Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-based Immunoassays

Summary

Die Mikrofluidik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung diagnostischer Tests. Oft sind jedoch teure Geräte und Materialien sowie aufwändige Fertigungs- und Handhabungstechniken erforderlich. Hier beschreiben wir das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Acrylgeräts für magnetische Mikro- und Nanopartikel-basierte Immunoassays in einer kostengünstigen und einfach zu bedienenden Umgebung.

Abstract

Mikrofluidische Systeme haben stark verbesserte Immunoassay-Techniken. Viele Mikrofabrikationstechniken erfordern jedoch spezialisierte, teure oder komplizierte Geräte, was die Herstellung teuer und inkompatibel mit der Massenproduktion macht, was eine der wichtigsten Voraussetzungen für Point-of-Care-Tests (POCT) in ressourcenarmen Umgebungen ist. Diese Arbeit beschreibt den Herstellungsprozess eines Acryls (Polymethylmethacrylat, PMMA) für Nanopartikel-konjugierte enzymatische Immunoassay-Tests unter Verwendung der Computer Numerical Control (CNC) Mikrofrästechnik. Die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts wird durch die Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis eines kommerziellen Antikörpers unter Verwendung von Lysozym als Modellantigen gezeigt, das an 100 nm magnetische Nanopartikel konjugiert ist. Dieses Gerät integriert eine physikalisch versetzte Beschränkung von nur 5 μm Höhe, die verwendet wird, um magnetische Mikropartikel zu erfassen, die eine Magnetfalle bilden, indem ein externer Magnet platziert wird. Auf diese Weise reicht die magnetische Kraft auf die Immununterstützung konjugierter Nanopartikel aus, um sie einzufangen und dem Strömungswiderstand zu widerstehen. Dieses mikrofluidische Gerät eignet sich besonders für die kostengünstige Massenproduktion ohne den Verlust an Präzision für die Immunoassay-Leistung.

Introduction

In den letzten Jahren hat die Mikrofluidik eine wichtige Rolle bei Immunoassay-Techniken^{gespielt 1}. Die Miniaturisierungstechnologie hat viele herausragende Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays, wie z. B. einen reduzierten Proben- und Reagenzienverbrauch, kürzere Inkubationszeiten, effizienten Lösungsaustausch sowie eine höhere Integration und Automatisierung².

Darüber hinaus reduzieren mikrofluidische Systeme in Immunoassays in Verbindung mit magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung die Inkubationszeiten erheblich und erreichen aufgrund des erhöhten Oberflächen-Volumen-Verhältnisses eine hohe Detektionsempfindlichkeit³. Die Brownsche Bewegung der Partikel verbessert die Reaktionskinetik während der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes ^4,5. Darüber hinaus bieten die magnetischen Eigenschaften von Nanopartikeln die Vielseitigkeit, in verschiedene mikrofluidische Gerätekonfigurationen integriert zu werden, was sie zu einem idealen Kandidaten für die Signalübertragung und Molekülerfassung in miniaturisierten On-Chip-Biosensorsystemen macht⁵. Allerdings sind die magnetischen Kräfte aufgrund des hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses deutlich schwächer als die Widerstandskräfte auf der Nanometerskala⁶. Daher kann die Erfassung von Nanopartikeln für entscheidende Immunoassay-Schritte wie Waschen und Detektion eine Herausforderung darstellen, und ein herkömmlicher Magnet reicht nicht aus⁴.

Eine effiziente Möglichkeit, die Nanopartikel zu manipulieren, ist die Verwendung einer mikrofluidischen Magnetfalle, die aus Eisenmikropartikeln besteht, die in einer mikrofluidischen Struktur^{verpackt sind 3}. Wenn sich also ein externer Magnet nähert, entsteht innerhalb des magnetisierten porösen Mediums eine komplexe Wechselwirkung zwischen den magnetischen und den Flusskräften. Die magnetische Kraft, die auf die Nanopartikel wirkt, ist stark genug, um sie einzufangen und dem Strömungswiderstand ^3,4,7 zu widerstehen. Dieser Ansatz erfordert Mikrofabrikationstechniken, die Auflösungen in der Größenordnung von wenigen Mikrometern erreichen, um mikrometrische Strukturen zu erzeugen, die die Mikropartikel zurückhalten.

Aktuelle Mikrofabrikationstechniken ermöglichen die hochauflösende Herstellung von Strukturen von wenigen Mikrometern bis zu Hunderten von^{Nanometern 8}. Viele dieser Techniken erfordern jedoch eine spezielle, teure oder komplizierte Ausrüstung. Eine der Hauptschwierigkeiten ist die Forderung nach einem Reinraum für den Formenbau, der nach wie vor kostspielig und zeitaufwendig^{ist 8,9}. In jüngster Zeit haben Mikrofluidik-Ingenieure diesen Nachteil überwunden, indem sie eine Vielzahl alternativer Fertigungsmethoden mit verschiedenen Vorteilen wie reduzierten Kosten, schnelleren Durchlaufzeiten, billigeren Materialien und Werkzeugen und erhöhter Funktionalität entwickelt^{haben 8}. Auf diese Weise brachte die Entwicklung neuer Mikrofabrikationstechniken kostengünstige Nicht-Reinraum-Methoden, die Auflösungen von nur 10 μm⁸ erreichen. Die Strukturierung kann direkt auf einem Substrat verwendet werden, ohne ein teures Formmuster zu erzeugen, wodurch ein zeitaufwändiger Prozess vermieden wird. Zu den direkten Fertigungsmethoden gehören CNC-Fräsen, Laserablation und Direktlithographie⁸. Alle diese Verfahren eignen sich zur Herstellung von Kanälen mit hohem Aspektverhältnis in einer Vielzahl von Materialien, unabhängig von ihrer Härte⁹, was neue und vorteilhafte Geometrien, physikalisches Verhalten und Qualitäten in mikrofluidischen Bauelementen ermöglicht⁸.

CNC-Mikrofräsen erzeugt mikroskalige Strukturen mit Schneidwerkzeugen, die Schüttgut von einem Substrat entfernen und ist eine effektive Herstellungsmethode für mikrofluidische Geräte^10,11. Die Mikrofrästechnik kann in mikrofluidischen Anwendungen nützlich sein, um Mikrokanäle und Merkmale direkt auf der Arbeitsfläche zu erzeugen, was einen entscheidenden Vorteil bietet: Ein Werkstück kann in kurzer Zeit (weniger als 30 Minuten) hergestellt werden, wodurch die Durchlaufzeit vom Entwurf bis zum Prototyp erheblich verkürzt^{wird 12}. Darüber hinaus macht die breite Verfügbarkeit von Schneidzubehör verschiedener Materialien, Größen und Formen CNC-Fräsmaschinen zu einem geeigneten Werkzeug, das die Herstellung verschiedener Merkmale in vielen Arten von kostengünstigen Einwegmaterialien ermöglicht hat¹³.

Unter allen Materialien, die üblicherweise beim Mikrofräsen verwendet werden, bleiben Thermoplaste aufgrund ihrer vielen günstigen Eigenschaften und ihrer Kompatibilität mit biologischen Anwendungen eine führende Wahl^10,14. Thermoplaste sind aufgrund ihrer signifikanten Vorteile für die Entwicklung kostengünstiger Einweg-Analysesysteme ein attraktives Substrat für mikrofluidische Systeme⁹. Darüber hinaus sind diese Materialien sehr gut für hochvolumige Herstellungsprozesse geeignet, wodurch sie für die Kommerzialisierung und Massenproduktion geeignet sind. Aus diesen Gründen gelten Thermoplaste wie PMMA seit den frühen Jahren der Mikrofluidik als zuverlässige und robuste Materialien¹⁰. Es wurden verschiedene Protokolle beschrieben, um geschlossene Kanäle in Thermoplasten herzustellen, wie z. B. Lösungsmittelbindung¹⁵, Wärmebindung 16 und ultraviolette (UV) / Ozon-Oberflächenbehandlungsbindung¹⁷.

In vielen Fällen reicht die mit herkömmlichen Mikrofräsmaschinen erreichte Positionierauflösung für einige mikrofluidische Anwendungen, die Strukturen kleiner als 10 μm erfordern, nicht aus. High-End-Mikrofräsen hat genug Auflösung. Leider ist seine Verwendung aufgrund der hohen Preise auf eine Handvoll Benutzer beschränkt¹². Zuvor berichtete unsere Forschungsgruppe über die Herstellung und Manipulation eines kostengünstigen Werkzeugs, das die Bearbeitung von Strukturen von weniger als 10 μm ermöglicht und die Auflösung herkömmlicher Fräsmaschinen überwindet¹². Die Leuchte ist eine Plattform, die im 3D-Druck mit einfacher Elektronik hergestellt wird und drei piezoelektrische Aktuatoren enthält. Die Oberfläche enthält scharnierförmige Gelenke, die es ermöglichen, sie anzuheben, wenn die piezoelektrischen Elemente gleichzeitig wirken. Die Verschiebung der Z-Achse kann mit einer Auflösung von 500 nm und einer Genauigkeit von ±1,5 μm¹² gesteuert werden.

Dieses Papier stellt die Schritte des Herstellungsprozesses eines Acrylgeräts (PMMA) durch eine Mikrofrästechnik vor. Das Chipdesign besteht aus einem 200 μm breiten und 200 μm hohen Hauptkanal und einem Seitenkanal mit den gleichen Abmessungen, um den Fluss der Reagenzien zu reinigen. Im zentralen Bereich wird der Kanal durch eine physikalische Beschränkung von nur 5 μm Höhe unterbrochen, die mit der 3D-gedruckten piezoelektrischen Plattform dieser Gruppe¹² hergestellt wurde, um magnetische Mikropartikel einzufangen, die eine magnetische Falle für Nanopartikel bilden, indem ein externer Magnet platziert wird. Wir zeigen die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts durch die Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis eines kommerziellen Antikörpers unter Verwendung von Lysozym als Modellantigen, das an 100 nm magnetische Nanopartikel konjugiert ist. Dieses Gerät kombiniert verschiedene Eigenschaften, die es einzigartig machen⁴: Die Verwendung von magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung reduziert die Gesamttestzeit von Stunden auf Minuten; Die Verwendung eines fluorogenen Enzyms für den Nachweis ermöglicht Nachweisgrenzen, die mit denen von Standard-Enzym-gebundenen Immunassays (ELISAs) vergleichbar sind. und die Verwendung eines Thermoplasts als Herstellungsmaterial macht es kompatibel mit der Massenproduktion, was bei den magnetischen Fallen früherer mikrofluidischer Nanopartikel nicht der Fall war³, und macht es zu einem ausgezeichneten Kandidaten für die Entwicklung von POCT.

Protocol

1. Mikrofräsen

1. Oberflächenschliff
   1. Schalten Sie die Mikrofräse und die piezoelektrische Steuerung ein. Starten Sie die jeweilige Steuerungssoftware¹².
   2. Wählen Sie die gewünschten Schaftfräser (Durchmesser 200 μm und 800 μm). Legen Sie sie in das entsprechende Fach der Fräsmaschine (Abbildung 1).
   3. Schneiden Sie 9 mm x 25 mm Rechtecke aus 1,3 mm dickem PMMA mit dem 800 μm Schaftfräsermeißel. Befestigen Sie eines dieser Rechtecke vorsichtig mit doppelseitigem Klebeband an der piezoelektrischen Plattform (Abbildung 2).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Acrylrechteck immer an der gleichen Position platzieren, so dass eine der Ecken mit den Ursprungskoordinaten auf der x- und y-Achse für die Bearbeitung übereinstimmt.
   4. Schließen Sie den Z-Sensor an und platzieren Sie ihn auf der Oberfläche des PMMA-Rechtecks. Wählen Sie den Erkennungsstift aus und bewegen Sie ihn über die Sensoroberfläche. Senken Sie den Stift manuell ab, ohne den Sensor zu berühren. Aktivieren Sie den Z0-Erkennungsmodus (Abbildung 3).
   5. Wählen Sie den 200-μm-Schaftfräser aus und bewegen Sie ihn zum x-y-Ursprung. Entfernen Sie den Z-Sensor. Senken Sie den Meißel vorsichtig ab, ohne die Acryloberfläche zu berühren.
   6. Drehen Sie den 200 μm Schaftfräser bei 14.500 U/min. Senken Sie sie langsam auf die Ursprungskoordinate auf der z-Achse ab (z = 0). Setzen Sie die z-Achse 30 μm unter den Ursprung zurück. Legen Sie diese Koordinate als neuen Z-Ursprung fest.
      HINWEIS: Senken Sie das Bit niemals, wenn es sich nicht dreht. Andernfalls besteht die Gefahr, dass es bricht.
   7. Klicken Sie in der Mikrofräsmaschinensoftware auf die Schaltfläche Schneiden , um das Cut-Panel zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen und wählen Sie die .txt Datei (Supplemental Coding File 1) mit einem zuvor erstellten Code zum Schleifen der Acryloberfläche aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabe , um den Vorgang zu starten.
   8. Bringen Sie den Schaftfräser zu der Koordinate, an der die Restriktion bearbeitet wird. Verhindern Sie, dass der Schaftfräser von der Bodenoberfläche abhebt, sobald diese Koordinate erreicht ist, indem Sie auf die Schaltfläche Pause klicken. Andernfalls positionieren Sie den Schaftfräser manuell auf diese Koordinate (Abbildung 4A).
2. Fräsen der 5-μm-Einschränkung
   1. Stellen Sie die Drehzahl des Schaftfräsers auf 11.000 U/min ein. Heben Sie die Plattform um 6,5 μm mit der Schnittstelle der piezoelektrischen Plattform an (ergänzende Abbildung S1). Bewegen Sie den Schaftfräser um 500 μm entlang der y-Achse. Setzen Sie die piezoelektrische Plattform mit der Steuerschnittstelle auf ihren Anfangswert auf der z-Achse zurück.
3. Fräsen von Mikrokanälen
   1. Öffnen Sie die zuvor erstellte Designdatei aus der Designsoftware (Supplemental Design File 1). Klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken . Öffnen Sie das Menü Eigenschaften und klicken Sie auf das Farbfenster, das der Schicht entspricht, die das zu bearbeitende Design enthält. Stellen Sie die Fertigungsparameter im Werkzeugfenster ein, wie in der ergänzenden Abbildung S2 angegeben.
   2. Deaktivieren Sie unerwünschte Ebenen, indem Sie im Pulldown-Menü Extras die Option Keine auswählen.
4. Fräsen von Löchern
   1. Schalten Sie auf den 800 μm Schaftfräser um. Aktivieren Sie die Designschicht der Löcher mit 1,2 mm Durchmesser durch Klicken auf das entsprechende Farbfenster.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.3.2., stellen Sie in diesem Fall jedoch die entsprechenden Fertigungsparameter ein, wie in der ergänzenden Abbildung S3A für die Bohrungen beschrieben.
      HINWEIS: Die Tiefe der bearbeiteten Löcher beträgt die Hälfte der Acryldicke.
   3. Bearbeiten Sie zwei zusätzliche Löcher an kontralateralen Ecken des Rechtecks zur umgekehrten Ausrichtung des Acryls auf einer neuen Plattform (Abbildung 4B). Ziehen Sie das Acrylrechteck von der piezoelektrischen Plattform ab. Drehen Sie das Acryl um und kleben Sie es mit doppelseitigem Klebeband über den Adapter mit den bearbeiteten Säulen (Abbildung 4C,D).
   4. Öffnen Sie die Datei mit dem Entwurf der Bohrungen für die gegenüberliegende Fläche aus der Konstruktionssoftware (Supplemental Design File 2). Stellen Sie die entsprechenden Fertigungsparameter ein, wie in der ergänzenden Abbildung S3B beschrieben. Fräsen Sie die verbleibende Hälfte der Ein- und Auslasslöcher des Reagenzes mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einer Tiefe von 0,7 mm (Ergänzende Abbildung S3C).

Abbildung 1: Platzierung der Schaftfräsermeißel . (A) Die 200 μm und 800 μm Schaftfräser werden platziert und durch eine Schraube am Stahlträger befestigt. (B) Jeder Schaftfräser wird zur automatischen Auswahl in das spezifische Fach der Mikrofräsmaschine gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Piezoelektrische Plattform. Die Plattform wird im 3D-Druck hergestellt und besteht aus zwei sechseckigen Basen, die durch Scharniere verbunden sind, die eine feine Verschiebung in der z-Achse ermöglichen, die von drei piezoelektrischen Aktuatoren gesteuert wird. Es wird auch ein Acryladapter beobachtet, an dem das PMMA-Rechteck befestigt ist und der die Einstellung der Ausrichtungsecke der Koordinaten ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Z-Achsen-Kalibrierung. Die Schritte der Z-Achsen-Kalibrierung sind detailliert. (A) Der Z-Sensor enthält ein Kabel, das in die Mikrofräse eingesteckt wird. (B) Der Sensor wird direkt auf der zu bearbeitenden Oberfläche platziert. (C) Der Detektionsstift besteht aus einem Metallstab, der in einem speziellen Fach neben Schaftfräsern platziert ist. (D) Wenn beide Zubehörteile in Kontakt kommen, berechnet die Mikrofräse automatisch die Ursprungskoordinate auf der z-Achse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Rektifizierte Acryloberfläche . (A) Der Schaftfräser mit einem Durchmesser von 200 μm streicht über die gesamte Oberfläche des Acrylrechtecks und entfernt eine etwa 30 μm hohe Schicht. (B) Das Bild zeigt die verschiedenen Strukturen, die auf der Vorderseite des zuvor rektifizierten Acryls gefräst sind. Kanäle und Löcher für den Ein- und Auslass von Reagenzien werden beobachtet. Die 5 μm-Einschränkung ist mit bloßem Auge nicht zu erkennen. (C) Mikrogefräste Oberfläche mit Ausrichtlöchern und Adapter mit Ausrichtsäulen an gegenüberliegenden Ecken. (D) Das Acryl ist kopfüber auf dem Adapter mit Säulen ausgerichtet, in die die Ausrichtlöcher passen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Kanalabdichtung

1. Acrylreinigung
   1. Entfernen Sie das Acrylrechteck von der Säulenadapterplattform. Nehmen Sie ein weiteres unbearbeitetes Acrylrechteck. Waschen Sie beide Acrylplatten mit Isopropylalkohol (IPA) und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie den Kontakt mit IPA.
   2. Tauchen Sie das Acryl 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad (Abbildung 5A,B).
2. Gasförmige Chloroform-Exposition
   1. Trocknen Sie beide Acrylplatten perfekt. Kleben Sie sie mit doppelseitigem Klebeband auf die Innenseite eines Glasdeckels für Petrischalen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Seite des bearbeiteten Kanals freilegen (Abbildung 5C). Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, die Acryloberfläche direkt zu berühren.
   2. Legen Sie den Boden der Glas-Petrischale in eine größere Glas-Petrischale (Abbildung 5D). Gießen Sie 1 ml Chloroform in den Boden der Petrischale. Platzieren Sie schnell den Deckel mit den an der Innenseite befestigten Acrylplatten.
   3. Fügen Sie sofort destilliertes Wasser auf den Boden der größeren Petrischale bis zur Höhe des Petrischalendeckels hinzu. Lassen Sie das Acryl 1 min lang Chloroformgas einwirken (Abbildung 5E).
      HINWEIS: Bedenken Sie, dass eine längere Belichtungszeit mit Chloroform die Acryloberfläche angreift und die 5-μm-Einschränkung schmilzt, ihre Höhe ändert oder vollständig verschwindet.
   4. Neigen Sie die Petrischale, um die erzeugte Wasserdichtung zu brechen. Entfernen Sie sofort das Acryl von der Chloroform, indem Sie die Petrischale freilegen. Achten Sie darauf, das Wasser nicht zu verschütten.
      VORSICHT: Führen Sie diesen Vorgang im Abzug durch und verwenden Sie Handschuhe, da Chloroform hochgiftig ist.
3. Verklebung durch Pressen und Erhitzen
   1. Ziehen Sie beide Acrylplatten vom doppelseitigen Klebeband ab.
   2. Richten Sie beide Acrylfarben an den Seiten aus, die von Angesicht zu Angesicht gasförmigem Chloroform ausgesetzt waren, und bilden Sie ein Sandwich. Legen Sie das Acryl bei 18 kgf/cm² und einer Temperatur von 90 °C in die Presse (Abbildung 5F,G).
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das Acryl längs ausgerichtet zu platzieren und seine Ausrichtung nach 2 Minuten für eine bessere Abdichtung zu ändern. Wenn die Dichtung nach dieser Zeit nicht ausreicht, legen Sie sie für Intervalle von nicht mehr als 1 min wieder in die Presse. Überprüfen Sie mit dem Stereoskop den Status der Kanäle und die Einschränkung. Bedenken Sie, dass bei Überschreitung der Dringlichkeitszeit die Gefahr besteht, dass die Einschränkung aufgehoben wird.
4. Schlauchbefestigung
   1. Schneiden Sie 2-3 cm Schlauchlängen. Machen Sie einen völlig geraden Schnitt. Befestigen Sie jeden Schlauch mit einem sofort trocknenden flüssigen Klebstoff an den Löchern des Geräts (Abbildung 6A). Verhindern Sie, dass der Klebstoff in den Chip gelangt.

Abbildung 5: Versiegelungsprozess des Geräts. (A) Jede der Acrylplatten wird in einen wiederverschließbaren Beutel mit destilliertem Wasser gegeben und in das Ultraschallbad getaucht. (B) Das Bild links zeigt die Kanäle unmittelbar nach der Herstellung, und das Bild rechts zeigt das gleiche Gerät nach dem Waschen mit IPA und dem Ultraschallbad. die alle Verunreinigungen und Acrylrückstände aus dem Mikrokanal entfernt. Die Kanten der Restriktion, die den zentralen Kanal von 200 μm unterbricht, werden beobachtet, was den erfolgreichen Fräsprozess bestätigt. Maßstabsbalken = 500 μm. (C) Beide Acrylfarben werden getrocknet und auf der Glasplattform auf dem Deckel geklebt. (D) Der Boden der Petrischale befindet sich in einer anderen Schale mit größerem Durchmesser. (E) Beim Schließen der Petrischale verhindert die Wasserdichtung, dass gasförmiges Chloroform entweichen kann. (F) Beschreibung der Elemente des Hebels mit einem Gewicht von 5 kg. (G) Abbildung des offenen Hebels, der in Rot den Bereich zeigt, in dem das Acryl platziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Gerätevorbereitung

1. Füllen Sie die Kanäle mit destilliertem Wasser mit einer Spritze. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen oder Strömungsbeständigkeit vorhanden sind. Tauchen Sie das Gerät 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad, um verbleibendes Acryl, Klebstoff oder unerwünschtes Material in den Kanälen zu entfernen.
2. Entleeren Sie das Wasser in den Gerätekanälen. Verwenden Sie eine Spritze, um eine blockierende Lösung einzuführen, die mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt wurde, verdünnt in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) und zuvor durch einen 0,2 μm Polyethersulfon (PES) Spritzenfilter filtriert.
3. Bereiten Sie eine Suspension von Eisenmikropartikeln von 7,5 μm Durchmesser in 5% BSA vor.
   HINWEIS: Die Mikropartikel werden zuvor mit einer Siliciumdioxid-Polyethylenglykol-Schicht (PEG) funktionalisiert, die eine Beständigkeit gegen Proteinabsorption verleiht⁴.
4. Inkubieren Sie den Chip und die Mikropartikelsuspension mit der Blocklösung für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Wenn möglich, über Nacht bei 4 °C blockieren lassen.

4. Bildung von Mikropartikelfallen

1. Führen Sie die Mikropartikel mit einer Spritzennadel durch den Seitenkanalauslassschlauch in den Chip ein. Platzieren Sie den Chip senkrecht und lassen Sie die Mikropartikel unter der Wirkung der Schwerkraft durch den Seitenkanal fließen. Drehen Sie den Chip um 180° in zwei Schritten von 90° und lassen Sie die Mikropartikel bei der Beschränkung von 5 μm anvisieren und verdichten.
2. Entfernen Sie überschüssige Mikropartikel durch Schwerkraft, die sich um 45° in Richtung Seitenkanal dreht.
3. Halten Sie das Gerät aufrecht, um zu vermeiden, dass die Mikropartikelfalle aufgehoben wird. Siehe Abbildung 6B für eine Zusammenfassung des Prozesses zur Bildung von Mikropartikelfallen.

5. Immunoassay

1. Herstellung von Nanopartikeln
   1. Nehmen Sie 2 μL der Suspension von 100 nm Nanopartikeln, die zuvor mit Lysozym konjugiert wurden (Antigenmodell). Fügen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL Blockierlösung hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Fügen Sie 150 μL Waschpuffer hinzu (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Setzen Sie das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in einen Magnetabscheider ein. 15 min aufbewahren, um die Trennung der Nanopartikel zu ermöglichen (Zusatzabbildung S4).
      HINWEIS: Das Mindestvolumen für den Magnetabscheider beträgt 200 μL. Vermeiden Sie die Verwendung eines kleineren Volumens.
   4. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette aus dem Röhrchen. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Wand der Röhre, in der das Nanopartikelpellet gebildet wurde.
   5. Fügen Sie 250 μL frischen Waschpuffer hinzu. Halten Sie das Rohr 15 min unter Bewegung.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.3.-5.1.5. 2x mehr, nur 5 min schütteln.
   7. Fügen Sie die gewünschte Konzentration des primären Anti-Lysozym-Antikörpers hinzu (siehe Materialtabelle). Auf ein Endvolumen von 100 μL in Antikörperverdünnungsmittel einstellen (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. 15 min bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   9. Wiederholen Sie die Waschschritte 5.1.2.-5.1.6.
   10. Fügen Sie 100 μL Antikörperverdünnungsmittel hinzu. Fügen Sie den Meerrettichperoxidase-gekoppelten sekundären Antikörper (HRP-AbII) (siehe Materialtabelle) in einer Verdünnung von 1:500 hinzu.
   11. Wiederholen Sie die Waschschritte 5.1.2.-5.1.6.
   12. Halten Sie die Nanopartikel in einem Endvolumen von 50 μL Antikörperverdünnungsmittel.

6. Experimentelle Montage

1. Füllen Sie die beiden 100-μL-Glasspritzen mit Wasser, verbinden Sie einen 6,5 cm langen Schlauch mit jeder Spritze, führen Sie einen Metallstift in das Ende des Schlauchs ein und legen Sie beide Spritzen auf die computergesteuerte Spritzenpumpe.
2. Versiegeln Sie alle Schläuche des Acrylgeräts mit Hitze.
3. Schneiden Sie den Einlassschlauch ab und halten Sie nur wenige Millimeter. Füllen Sie die Dosiernadel mit Waschpuffer und führen Sie sie in den geschnittenen Schlauch ein. Lassen Sie die Lösung tropfen, bevor Sie die Nadel an das Gerät anschließen, um den Luftzugriff auf das Gerät zu verhindern.
4. Schneiden Sie den Auslassschlauch vom seitlichen Kanal ab. Schließen Sie die Spritzenpumpe an. Führen Sie als Nächstes das gleiche Verfahren für den Hauptkanalauslassschlauch aus.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Schritte 6.3.-6.4 durchzuführen. in dieser Reihenfolge, um das Auspacken der Mikropartikelfalle zu vermeiden. Wenn möglich, überprüfen Sie den Zustand der Falle während dieser Schritte mit Hilfe einer Lupe.
5. Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Magneten mit doppelseitigem Klebeband am Objektträger und legen Sie auf jeder Seite ein kleines Stück Klebeband, um die Chipkanten am Glas zu befestigen.
6. Stellen Sie einen Durchfluss von 50 μL/h über die Registerkarten Durchflussrate und Einheiten in der Spritzenpumpensteuerung ein. Wählen Sie den Auszahlungsmodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um den Fluss des Waschpuffers zu aktivieren.
7. Nähern Sie sich vorsichtig dem Gerät in Richtung des Objektträgers mit dem Magneten in horizontaler Weise, so dass der Bereich des Chips, der die Falle enthält, den Magneten berührt.
8. Kleben Sie die Kanten des Geräts mit doppelseitigem Klebeband auf das Glas, um Bewegungen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den optischen Pfad für die Mikroskopie zu blockieren (Abbildung 6C).

Abbildung 6: Endgültiges Gerät . (A) Acrylgerät, bei dem die Schläuche an den entsprechenden Ein- und Ausgängen befestigt sind. Die Skala zeigt die Abmessungen des Gerätes in Zentimetern an. b) Protokoll für die Bildung der Mikropartikelfalle. Mikropartikel fließen durch die Schwerkraft durch den Kanal, wenn das Gerät in einer vertikalen Position platziert wird. Mikropartikel werden bei der 5 μm-Einschränkung konzentriert. Überschüssige Mikropartikel lassen sich leicht entfernen, indem der Chip durch den Seitenkanal gedreht wird. Der Chip wird vertikal gehalten, um die Falle vor dem Immunoassay zu erhalten. (C) Mikrofluidische Vorrichtung, die auf einem Glasobjektträger montiert ist, der den Magneten enthält, auf dem Tisch des inversen Fluoreszenzmikroskops. Die Dosiernadel, durch die die Reagenzien zugegeben werden, sowie die Auslassschläuche, die mit einer Spritzenpumpe verbunden sind, werden beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

7. Immundetektion

1. Lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 μL/h fließen, um überschüssiges BSA zu entfernen.
2. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. Fügen Sie 50 μL der Nanopartikelsuspension hinzu.
3. Lassen Sie die Suspension der Nanopartikel für 7 min bei einer Flussrate von 100 μL / h fließen. Anschließend die Durchflussrate auf 50 μL/h ändern und weitere 15 min durchströmen.
4. Wechseln Sie die Dosiernadel. Den Waschpuffer 10 min bei 50 μL/h laufen lassen. Bereiten Sie das fluorogene Substrat während des Waschschritts nach Herstellerangaben vor.
5. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. Fügen Sie 100 μL des fluorogenen Substrats hinzu (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das fluorogene Substrat 6 min bei 50 μL/h fließen.
6. Stellen Sie die Messparameter Durchflussrate (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h und 10 μL/h ) und die Zeit (6 min) in den entsprechenden Registerkarten Durchflussrate und Timer einstellen der Schnittstelle ein, die die Spritzenpumpe steuern. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede der durchzuführenden Messungen den Auszahlungsmodus auswählen.
7. Stellen Sie eine zusätzliche Durchflussregisterkarte auf 50 μL/h ein und stellen Sie den Timer auf 3 Minuten für den Waschschritt ein.
8. Schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops 15 s ein, bevor das Substrat bei 50 μL/h stoppt. Starten Sie die Bildaufnahme mit der Software der Mikroskopkamera 10 s bevor das Substrat mit einer Belichtungszeit von 1.000 Millisekunden stoppt. Führen Sie die Bildgebung 6 Minuten lang bei 1 Bild/s (FPS) durch.
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des gewünschten Durchflussparameters, unmittelbar nachdem der Substratwaschdurchfluss bei 50 μL/h gestoppt wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des Waschstroms (50 μL/h), unmittelbar nachdem der gewählte Messfluss gestoppt wurde.
10. Stoppen Sie die Bildaufnahme und schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops aus, um ein Photobleichen des Substrats zu vermeiden.
11. Wiederholen Sie die Schritte 7.8.-7.10. für jede verwendete Messdurchflussrate.

Results

Es konnte ein hochreproduzierbares Fertigungsprotokoll etabliert werden, das die Auflösung der konventionellen Mikrofrästechnik verbessert. Mit diesem Protokoll wird die Herstellung eines Kanals von nur 5 μm Höhe erreicht, der als versetzte Einschränkung in einem 200 μm hohen Kanal arbeitet. Das einfache Design der versetzten Restriktion fängt Eisenmikropartikel mit einem Durchmesser von 7,5 μm ein, die, wenn sie im Mikrokanal verdichtet werden, die Erzeugung einer Magnetfalle ermöglichen, wenn sich ein externer Magnet d...

Discussion

Ein mikrofluidisches Acrylgerät für Immunoassays mit Nanopartikeln als Immununterstützung wurde unter Verwendung einer Mikrofrästechnik hergestellt. Die Methode der direkten Herstellung auf dem Substrat hat den Vorteil, dass die Verwendung einer Masterform und der damit verbundene Zeit- und Kostenaufwand vermieden werden. Es beschränkt sich jedoch auf Rapid Prototyping und die Herstellung von Geräten in großen Stückzahlen.

Hier haben wir eine zuvor berichtete piezoelektrische Zubehörplattform ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Schaftfräser	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Schaftfräser	KYOCERA SGS	2228	2FL 0,032x1/8x0,48x1-1/12
Carbonyl-Eisen-Mikropartikel	Sigma-Aldrich	44890	7 μ M
Chloroform	Fermont	6201	Gesundheitsgefahr: Mäßig Entflammbarkeit: Keine Reaktivität: Keine Kontaktgefahr: Mäßig
CMOS-Kamera Moment	Teledyne Photometrics		Sensortechnologie: CMOS Quanteneffizienz: 73% Pixelgröße: 4,5 & Mikro; m x 4,5 &Mikro; m Unterstützte Schnittstellen: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Gravursoftware zum Entwerfen und Erstellen des Gravurpfads auf der Oberfläche
Absaughaube	Unbekannt	Unbekannt Flexibler
Kunststoffschlauch	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Fluoreszenzmikroskop	ZEISS	Axio Vert.A1
Hochpräzise Dosiernadel	Loctite	98612
Hausgemachte piezoelektrische Controller-Anwendung	LabView		Weitere Informationen finden Sie in Referenz 12.
Loctite 495 Sekundenkleber	Henkel	49503	Mit Mikropipettenspitze oder Dosiernadel auftragen;
MagJET Trenngestell	thermowissenschaftlich		12 x 1,5 mL
Mechanische Presse	Selbstgebaute
Fräsmaschine	Roland	MDX-50
Piezoelektrische Plattform	Hausgemacht		Siehe Referenz 12
Polymethylmethacrylat - Platte - PMMA, Acryl	Goodfellow	ME303018/1	Dicke: 1,3 mm, Transparenz: Klar/Transparent
PVCamTest Software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Software zur Bildaufnahme
Stereomikroskop	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Spritzenpumpe	kd Scientific	KDS200	Kann bis zu zwei Spritzen aufnehmen
Utrasonic Badewanne	Branson	2800
VPanel Software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software zur Steuerung der Mikrofräsmaschine