Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

Brieuc Chauvin; Koyomi Nakazawa; Alexandre Beber; Aurélie Di Cicco; Bassam Hajj; François Iv; Manos Mavrakis; Gijsje H. Koenderink; João T. Cabral; Michaël Trichet; Stéphanie Mangenot; Aurélie Bertin

doi:10.3791/63889

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Methodenartikel

Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

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DOI:

10.3791/63889

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17. August 2022

Brieuc Chauvin^*¹ , Koyomi Nakazawa^*¹ , Alexandre Beber¹^,⁷ , Aurélie Di Cicco¹ , Bassam Hajj¹ , François Iv² , Manos Mavrakis² , Gijsje H. Koenderink³ , João T. Cabral⁴ , Michaël Trichet⁵ , Stéphanie Mangenot^*⁶ , Aurélie Bertin^*¹

¹Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, ²Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, ³Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, ⁴Department of Chemical Engineering, Imperial College London, ⁵Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), ⁶Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, ⁷Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.

Zusammenfassung

Der Membranumbau findet ständig an der Plasmamembran und in zellulären Organellen statt. Um die Rolle der Umwelt (ionische Bedingungen, Protein- und Lipidzusammensetzungen, Membrankrümmung) und die verschiedenen Partner, die mit spezifischen Membranumformungsprozessen verbunden sind, vollständig zu analysieren, verfolgen wir In-vitro-Bottom-up-Ansätze. In den letzten Jahren gab es ein großes Interesse daran, die Rolle von Septinproteinen im Zusammenhang mit schweren Krankheiten aufzudecken. Septine sind essentielle und allgegenwärtige Zytoskelettproteine, die mit der Plasmamembran interagieren. Sie sind unter anderem an der Zellteilung, Zellmotilität, Neuromorphogenese und Spermiogenese beteiligt. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie Septine an Membranen interagieren und sich organisieren, um anschließend Membranverformungen zu induzieren und wie sie empfindlich auf bestimmte Membrankrümmungen reagieren können. Dieser Artikel zielt darauf ab, das Zusammenspiel zwischen der Ultrastruktur von Septinen auf molekularer Ebene und dem Membranumbau im Mikrometerbereich zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurden knospende Hefe und Säugetierseptinkomplexe rekombinant exprimiert und gereinigt. Eine Kombination von In-vitro-Assays wurde dann verwendet, um die Selbstorganisation von Septinen an der Membran zu analysieren. Unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs), riesige unilamellare Vesikel (GUVs), große unilamellare Vesikel (LUVs) und wellige Substrate wurden verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Septin-Selbstorganisation, Membranumformung und Membrankrümmung zu untersuchen.

Einleitung

Septine sind filamentbildende Proteine des Zytoskeletts, die mit Lipidmembranen interagieren. Septine sind in Eukaryoten allgegenwärtig und essentiell für zahlreiche zelluläre Funktionen. Sie wurden als die Hauptregulatoren der Zellteilung in knospender Hefe und Säugetieren identifiziert ^1,2. Sie sind an Membranumformungsereignissen, Ziliogenese³ und Spermiogenese⁴ beteiligt. Innerhalb von Säugetierzellen können Septine auch mit Aktin und Mikrotubuli ^5,6,7 i....