Method Article

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

DOI:

10.3791/63891

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May 5th, 2022

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1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

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Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Abstract

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Um die komplexen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren, ist es ein großer Vorteil, einzelne Reaktionen live unter gut kontrollierten Bedingungen zu überwachen. Zu diesem Zweck sind in den letzten 20 Jahren Live-Single-Filament-Experimente entstanden, die hauptsächlich die Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) verwenden, und haben eine Fülle von Schlüsselergebnissen geliefert. Um die Möglichkeiten dieser Experimente weiter auszubauen und wiederkehrende problematische Artefakte zu vermeiden, haben wir 2011 einfache Mikrofluidik in diese Assays eingeführt. Diese Studie beschreibt unser grundlegendes Protokoll, bei dem einzelne Aktinfilamente an einem Ende an der passivierten Deckglasoberfläche verankert sind, sich an der Strömung ausrichten und nacheinander verschiedenen Proteinlösungen ausgesetzt werden können. Wir stellen auch die Protokolle für spezifische Anwendungen vor und erklären, wie kontrollierte mechanische Kräfte dank des viskosen Widerstands der fließenden Lösung angewendet werden können. Wir heben die technischen Vorbehalte dieser Experimente hervor und stellen kurz mögliche Entwicklungen vor, die auf dieser Technik basieren. Diese Protokolle und Erklärungen, zusammen mit der heutigen Verfügbarkeit von einfach zu bedienenden Mikrofluidikgeräten, sollten es Nicht-Spezialisten ermöglichen, diesen Assay in ihren Labors zu implementieren.

Introduction

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Der Auf- und Abbau von Aktinfilamenten und Aktinfilamentnetzwerken wird durch mehrere biochemische Reaktionen gesteuert und hängt vom mechanischen Kontext ab. Um Einblick in diese komplexen Mechanismen zu erhalten, ist es von unschätzbarem Wert, einzelne Reaktionen auf einzelne Filamente (in ausreichend großer Anzahl) beobachten zu können. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Beobachtung dynamischer Aktinfilamente in Echtzeit, meist unter Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence), zu einer Schlüsseltechnik entwickelt und eine beeindruckende Liste von Ergebnissen geliefert, die mit biochemischen Assays in Bulk-Lösung nicht hätten erzie....

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Protocol

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1. Mikrofluidische Kammervorbereitung

  1. Wählen Sie eine SU-8 Masterform mit mehreren Kammermustern. Typische Kammern sind kreuzförmig mit drei Einlässen und einem Auslass, 20 μm hoch und 800 μm breit (Abbildung 1). Solche Master-Formen können von externen Unternehmen gekauft oder in akademischen Labors (z. B. Gicquel, Y. et al.5) hergestellt werden.
  2. Legen Sie Klebeband um den Rand der Form.
    1. Legen Sie ~50 cm langes, 19 mm breites, transparentes Standard-Büroband (siehe Materialtabelle) auf eine Bank, klebrig mit der Seite nach oben. Platzieren Sie die Form ....

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Results

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Für alle oben beschriebenen Experimente sollten fluoreszierend markierte Aktinfilamente deutlich sichtbar sein, mit gutem Kontrast, was auf eine geringe Hintergrundfluoreszenz von der Oberfläche hinweist (Abbildung 4, siehe Ergänzende Datei 1 zur Fehlerbehebung bei häufigen Problemen). Aktinfilamente sollten auch nicht an der Oberfläche haften: Wenn die dominante Durchflussrate niedrig ist, sollten die seitlichen Schwankungen der Aktinfilamente bei der Beobachtung bei lebend.......

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Discussion

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Im Vergleich zu Standard-Single-Filament-Verfahren, bei denen Aktinfilamente entlang ihrer Länge durch mehrere Punkte an der Oberfläche verankert oder durch ein Crowding-Mittel wie Methylcellulose nahe an der Oberfläche gehalten werden, bietet die Mikrofluidik eine Reihe von Vorteilen. Da die Wechselwirkungen mit der Oberfläche minimal sind, werden die künstlichen Pausen, die diese Wechselwirkungen sowohl während der Dehnung als auch der Depolymerisation auslösen können, vermieden. Die Filamente werden durch die Strömung.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Wir danken den B. Ladoux und R.-M. Mège Labor für die Verwendung ihrer UV-Reiniger Ausrüstung, und J. Heuvingh und 0. du Roure für die erste Schulung, die wir über die Vorbereitung von Formen auf Siliziumwafern und die Bereitstellung von Tipps zur Mikrofluidik erhalten haben. Wir danken für die Förderung durch den Europäischen Forschungsratszuschuss StG-679116 (an A.J.) und die Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin und Conformin (an G.R.-L.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-CaseinMerckC6905Verwendet bei 8 mg/mL
Biopsie-Stanze (mit Kolben)Ted Pella15115-2ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotin-BSAMerckA8549Verwendet bei 1 mg/mL
BSAMerckA8022Verwendet bei 50 mg/mL
Deckglas Mini-Rack
Teflonhalter		InvitrogenC14784für 8 Deckgläser
Deckgläser 22x40mm
Dicke #1,5		menzel glä ser631-1370
DABCOMerckD27802Komponente in f-Puffer
DTTEuromedexEU0006-DKomponente in f-Puffer
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophor für die Aktinmarkierung auf Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338Zum Biotinylat von Aktin auf Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Glasreinigungsmittel
ImageJNIHN/AOpen-Source-Software
LaboportKNF811kn.18Vakuumpumpe (Endvakuum: 240 mbar)
Magisches unsichtbares KlebebandScotch7100024666Standard transparentes Büroband
MicrewtubeSimportT341-6T2 mL Mikrofluidische Reservoirröhrchen
Mikrofluidisches Gerät Teil 1: Durchflusseinheit SFluigentFLU-S-D-PCKBDurchflussmesser
Mikrofluidisches Gerät Teil 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKReservoirhalter
Mikrofluidisches Gerät Teil 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Druckregler
Modell 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220UV-Reiniger
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO zur Markierung von
Thermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)Anwendung in einer Dosierung von 1 mg/ml in PBS.
Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 SiliziumelastomerDow Corning1673921Enthält PDMS-Base und Härter
Polyetheretherketon (PEEK) SchlauchMerckZ226661" Blau" : I.D. = 0,25 mm
Sicherheits-BlaspistoleCoilschlauch Pneumatik700-Sgefilterte Luft
SilikonschlauchVWR228-0701PPEEK mit Kupplung verbinden
Katheterkupplung aus EdelstahlPrime BioscienceSC22/15Eingesetzt in PDMS-Ein- und Auslässe zum Anschluss an PEEK-Schläuche
Thermoplastische FolieSigma AldrichPM996Standard "Parafilm"
Reinstes EthanolVWR64-17-5
Ultraschall-ReinigungsbadVWRUSC200THZur Aufnahme von 1 L Bechern
Vakuum-ExsikkatorSP Bel-ArtF42022-0000zur Entgasung des PDMS oder Lösungen
Aktin-Neutravidin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

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Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

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