsRNA zu konzentrieren.
   5. Sususpendieren Sie die pelletierte dsRNA in 10 μL RNase-freiem Wasser.
   6. Quantifizieren Sie die RNA mit einem Spektralphotometer.
   7. Beurteilung der Qualität durch Trennung der dsRNA auf einem 1,2% igen Agarosegel

5. Mikroinjektion

HINWEIS: Ein Injektionspad ist ein Glasdecker mit einer Schicht von 2% (w / v) Agarose in der Mitte. Wenn die zu injizierenden Würmer auf diese Pads übertragen werden, immobilisiert die Agaroseschicht sie für das Verfahren. Normalerweise werden zusätzliche Pads für den allgemeinen Gebrauch in der Nähe des Mikroskops aufbewahrt.

1. Vorbereitung des Injektionspads
   1. Kochen Sie 2% Agarose in Wasser, indem Sie 0,2 g Agarose zu 10 ml Wasser hinzufügen.
   2. Legen Sie 1-4 Tropfen (~ 50 μL) auf die Mitte eines 50 mm x 70 mm dünnen Glasabdeckungs.
   3. Verwenden Sie einen anderen Deckglas, um den Tropfen abzuflachen.
   4. Lassen Sie den Deckglas 2-3 min trocknen, bevor Sie den Deckglas seitlich abschieben.
   5. Markieren Sie mit einem "R" die rechte Seite des nach oben gerichteten Deckglases.
   6. Lassen Sie die Dias 1 Tag lang bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie sie verwenden.
2. Herstellung von Injektionsnadeln
   1. Verwenden Sie 1,0 mm Glaskapillaren, die ein internes feines Filament enthalten. Dies ermöglicht eine effiziente Befüllung der Nadel.
      HINWEIS: Jeder handelsübliche Nadelzieher (z. B. Narishige PB-7) kann verwendet werden.
   2. Schalten Sie den Nadelzieher ein.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Heizung auf max eingestellt ist und die Magnetspule auf 8,40 eingestellt ist, um die erforderliche Nadelschärfe und die richtige Länge sicherzustellen.
   4. Führen Sie das Kapillarrohr durch das Filament in den oberen Knopfkamm ein und ziehen Sie den oberen Knopf fest. Die Oberseite des Kapillarrohrs befindet sich auf gleicher Höhe mit der Oberseite des Nadelziehers und das Heizfilament befindet sich in der Mitte der Kapillare.
   5. Bewegen Sie die untere Einheit nach oben und ziehen Sie dann den unteren Knopf fest. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare sicher platziert ist.
   6. Schließen Sie die Abdeckung des Nadelziehers und drücken Sie Start. Das grüne Licht leuchtet auf. Nach einigen Minuten wird die Kapillare erhitzt und auseinandergezogen, um sich in zwei Hälften zu trennen.
      HINWEIS: Die beiden getrennten Nadeln haben nicht die gleiche Länge, aber sie können beide für die Injektionen verwendet werden. Längere Nadelpunkte werden bevorzugt.
   7. Ordnen Sie die Nadeln in einer vertikalen Position mit ihren Punkten nach unten an, indem Sie ein Stück Modelliermasse verwenden. Alternativ können Sie die Nadeln in einer Petrischale aufbewahren, die von zwei Streifen Modelliermasse gehalten wird.
3. Einlegen der Nadel
   HINWEIS: Die Nukleinsäurelösung muss mindestens 10 min bei 20.784 x g zentrifugiert werden, um Verunreinigungen zu pelletieren, die in der Suspension vorhanden sein können. Die Zentrifugation der Verunreinigungen verhindert, dass sie den Fluss der Injektionsnadel blockieren.
   1. Verwenden Sie eine der beiden Methoden, um Nukleinsäuren in die Nadeln zu laden.
   2. Methode 1
      1. Verwenden Sie eine Pipette, um etwa 0,5 μl der zentrifugierten DNA-Probe an das ungezogene Ende der Injektionsnadel zu übertragen. Dies erscheint als ein winziger Tropfen Flüssigkeit, der auf dem Kapillarrohr sitzt.
      2. Stellen Sie 5 bis 7 Minuten zur Verfügung, damit die flüssige Probe das Ende der Nadel einnehmen kann. Das Endprodukt ist eine gefüllte Nadel ohne Luftblasen.
      3. Verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop, um das Vorhandensein von Lösung in der Nadelspitze vor der Injektion zu bestätigen.
   3. Methode 2
      1. Verwenden Sie Ladespitzen für den Mikroinjektor.
      2. Mit dieser Belastungsspitze pipettieren Sie 5 μL der Nukleinsäurelösung.
      3. Während sich die gezogene Nadel am Nadelzieher befindet, lösen Sie den oberen Knopf, bewegen Sie die obere gezogene Nadel leicht nach oben und ziehen Sie den Knopf wieder fest.
      4. Führen Sie die Spitze des Laders vorsichtig in das Kapillarrohr ein und verlängern Sie es bis zur Unterseite der Injektionsnadel.
      5. Die Nukleinsäurelösung in die Injektionsnadel pipettieren.
      6. Entfernen Sie den Lader von der gezogenen Nadel und halten Sie ihn bei Bedarf für das weitere Laden getrennt. Achten Sie darauf, Lader auszuschalten, wenn Sie ein anderes Nukleinsäuregemisch laden.
4. Vorbereitung des Injektionsmikroskops
   HINWEIS: Ein inverses Mikroskop mit diffuser Beleuchtung von der Mikroskopbasis wird für die Vorbereitung, Mikroinjektion und Wiederherstellung von Würmern verwendet. Die Verwendung eines hochauflösenden inversen Mikroskops mit 10x- und 40x-Objektiven wird beschrieben. Das Mikroskop ist mit einem Nadelmanipulator ausgestattet, der die Nadel hält und für die Injektion in Position bringt. Mikroinjektionsöl wird verwendet, um zu verhindern, dass der Wurm auf der Agaroseschicht des Injektionskissens schnell austrocknet. Das empfohlene Öl ist Halocarbon Oil 700.
   1. Schalten Sie die Lampe ein und kalibrieren Sie die Helligkeit mit dem Bedienfeld.
   2. Überprüfen Sie die Nummer auf dem Kondensator-Wollaston-Prisma; Es entspricht dem verwendeten Ziel (40x).
   3. Vergewissern Sie sich, dass sich der mit "DIC" gekennzeichnete DIC-Turm an der richtigen Position befindet.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Knopf am Ziel auf Null (0) eingestellt ist.
   5. Drehen Sie den Ph-Ring bis zum Ende nach rechts.
   6. Stellen Sie den Polarisator so ein, dass sich der Pfeil in horizontaler Position befindet.
   7. Legen Sie ein Blatt Papier auf die Bühne, um den Brennpunkt (Licht) zu beobachten.
   8. Schließen Sie die Feldmembran bis zu dem Punkt, an dem sich eine Stelle auf dem Papier befindet.
   9. Verwenden Sie das Zifferblatt auf der linken Seite, um den Kondensator so weit nach oben und unten zu bewegen, dass ein sehr scharfer Lichtfleck auf dem Stück Papier zu sehen ist.
   10. Öffnen Sie die Feldmembran langsam bis zu dem Punkt, an dem ein kleiner Lichtkreis sichtbar ist.
   11. Nimm das Stück Papier weg.
   12. Stellen Sie sicher, dass sich der Lichtfleck in der Mitte des Objektivs befindet. Andernfalls richten Sie den Lichtfleck mit der Mitte des Objektivs aus, indem Sie die silbernen Schrauben an der Oberseite des Kondensators einstellen.
   13. Öffnen Sie die Feldmembran vollständig.
   14. Überprüfen Sie, ob der Analysator ICT/P eingedrückt ist.
5. Montage der Injektionsnadel am Mikroskop
   1. Schalten Sie den Stickstoffgasfluss zur Mikroinjektionsnadel ein. Der Gasdruck auf die Nadel beträgt ca. 20 psi.
   2. Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatorknöpfe (der Teil des Mikroskops, der die Nadel bewegt) in der Mitte positioniert sind, was den größten Bewegungsumfang ermöglicht, wenn die Nadel montiert ist.
   3. Schrauben Sie die Baugruppe ab, in der sich die Metallstange befindet, um sie aus dem Nadelhalter zu entfernen.
   4. Führen Sie die neue Nadel in den oberen Teil des Mikroskops ein; Installieren Sie dann die Gummidichtung, um die Nadel in Position zu halten.
   5. Sichern Sie den unteren Teil des Nadelhalters, indem Sie ihn an der Baugruppe befestigen.
   6. Stecken Sie die Nadel in die Nut des Mikromanipulators und schrauben Sie sie richtig an, um sie stabil zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die Schraube etwa 1 Zoll vom Ende des Mikromanipulators entfernt befindet.
   7. Platzieren Sie die Nadelspitze in der Mitte des Gesichtsfeldes in einem Winkel von etwa 45° in Bezug auf die Bühnenplatte, wobei Sie die Knöpfe und groben Bedienelemente des Mikromanipulators verwenden. Es ist wichtig, die Nadelspitze hoch genug zu lassen, damit sie nicht versehentlich bricht.
6. Die Nadeln brechen
   1. Legen Sie die Nadel in den Mikromanipulator, wo die Nadelspitze normalerweise bricht, damit die Nukleinsäurelösung durch sie hindurchfließen kann.
   2. Brechen Sie eine Kapillare und legen Sie sie auf einen Glasobjektträger, der einen Tropfen Mikroinjektionsöl trägt.
   3. Legen Sie den Objektträger auf das Mikroskop und fokussieren Sie.
   4. Bringen Sie die Nadelspitze mit den feinen Bedienelementen des Mikroskops auf die gleiche Höhe wie die Kapillarseite (Abbildung 4).
   5. Schalten Sie den Stickstofffluss kurz mit dem Fußantrieb ein, um zu bestätigen, dass die Nadelspitze nicht gebrochen ist. Ein schnelles Einschalten genügt.
   6. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig, so dass sie die Seite der Kapillare kaum berührt.
   7. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Mikroskops, um die Nadelspitze zu brechen.
   8. Entfernen Sie die Nadel aus der Kapillare und schalten Sie den Stickstofffluss ein, um zu überprüfen, ob die Nadel richtig gebrochen ist.
   9. Die Nadel erzeugt einen kleinen Injektionstropfen, der etwa fünfmal größer ist als die Nadelspitze (Abbildung 4). Wenn der Injektionstropfen kleiner ist, brechen Sie die Spitze weiter. Wenn der Injektionströpfchen größer ist, versuchen Sie, eine frische Nadel zu verwenden.

6. Mikroinjektion

1. Pipette einen Tropfen Mikroinjektionsöl auf ein Injektionspad.
2. Tauchen Sie einen flammensterilisierten Meißel in den Mikroinjektionsöltropfen und sammeln Sie ein junges H. Bacteriophora adulter Nematode von der Platte.
3. Wählen Sie die Nematoden aus Teilen der Platte, die sich nicht in der Nähe des Bakterienrasens befinden, um den Transfer einer großen Anzahl von Bakterienzellen auf das Injektionskissen zu verhindern. Ernten Sie auch einen Nematoden mit wohlgeformten Gonaden.
4. Bewegen Sie die Nematoden zum Injektionspad und positionieren Sie sie vertikal, so dass die Gonaden der Nadel zugewandt sind. Stellen Sie sicher, dass die Vulva in die gleiche Richtung wie die Injektionsnadel zeigt und die beiden distalen Gonadenarme in die entgegengesetzte Richtung und gegen die Nematodenkörperwand gerichtet sind.
   HINWEIS: Wie Pristionchus pacificus wandert die Gonade von H. bacteriophora dorsal von der ventralen Vulvaposition und wandert dann zurück in die ventrale Position.
5. Überprüfen Sie, ob die Ölmenge ausreicht, um eine Austrocknung des Fadenwurms zu verhindern, ohne dass der Fadenwurm herumwandern kann.
6. Bringen Sie den Fadenwurm mit dem 10-fachen Objektiv in den Fokus, indem Sie die Nadel weit über den Objektträger halten. Im Öl werden die Nematodengonaden als zwei klare Regionen in der Nähe des Vorder- und Hinterteils des Wurms angesehen. Stellen Sie sicher, dass die Gonaden im Fokus sind und nicht die anderen Teile des Wurms.
7. Ordnen Sie den Fadenwurm in einem Winkel von 15 ° bis 45 ° zur Injektionsnadel an, wodurch der Nadel in der Gonade mehr Platz gegeben wird. Dieser Ansatz verhindert auch, dass die Nadel den gesamten Nematodenkörper durchläuft, wenn die Nadel in die Gonade eingeführt wird.
8. Positionieren Sie die Injektionsnadel und den Fadenwurm auf dem gleichen Niveau, indem Sie die Nadel schrittweise senken, bis sie fokussiert wird (Abbildung 5). Stellen Sie sicher, dass die Nadel, wenn sie abgesenkt wird, neben dem Fadenwurm und nicht über dem Wurm bleibt.
9. Verwenden Sie das 40-fache Objektiv, um sich auf den Synzytialgonadenarm des Fadenwurms zu konzentrieren.
10. Bewegen Sie die Nadel mit dem Feinversteller auf und ab, bis die Spitze zusammen mit dem Synzytialgonadenarm des Fadenfadens fokussiert ist.
11. Bewegen Sie den Fadenwurm langsam mit der Gleitstufe auf die Nadel zu. Drücken Sie dann die Gonade vorsichtig mit der Nadel gegen die Nematodenkörperwand, was zu einer effizienten Nadelpenetration in den Nematodenkörper führt.
12. Treten Sie kurz auf den Fußantrieb, um den Fluss der Nukleinsäurelösung zu starten. Ein schnelles Einschalten genügt. Wenn sich die Nadel in der Gonade befindet, füllt sich die Gonade mit der Lösung und quillt auf.
13. Sobald die Nadel in der richtigen Position gesichert ist, füllen Sie die Gonade mit der Nukleinsäurelösung, bis die Arme der Gonade gefüllt sind. Es ist wichtig, das Ausstoßen von Flüssigkeit aus dem Wurm durch das Loch zu vermeiden, in dem die Nadel sie durchstochen hat.
14. Bewegen Sie den Wurm vorsichtig mit der Gleitstufe von der Nadel weg.
15. Heben Sie die Nadel an und drehen Sie sie gegen den Uhrzeigersinn.
16. Legen Sie einen Tropfen 1x PBS-Puffer auf den Wurm, damit er schwimmt.
17. Verwenden Sie den flammensterilisierten Pick, um den Wurm anzuheben, und legen Sie ihn in einen weiteren Tropfen M9 auf eine frische, mit P. luminescens gesäte Platte, um den Wurm von überschüssigem Öl zu befreien.
18. Entfernen Sie den Nematoden vom M9 und platzieren Sie ihn auf der anderen Seite des Bakterienrasens.
19. Verwenden Sie die gleiche Platte, um mehrere injizierte Nematoden zu übertragen.
20. Bewerten Sie in 2-3 Tagen die Nematoden der ersten Generation (F1) für den transgenen Phänotyp. Trennen Sie die transgenen F1-Nematoden auf einzelne Platten, um zu bestimmen, welche Würmer stabile transgene Linien erzeugen.

Ergebnisse

Um den Status von H. bakteriophora Nematoden zu beurteilen, die die Axenisierung durchlaufen haben, wurde das Vorhandensein oder Fehlen von P. luminescens Bakterienkolonien in IJs bestimmt. Dazu wurde ein Pellet von ca. 500 IJs gesammelt, das zuvor oberflächensterilisiert und in PBS homogenisiert worden war. Die Positivkontrollbehandlung bestand aus einem Pellet von etwa 500 IJs aus der Nematodenkultur, die symbiotische P. luminescens-Bakterien enthielt. Die Pellets von axenisierten und positiv...

Diskussion

Das Verständnis der molekularen Grundlagen einer entomopathogenen Nematodeninfektion und der Insekten-Anti-Nematoden-Immunität erfordert die Trennung der Parasiten von den gegenseitig assoziierten Bakterien^13,15,16. Die entomopathogenen Nematoden H. bacteriophora und S. carpocapsae leben zusammen mit den gramnegativen Bakterien P. luminescens bzw. X. nematophila ¹⁷. Es ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Zellkulturflasche T25	Fisher Scientific	156367
Zellkulturflasche T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Maisöl	VWR	470200-112
Maissirup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Kulturröhrchen 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Spitzen	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon Tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filterpapier	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco-Glass
Deckglas	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halogenkohlenwasserstoff Öl 700	Sigma	H8898
Impföse	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilikatglas Kapillaren	World Precision Instruments	1B100F-3	1,0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB Agar Miller Pulver 500 g
LB Bouillon	Fisher Scientific	BP1426-500	LB Brühe Miller Pulver 500 g
Leica DM IRB Inverses Forschungsmikroskop	Mikroskop	Central-MacConkey
Medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transkription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Mikrozentrifugenröhrchen	VWR	76332-064	1,5 ml
NanoDrop 2000 Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Nadelspritze	VWR	BD305155	22G
Nährbrühe	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Geteilte Petrischale	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Puffer PBS Tabletten Biotech-Qualität 200 Tabletten
PCR Primer	Azenta-Stößel
	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Einweg-Stößel
Petrischale 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petrischale 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Pepton #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Hefe Extrakt	Millipore-Sigma	Y1625