Summary
La microfluidica è un potente strumento per lo sviluppo di test diagnostici. Tuttavia, sono spesso necessarie attrezzature e materiali costosi, nonché laboriose tecniche di fabbricazione e manipolazione. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici magnetici basati su micro e nanoparticelle in un ambiente a basso costo e semplice da usare.
Abstract
I sistemi microfluidici hanno notevolmente migliorato le tecniche di dosaggio immunologico. Tuttavia, molte tecniche di microfabbricazione richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate, rendendo la fabbricazione costosa e incompatibile con la produzione di massa, che è una delle precondizioni più importanti per l'adozione di test point-of-care (POCT) in ambienti con risorse limitate. Questo lavoro descrive il processo di fabbricazione di un dispositivo acrilico (polimetilmetacrilato, PMMA) per test immunologici enzimatici coniugati con nanoparticelle utilizzando la tecnica di microfresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Il funzionamento del dispositivo microfluidico è dimostrato eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo integra una restrizione fisica sfalsata di soli 5 μm di altezza, utilizzata per catturare le microparticelle magnetiche che compongono una trappola magnetica posizionando un magnete esterno. In questo modo, la forza magnetica sul supporto immunologico delle nanoparticelle coniugate è sufficiente per catturarle e resistere alla resistenza del flusso. Questo dispositivo microfluidico è particolarmente adatto per la produzione di massa a basso costo senza perdita di precisione per le prestazioni del dosaggio immunologico.
Introduction
Negli ultimi anni, la microfluidica ha svolto un ruolo importante nelle tecniche di dosaggio immunologico1. La tecnologia di miniaturizzazione presenta molti vantaggi eccezionali rispetto ai test immunologici tradizionali, come il ridotto consumo di campioni e reagenti, tempi di incubazione più brevi, uno scambio efficiente di soluzioni e una maggiore integrazione e automazione2.
Inoltre, i sistemi microfluidici nei saggi immunologici, in associazione con nanoparticelle magnetiche come immunosupporto, riducono considerevolmente i tempi di incubazione, raggiungendo un'elevata sensibilità di rivelazione grazie all'aumento del rapporto superficie-volume3. Il movimento browniano delle particelle migliora la cinetica di reazione durante la formazione del complesso antigene-anticorpo 4,5. Inoltre, le proprietà magnetiche delle nanoparticelle forniscono la versatilità per essere integrate in diverse configurazioni di dispositivi microfluidici, rendendole un candidato ideale per la segnalazione e la cattura di molecole in sistemi di biorilevamento miniaturizzati su chip5. Tuttavia, le forze magnetiche sono significativamente più deboli delle forze di trascinamento su scala nanometrica a causa dell'elevato rapporto superficie-volume6. Pertanto, la cattura di nanoparticelle per fasi cruciali del dosaggio immunologico come il lavaggio e il rilevamento può essere difficile e un magnete convenzionale è insufficiente4.
Un modo efficace per manipolare le nanoparticelle è l'uso di una trappola magnetica microfluidica formata da microparticelle di ferro, che sono impacchettate in una struttura microfluidica3. Pertanto, quando un magnete esterno si avvicina, viene creata un'interazione complessa all'interno del mezzo poroso magnetizzato tra le forze magnetiche e di flusso. La forza magnetica che agisce sulle nanoparticelle è abbastanza forte da catturarle e resistere alla resistenza del flusso 3,4,7. Questo approccio richiede tecniche di microfabbricazione che raggiungano risoluzioni dell'ordine di pochi micrometri per generare strutture micrometriche che trattengano le microparticelle.
Le attuali tecniche di microfabbricazione consentono la fabbricazione ad alta risoluzione di strutture da pochi micron a centinaia di nanometri8. Tuttavia, molte di queste tecniche richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate. Una delle principali difficoltà è la necessità di una camera bianca per la fabbricazione di stampi, che rimane costosa e dispendiosa in termini di tempo 8,9. Recentemente, gli ingegneri microfluidici hanno superato questo inconveniente sviluppando una varietà di metodi di fabbricazione alternativi, con vari vantaggi come costi ridotti, tempi di consegna più rapidi, materiali e strumenti più economici e maggiore funzionalità8. In questo modo, lo sviluppo di nuove tecniche di microfabbricazione ha portato metodi a basso costo, non per camere bianche, che raggiungono risoluzioni fino a 10 μm8. La modellazione può essere utilizzata direttamente su un substrato senza generare un costoso modello di stampaggio, evitando così un processo dispendioso in termini di tempo. I metodi di fabbricazione diretta includono la fresatura CNC, l'ablazione laser e la litografia diretta8. Tutti questi metodi sono adatti per produrre canali ad alto rapporto di aspetto in una vasta gamma di materiali, indipendentemente dalla loro durezza9, consentendo nuove e vantaggiose geometrie, comportamenti fisici e qualità nei dispositivi microfluidici8.
La microfresatura CNC crea strutture su microscala utilizzando utensili da taglio che rimuovono materiale sfuso da un substrato ed è un metodo di fabbricazione efficace per dispositivi microfluidici10,11. La tecnica di microfresatura può essere utile nelle applicazioni microfluidiche per creare microcanali e caratteristiche direttamente sul piano di lavoro, offrendo un vantaggio chiave: un pezzo può essere fabbricato in breve tempo (meno di 30 minuti), riducendo significativamente i tempi di consegna dalla progettazione al prototipo12. Inoltre, l'ampia disponibilità di accessori da taglio di diversi materiali, dimensioni e forme rende le fresatrici CNC uno strumento adatto che ha permesso la fabbricazione di diverse caratteristiche in molti tipi di materiali usa e getta a basso costo13.
Tra tutti i materiali comunemente utilizzati nella microfresatura, i termoplastici rimangono una scelta leader grazie alle loro numerose proprietà favorevoli e alla compatibilità con le applicazioni biologiche10,14. I materiali termoplastici sono un substrato interessante per i sistemi microfluidici grazie ai loro significativi vantaggi per lo sviluppo di sistemi analitici monouso a basso costo9. Inoltre, questi materiali sono altamente suscettibili ai processi di produzione ad alto volume, rendendoli adatti alla commercializzazione e alla produzione di massa. Per questi motivi, i materiali termoplastici come il PMMA sono stati considerati materiali affidabili e robusti fin dai primi anni della microfluidica10. Sono stati descritti diversi protocolli per fabbricare canali chiusi in materiali termoplastici, come il legame solvente15, il legame termico16 e l'incollaggio con trattamento superficiale ultravioletto (UV) / ozono17.
In molti casi, la risoluzione di posizionamento ottenuta con le microfresatrici convenzionali non è sufficiente per alcune applicazioni microfluidiche che richiedono strutture inferiori a 10 μm. La microfresatura di fascia alta ha una risoluzione sufficiente. Sfortunatamente, a causa dei prezzi elevati, il suo utilizzo è limitato a una manciata di utenti12. In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha riportato la fabbricazione e la manipolazione di uno strumento a basso costo che consente di lavorare strutture inferiori a 10 μm, superando la risoluzione delle fresatrici convenzionali12. L'apparecchio è una piattaforma prodotta dalla stampa 3D con elettronica semplice, contenente tre attuatori piezoelettrici. La superficie contiene giunti a cerniera che consentono di sollevarla quando gli elementi piezoelettrici agiscono simultaneamente. Lo spostamento dell'asse Z può essere controllato con una risoluzione di 500 nm e una precisione di ±1,5 μm12.
Questo documento presenta le fasi del processo di produzione di un dispositivo acrilico (PMMA) attraverso una tecnica di microfresatura. Il design del chip è costituito da un canale principale largo 200 μm e alto 200 μm e da un canale laterale con le stesse dimensioni per spurgare il flusso dei reagenti. Nella regione centrale, il canale è interrotto da una restrizione fisica di soli 5 μm di altezza, fabbricata con la piattaforma piezoelettrica stampata in 3D realizzata da questo gruppo12, per catturare le microparticelle magnetiche che costituiscono una trappola magnetica per le nanoparticelle posizionando un magnete esterno. Mostriamo il funzionamento del dispositivo microfluidico eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo combina diverse caratteristiche che lo rendono unico4: l'uso di nanoparticelle magnetiche come supporto immunitario riduce il tempo totale di test da ore a minuti; l'utilizzo di un enzima fluorogenico per la rilevazione consente limiti di rilevazione paragonabili a quelli dei saggi standard di immunoassorbimento enzimatico (ELISA); e l'uso di un termoplastico come materiale di fabbricazione lo rende compatibile con la produzione di massa, cosa che non era il caso delle precedenti trappole magnetiche di nanoparticelle microfluidiche3, e lo rende un ottimo candidato per sviluppare POCT.
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Protocol
1. Microfresatura
- Rettifica superficiale
- Accendere la microfresatrice e il controller piezoelettrico. Avviare i rispettivi software di controllo12.
- Selezionare le punte di fresa richieste (diametri 200 μm e 800 μm). Posizionarli nell'apposito vano della fresatrice (Figura 1).
- Tagliare rettangoli di 9 mm x 25 mm di PMMA di spessore 1,3 mm con la punta da 800 μm. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con nastro biadesivo alla piattaforma piezoelettrica (Figura 2).
NOTA: Assicuratevi di posizionare sempre il rettangolo acrilico nella stessa posizione in modo che uno degli angoli coincida con le coordinate di origine sugli assi x e y per la lavorazione. - Collegare e posizionare il sensore z sulla superficie del rettangolo PMMA. Selezionare il perno di rilevamento e spostarlo sulla superficie del sensore. Abbassare manualmente il perno senza contattare il sensore. Attivare la modalità di rilevamento Z0 (Figura 3).
- Selezionate la punta da 200 μm e spostatela nell'origine x, y. Rimuovere il sensore z. Abbassare la punta con attenzione senza contattare la superficie acrilica.
- Ruotare la punta da 200 μm a 14.500 giri/min. Abbassatelo lentamente fino alla coordinata di origine sull'asse z (z = 0). Reimpostate l'asse z 30 μm sotto l'origine. Impostate questa coordinata come nuova origine z.
NOTA: non abbassare mai la punta se non è in rotazione. Altrimenti, rischia di rompersi. - Fare clic sul pulsante Taglia nel software della microfresatrice per attivare il pannello Taglio . Fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare il file .txt (Supplemental Coding File 1) con un codice creato in precedenza per la levigatura della superficie acrilica. Fare clic sul pulsante Output per avviare il processo.
- Portate la punta della fresa finale alla coordinata in cui verrà lavorata la restrizione. Impedite che la punta della fresa si sollevi dalla superficie di terra una volta raggiunta questa coordinata facendo clic sul pulsante Pausa . In caso contrario, riposizionate manualmente la punta della fresa finale su questa coordinata (Figura 4A).
- Fresatura della restrizione di 5 μm
- Impostare la velocità di rotazione della punta della fresa su 11.000 giri/min. Sollevare la piattaforma di 6,5 μm con l'interfaccia della piattaforma piezoelettrica (Figura supplementare S1). Spostare la punta della fresa lungo l'asse y di 500 μm. Riportare la piattaforma piezoelettrica al suo valore iniziale sull'asse z con l'interfaccia di controllo.
- Fresatura di microcanali
- Aprire il file di progettazione creato in precedenza dal software di progettazione (file di progettazione supplementare 1). Fare clic sul pulsante Stampa . Accedere al menu Proprietà e fare clic sulla finestra colore corrispondente al livello contenente il disegno da lavorare. Impostate i parametri di fabbricazione nel pannello Strumenti come specificato nella Figura supplementare S2.
- Disattivate i livelli indesiderati selezionando l'opzione Nessuno (None ) nel menu a discesa Strumenti .
- Fresatura di fori
- Passare alla punta da 800 μm. Attivate il livello di progettazione dei fori di diametro 1,2 mm facendo clic sulla finestra di colore corrispondente.
- Ripetete il punto 1.3.2., ma in questo caso impostate i parametri di fabbricazione corrispondenti come descritto nella figura supplementare S3A per i fori.
NOTA: La profondità dei fori lavorati è la metà dello spessore acrilico. - Lavorare due fori aggiuntivi sugli angoli controlaterali del rettangolo per l'allineamento dell'acrilico in modo invertito su una nuova piattaforma (Figura 4B). Staccare il rettangolo acrilico dalla piattaforma piezoelettrica. Capovolgere l'acrilico e fissarlo con nastro biadesivo sopra l'adattatore con i pilastri lavorati (Figura 4C,D).
- Aprire il file con il disegno dei fori per la faccia opposta rispetto al software di progettazione (file di progettazione supplementare 2). Impostare i parametri di fabbricazione corrispondenti come descritto nella figura supplementare S3B. Fresare la metà rimanente dei fori di ingresso e uscita del reagente con un diametro di 1,5 mm e una profondità di 0,7 mm (figura supplementare S3C).
Figura 1: Posizionamento della fresa a punta . (A) Le punte da 200 μm e 800 μm sono posizionate e fissate tramite una vite al supporto in acciaio. (B) Ogni punta di fresatura è collocata nell'apposito vano della microfresatrice per la selezione automatica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Piattaforma piezoelettrica. La piattaforma è fabbricata mediante stampa 3D ed è costituita da due basi esagonali unite da cerniere che consentono uno spostamento fine nell'asse z controllato da tre attuatori piezoelettrici. Si osserva anche un adattatore acrilico, sul quale è fissato il rettangolo in PMMA e che consente di impostare l'angolo di allineamento delle coordinate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: calibrazione dell'asse Z. Le fasi della calibrazione dell'asse z sono dettagliate. (A) Il sensore z include un cavo che si collega alla microfresatrice. (B) Il sensore viene posizionato direttamente sulla superficie da lavorare. (C) Il perno di rilevamento è costituito da una barra metallica posta in un compartimento speciale accanto alle punte del mulino. (D) Quando entrambi gli accessori entrano in contatto, la microfresatrice calcola automaticamente la coordinata di origine sull'asse z. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Superficie acrilica rettificata . (A) La punta a punta da 200 μm di diametro spazza l'intera superficie del rettangolo acrilico, rimuovendo uno strato alto circa 30 μm. (B) L'immagine mostra le diverse strutture fresate sulla faccia dell'acrilico precedentemente rettificato. Si osservano canali e fori per l'ingresso e l'uscita del reagente. La restrizione di 5 μm non può essere vista ad occhio nudo. (C) Superficie microfresata con fori di allineamento e adattatore con pilastri di allineamento agli angoli opposti. (D) L'acrilico è allineato capovolto sull'adattatore con pilastri, in cui si inseriscono i fori di allineamento. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Sigillatura del canale
- Pulizia in acrilico
- Rimuovere il rettangolo acrilico dalla piattaforma adattatore del pilastro. Prendi un altro rettangolo acrilico non lavorato. Lavare entrambi i fogli acrilici con alcool isopropilico (IPA) e risciacquare con acqua distillata. Indossare guanti ed evitare il contatto con l'alcool isopropilico.
- Immergere l'acrilico in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti (Figura 5A,B).
- Esposizione gassosa al cloroformio
- Asciugare perfettamente entrambi i fogli acrilici. Fissarli all'interno di un coperchio di una piastra di Petri di vetro con nastro biadesivo. Assicuratevi di posizionare il lato del canale lavorato esposto (Figura 5C). Indossare guanti ed evitare di toccare direttamente la superficie acrilica.
- Posizionare la base della capsula di Petri in vetro all'interno di una capsula di Petri di vetro più grande (Figura 5D). Versare 1 mL di cloroformio nella base della capsula di Petri. Posizionare rapidamente il coperchio con i fogli acrilici attaccati al lato interno.
- Aggiungere immediatamente acqua distillata alla base della capsula di Petri più grande fino al livello del coperchio della capsula di Petri. Consentire l'esposizione dell'acrilico al cloroformio gassoso per 1 minuto (Figura 5E).
NOTA: Considerare che un tempo di esposizione più lungo al cloroformio attaccherà la superficie acrilica e la restrizione di 5 μm si scioglierà, modificando la sua altezza o scomparirà completamente. - Inclinare la capsula di Petri per rompere il sigillo d'acqua creato. Rimuovere immediatamente l'acrilico dal cloroformio scoprendo la capsula di Petri. Fare attenzione a non versare l'acqua.
ATTENZIONE: Eseguire questo processo nella cappa aspirante e utilizzare guanti poiché il cloroformio è altamente tossico.
- Incollaggio mediante pressatura e riscaldamento
- Sbucciare entrambe le lastre acriliche dal nastro biadesivo.
- Allineare entrambi gli acrilici con i lati che sono stati esposti al cloroformio gassoso faccia a faccia, formando un sandwich. Posizionare gli acrilici nella pressa a 18 kgf/cm2 e ad una temperatura di 90 °C (Figura 5F,G).
NOTA: Si consiglia di posizionare l'acrilico allineato longitudinalmente e cambiare il suo allineamento dopo 2 minuti per una migliore tenuta. Se, dopo questo tempo, il sigillo è insufficiente, rimetterlo nella pressa per intervalli non superiori a 1 minuto. Utilizzando lo stereoscopio, controllare lo stato dei canali e la restrizione. Si consideri che, in caso di superamento del tempo di pressatura, c'è il rischio di eliminare la restrizione.
- Attacco del tubo flessibile
- Tagliare 2-3 cm di lunghezza del tubo. Fai un taglio completamente dritto. Fissare ciascun tubo flessibile ai fori del dispositivo con adesivo liquido ad asciugatura istantanea (Figura 6A). Evitare che l'adesivo penetri all'interno del chip.
Figura 5: Processo di sigillatura del dispositivo. (A) Ciascuno dei fogli acrilici viene posto in un sacchetto richiudibile con acqua distillata e immerso nel bagno ad ultrasuoni. (B) L'immagine a sinistra mostra i canali subito dopo la fabbricazione e l'immagine a destra mostra lo stesso dispositivo dopo il lavaggio con IPA e il bagno ad ultrasuoni, che rimuove tutte le impurità e i residui acrilici dal microcanale. Si osservano i bordi della restrizione che interrompe il canale centrale di 200 μm, il che conferma il successo del processo di fresatura. Barre della scala = 500 μm. (C) Entrambi gli acrilici vengono essiccati e fatti aderire alla piattaforma di vetro sul coperchio. (D) La base della capsula di Petri è posta all'interno di un'altra capsula di diametro maggiore. (E) Quando si chiude la capsula di Petri, la guarnizione ad acqua impedisce la fuoriuscita di cloroformio gassoso. (F) Descrizione degli elementi della leva con un peso di 5 kg. (G) Immagine della leva aperta, che mostra in rosso la zona in cui è collocato l'acrilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Preparazione del dispositivo
- Riempire i canali con acqua distillata usando una siringa. Assicurarsi che non ci siano perdite o resistenza al flusso. Immergere il dispositivo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti per rimuovere eventuali residui di materiale acrilico, adesivo o indesiderato all'interno dei canali.
- Svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo. Utilizzare una siringa per introdurre una soluzione bloccante preparata con albumina sierica bovina (BSA) al 5% (p/v) diluita in 1x soluzione salina tamponata con Tris (TBS) e precedentemente filtrata attraverso un filtro a siringa in polietersulfone (PES) da 0,2 μm.
- Preparare una sospensione di microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro in BSA al 5%.
NOTA: Le microparticelle sono precedentemente funzionalizzate con uno strato di silice-polietilenglicole (PEG) che conferisce resistenza all'assorbimento proteico4. - Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Se possibile, consentire il blocco notturno a 4 °C.
4. Formazione di trappole di microparticelle
- Inserire le microparticelle nel chip con un ago della siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale. Posizionare il chip verticalmente e consentire alle microparticelle di fluire sotto l'effetto della gravità attraverso il canale laterale. Ruotare il chip di 180° in due fasi di 90° e consentire alle microparticelle di mirare e compattarsi alla restrizione di 5 μm.
- Rimuovere le microparticelle in eccesso ruotando per gravità di 45° verso il canale laterale.
- Tenere il dispositivo in posizione verticale per evitare di annullare la trappola delle microparticelle. Vedere la Figura 6B per un riepilogo del processo di formazione della trappola di microparticelle.
5. Dosaggio immunologico
- Preparazione delle nanoparticelle
- Prendere 2 μL della sospensione di nanoparticelle da 100 nm precedentemente coniugate con lisozima (modello di antigene). Aggiungerlo a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 100 μL di soluzione bloccante. Incubare per una notte a 4 °C.
- Aggiungere 150 μL di tampone di lavaggio (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Collocare la provetta da microcentrifuga da 1,5 mL in un separatore magnetico. Conservare per 15 minuti per consentire la separazione delle nanoparticelle (Figura supplementare S4).
NOTA: il volume minimo per il separatore magnetico è di 200 μL. Evitare di utilizzare un volume inferiore. - Rimuovere il liquido dal tubo con una micropipetta. Evitare il contatto con la parete del tubo in cui si è formato il pellet di nanoparticelle.
- Aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio fresco. Tenere il tubo sotto agitazione per 15 minuti.
- Ripetere i passaggi 5.1.3.-5.1.5. 2x di più, agitando solo per 5 min.
- Aggiungere la concentrazione desiderata di anticorpi anti-lisozima primario (vedere la Tabella dei materiali). Regolare a un volume finale di 100 μL nel diluente anticorpale (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Incubare per 15 min a 37 °C. Continuare a agitare per altri 15 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere le fasi di lavaggio 5.1.2.-5.1.6.
- Aggiungere 100 μL di diluente anticorpale. Aggiungere l'anticorpo secondario accoppiato con perossidasi di rafano (HRP-AbII) (vedere la Tabella dei materiali) ad una diluizione di 1:500.
- Ripetere le fasi di lavaggio 5.1.2.-5.1.6.
- Mantenere le nanoparticelle in un volume finale di 50 μL di diluente anticorpale.
6. Montaggio sperimentale
- Riempire le due siringhe di vetro da 100 μL con acqua, collegare un tubo lungo 6,5 cm a ciascuna siringa, inserire un perno metallico all'estremità del tubo e posizionare entrambe le siringhe sulla pompa a siringa controllata da computer.
- Sigillare tutti i tubi del dispositivo acrilico con calore.
- Tagliare il tubo di ingresso e mantenere solo pochi millimetri. Riempire l'ago di erogazione con tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo tagliato. Lasciare gocciolare la soluzione prima di collegare l'ago al dispositivo per impedire l'accesso dell'aria al dispositivo.
- Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale. Collegare alla pompa della siringa. Quindi, eseguire la stessa procedura per il tubo di uscita del canale principale.
NOTA: è fondamentale eseguire i passaggi da 6.3.-6.4. in questo ordine per evitare di disimballare la trappola delle microparticelle. Se possibile, verificare lo stato della trappola durante questi passaggi con l'aiuto di una lente d'ingrandimento. - Posizionare un vetrino sul palco del microscopio. Attaccare il magnete alla diapositiva con nastro biadesivo e posizionare un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato per fissare i bordi del chip al vetro.
- Impostare una portata di 50 μL/h attraverso le schede Portata e Unità nel controller della pompa a siringa. Selezionare la modalità di prelievo e fare clic sul pulsante Start per attivare il flusso del tampone di lavaggio.
- Con attenzione, avvicinare il dispositivo verso la slitta con il magnete in modo orizzontale in modo che l'area del chip contenente la trappola entri in contatto con il magnete.
- Attaccare i bordi del dispositivo al vetro con nastro biadesivo per impedire il movimento. Evitare di ostruire il percorso ottico per la microscopia (Figura 6C).
Figura 6: Configurazione finale del dispositivo . (A) Dispositivo acrilico con i tubi flessibili collegati agli ingressi e alle uscite corrispondenti. La scala mostra le dimensioni del dispositivo in centimetri. (B) Protocollo per la formazione della trappola per microparticelle. Le microparticelle fluiscono attraverso il canale per gravità quando il dispositivo è posto in posizione verticale. Le microparticelle sono concentrate alla restrizione di 5 μm. Le microparticelle in eccesso vengono facilmente rimosse ruotando il chip attraverso il canale laterale. Il chip viene mantenuto verticale per preservare la trappola prima del test immunologico. (C) Dispositivo microfluidico montato su un vetrino contenente il magnete, sul palco del microscopio a fluorescenza invertita. Si osserva l'ago di erogazione attraverso il quale vengono aggiunti i reagenti, così come i tubi di uscita che si collegano a una pompa a siringa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
7. Immunorilevamento
- Mantenere il tampone di lavaggio in funzione per 10 minuti a 50 μL/h per rimuovere l'eccesso di BSA.
- Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago erogatore con una micropipetta. Aggiungere 50 μL della sospensione di nanoparticelle.
- Far scorrere la sospensione di nanoparticelle per 7 minuti ad una portata di 100 μL/h. Successivamente, modificare la portata a 50 μL/h e portare per altri 15 minuti.
- Cambiare l'ago di erogazione. Far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti a 50 μL/h. Preparare il substrato fluorogenico secondo le specifiche del produttore durante la fase di lavaggio.
- Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago erogatore con una micropipetta. Aggiungere 100 μL del substrato fluorogenico (vedere la tabella dei materiali). Far fluire il substrato fluorogenico per 6 minuti a 50 μL/h.
- Impostare i parametri di misurazione della portata (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h ) e del tempo (6 min) nelle corrispondenti schede Portata e Imposta timer dell'interfaccia che controllano la pompa a siringa. Assicurarsi di selezionare Modalità di prelievo per ciascuna delle misurazioni da eseguire.
- Impostare una linguetta Portata aggiuntiva a 50 μL/h e impostare Timer su 3 minuti per la fase di lavaggio.
- Accendere la fluorescenza del microscopio 15 s prima che il substrato a 50 μL/h si fermi. Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 s prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi. Eseguire l'imaging per 6 minuti a 1 fotogramma/s (FPS).
- Fare clic sul pulsante Start del parametro della portata desiderata immediatamente dopo l'arresto della portata di lavaggio del substrato a 50 μL/h. Fare clic sul pulsante Start del flusso di lavaggio (50 μL/h) immediatamente dopo l'arresto del flusso di misura selezionato.
- Interrompere l'acquisizione dell'immagine e spegnere la fluorescenza del microscopio per evitare il fotosbiancamento del substrato.
- Ripetere i passaggi 7.8.-7.10. per ogni portata di misura utilizzata.
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Representative Results
È stato possibile stabilire un protocollo di fabbricazione altamente riproducibile che migliora la risoluzione della tecnica di microfresatura convenzionale. Utilizzando questo protocollo, si ottiene la fabbricazione di un canale di soli 5 μm di altezza che funziona come una restrizione sfalsata in un canale alto 200 μm. Il design semplice della restrizione sfalsata cattura microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro che, una volta compattate nel microcanale, consentono la creazione di una trappola magnetica quando un magnete esterno si avvicina al dispositivo. Questo dispositivo consente di eseguire saggi immunologici utilizzando nanoparticelle coniugate con l'analita di interesse come supporto immunologico. In questo lavoro, sono stati eseguiti saggi immunologici indiretti non competitivi con rilevamento basato su anticorpi marcati con enzimi. L'antigene modello (Ag) era una proteina lisozima coniugata a nanoparticelle (NP) di diametro di 100 nm. L'anti-lisozima di coniglio IgG è stato utilizzato come anticorpo primario (AbI) e il rilevamento è stato eseguito utilizzando l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano di coniglio (HRP-AbII).
Il rilevamento è stato eseguito correlando la variazione dell'intensità del segnale di fluorescenza ottenuta dopo l'interazione dell'HRP-AbII con un substrato fluorogenico al passaggio attraverso la trappola con nanoparticelle intrappolate. Per eseguire le misurazioni, sono state determinate una regione prima e una regione dopo l'abbondanza. La figura 7A-D mostra l'aumento dell'intensità della fluorescenza per diverse concentrazioni di anti-lisozima AbI: 0 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1.000 ng/mL per una data portata del substrato fluorogenico (3 μL/h). Ciò dimostra che la variazione della fluorescenza del substrato è direttamente proporzionale alla concentrazione di AbI utilizzata.
Figura 7: Aree di misurazione della fluorescenza. Le misure di fluorescenza sono mostrate per diverse concentrazioni di anticorpi anti-lisozima primario utilizzati: (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL, (C) 100 ng / mL e (D) 1.000 ng / mL. I cerchi blu mostrano l'area di misurazione della fluorescenza prima e dopo la trappola formata dalla restrizione di altezza di 5 μm, dove il substrato reagisce con l'anticorpo secondario coniugato HRP. Tutte le immagini corrispondono a un flusso di 3 μL/h. Abbreviazione: HRP = perossidasi di rafano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tuttavia, per una data concentrazione di AbI, il livello di fluorescenza ottenuto è funzione della portata utilizzata per il substrato fluorogenico. Pertanto, la capacità di conversione di questo substrato da parte dell'enzima HRP è inversamente proporzionale alla portata. Sono state valutate diverse portate del substrato di 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h. Per ogni esperimento sono state ottenute le curve corrispondenti alla differenza di fluorescenza data dal substrato prima e dopo il passaggio attraverso la trappola magnetica. La figura 8A-C mostra le curve ottenute per una concentrazione di 100 ng/mL per tre diverse portate: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h e (C) 1 μL/h. A seconda della portata utilizzata, la capacità di conversione del substrato da parte dell'anticorpo secondario coniugato HRP posto nella trappola magnetica varia. La curva verde rappresenta l'intensità di fluorescenza del substrato dopo la conversione da parte dell'HRP situato nella trappola. Si può vedere che, a flussi più elevati, il livello massimo di fluorescenza ottenuto decade. La curva rossa rappresenta la fluorescenza basale prima che il substrato raggiunga la trappola. La misurazione della fluorescenza del substrato in quest'area della trappola rimane costante e il suo valore dipende dal grado di interazioni non specifiche se non vi è alcun blocco efficiente della superficie del canale. Abbiamo calcolato la differenza tra le due curve, rappresentata dalla curva blu.
Figura 8: Curve di fluorescenza. Grafici ottenuti ad una concentrazione di 100 ng/mL di anticorpo primario e portate di (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h e (C) 1 μL/h. Le tre curve colorate rappresentano la fluorescenza misurata prima della trappola (curva rossa) e dopo la trappola (curva verde) e la differenza tra le due (curva blu) nel tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La figura 9A-C integra le curve di differenza di fluorescenza misurate prima e dopo l'immunoreazione per i diversi flussi per le concentrazioni di AbI di (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL e (C) 1.000 ng / mL. La misura per una portata di 0 μL/h indica la misurazione dell'immunoreazione in condizioni statiche in cui governa la diffusione. Per una concentrazione di 1.000 ng/mL, la fluorescenza satura per tutti i flussi valutati. Tuttavia, il modello sfalsato di fluorescenza ai diversi flussi è dovuto alla diffusione del substrato, che reagisce con un tasso di conversione così elevato da superare i flussi più piccoli. Quindi, c'è un ritorno di questa fluorescenza nella zona a monte della trappola.
Figura 9: Rapporti di differenza di fluorescenza. Curve riassuntive delle differenze di fluorescenza (dopo-prima) per i diversi flussi utilizzati a (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL e (C) 1.000 ng/mL. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le misurazioni ottenute con questo dispositivo consentono di generare una curva di calibrazione standard per i saggi immunologici eseguiti con lisozima come antigene modello. La figura 10 mostra la curva di taratura ottenuta dai valori massimi delle differenze tra la fluorescenza prima e dopo l'immunoreazione eseguita nella trappola magnetica. Questo protocollo consente la rilevazione dell'anticorpo primario anti-lisozima con concentrazioni nell'ordine dei nanogrammi per millilitro utilizzando flussi compresi tra 1 μL/h e 10 μL/h. L'elevata variabilità e gli alti livelli di fluorescenza a 1 μL/h suggeriscono che la reattività dell'immunocomplesso è tale che questa velocità non favorisce il flusso del substrato reagente e tende ad accumularsi subito dopo la trappola, oltre al fatto che la resistenza del dispositivo riduce la risoluzione del dispositivo per questa portata.
Figura 10: Curva di calibrazione. Il grafico mostra il valore massimo delle differenze di intensità di fluorescenza delle curve ottenute rispetto alla concentrazione di anticorpi primari utilizzati (AB1) per ciascuna portata. I/Isat corrisponde al rapporto tra il valore di fluorescenza ottenuto per ciascuna misura di fluorescenza (I), normalizzato rispetto al valore massimo di fluorescenza raggiunto al momento della saturazione (Isat). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Interfaccia controller della piattaforma piezoelettrica. L'immagine a sinistra mostra l'interfaccia che controlla lo spostamento dell'asse z della piattaforma piezoelettrica. La restrizione viene creata sollevando la piattaforma attraverso l'applicazione di tensione a tre attuatori piezoelettrici. L'immagine a destra mostra l'interfaccia del software che controlla la microfresatrice, dove è possibile osservare le coordinate precise negli assi x e y dove viene lavorata la restrizione ad una velocità di 11.000 giri/min. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Progettazione del dispositivo. Il design del dispositivo creato utilizzando il software di progettazione è visibile sulla sinistra. Il design è costituito da due canali collegati, uno è il canale principale che contiene il limite di altezza di 5 μm e l'altro è il canale laterale per l'uscita dei rifiuti. I canali sono microfresati con una punta da 200 μm. Il pannello a destra mostra i parametri di fabbricazione. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Parametri di microfresatura dei fori di ingresso e di uscita. (A) Fori di 1,2 mm di diametro e 0,65 mm di profondità (metà dello spessore acrilico) sono microfresati sulla faccia lavorata. Il pannello a destra mostra i parametri di velocità di spostamento, rotazione e profondità della punta della fresa. (B) Fori di 1,5 mm di diametro e 0,7 mm di profondità sono microfresati sulla faccia opposta che collega i fori. Il pannello a destra mostra i parametri di fabbricazione. Entrambe le casse sono microfresate con una fresatrice da 800 μm. (C) I fori di ingresso e di uscita del reagente (a sinistra) vengono mostrati dopo aver lavorato entrambe le facce. Le dimensioni della metà di diametro maggiore consentono di accoppiare il tubo, mentre la barriera creata dalla metà di diametro inferiore impedisce al tubo di bloccare gli ingressi. Barre della scala = 1 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Separazione delle nanoparticelle. Utilizzando un separatore magnetico commerciale, le nanoparticelle da 100 nm possono essere facilmente concentrate per eseguire le fasi di lavaggio durante il test immunologico. Il pellet formato dopo 15 minuti viene osservato nel cerchio rosso. Clicca qui per scaricare questo file.
Supplemental Coding File 1: Codice per la levigatura acrilica delle superfici. Il codice generato viene mostrato con le istruzioni per la rettifica della superficie acrilica di 25 mm x 9 mm lungo gli assi x e y. L'ultima riga del codice posiziona la punta del trapano proprio in corrispondenza della coordinata in cui verrà lavorato il vincolo. Clicca qui per scaricare questo file.
File di progettazione supplementare 1: Progettazione dei fori di ingresso e uscita del microcanale e del reagente. Il design contiene due strati di diverse strutture colorate (canali neri e buchi rossi) che vengono lavorati sulla faccia acrilica precedentemente rettificata. Clicca qui per scaricare questo file.
File di progetto supplementare 2: progettazione dei fori sul lato opposto. Il design è costituito da fori di diametro maggiore per la faccia opposta che comunicano con i precedenti e servono a fissare i tubi. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici utilizzando nanoparticelle come supporto immunologico è stato fabbricato utilizzando una tecnica di microfresatura. Il metodo di produzione diretta sul substrato ha il vantaggio di evitare l'utilizzo di uno stampo master e i tempi e i costi che questo comporta. Tuttavia, è limitato alla prototipazione rapida e alla produzione di dispositivi ad alto volume.
Qui, abbiamo utilizzato una piattaforma piezoelettrica accessoria precedentemente segnalata per la fresatrice12. La piattaforma è stata fabbricata mediante stampa 3D per creare canali a profondità variabile con una risoluzione verticale migliore rispetto alla risoluzione di 10 μm delle microfresatrici convenzionali. Abbiamo ottenuto la fresatura di canali alti fino a 5 μm che formano una restrizione sfalsata nel canale microfluidico da 200 μm.
Per la fabbricazione del dispositivo microfluidico sono necessarie solo due punte di fresatura di 200 μm e 800 μm di diametro, senza alcuna necessità di cambiare manualmente le punte. Il modello di fresatrice utilizzato esegue automaticamente lo scambio di punte, il che aiuta nell'ottimizzazione del tempo. Inoltre, la modalità "Z0 sensing" consente la determinazione dell'origine automaticamente nell'asse z con elevata precisione contattando il sensore e il perno inclusi nella fresatrice.
Il design di questo dispositivo è semplice, costituito solo dal canale principale interrotto da una restrizione sfalsata di 5 μm e da un canale accessorio che funge da spurgo e ingresso per microparticelle. Tuttavia, l'elevata precisione di tali strutture è necessaria per la restrizione di intrappolare microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro. Una restrizione maggiore consente alle microparticelle di passare attraverso senza ritenzione, il che impedisce la loro cattura e la formazione della trappola delle microparticelle. Al contrario, una restrizione più piccola aumenta notevolmente la resistenza al flusso del canale e fa sì che i reagenti escano attraverso il canale laterale invece di passare attraverso il mezzo poroso di microparticelle. L'uso di microparticelle di diametro maggiore per formare la trappola magnetica consentirebbe di fare una restrizione maggiore. Ad esempio, le particelle con un diametro di 40 μm necessitano di una restrizione sfalsata di ~30 μm. In tal caso, non è necessario utilizzare la piattaforma piezoelettrica e il protocollo di fabbricazione è semplificato. Tuttavia, un mezzo poroso composto da microparticelle più grandi intrappolerebbe le nanoparticelle in modo diverso e avrebbe un impatto sulle prestazioni del saggio immunologico; Tuttavia, non è chiaro se sarebbe per il meglio o il peggio. Sono in corso lavori per studiare queste caratteristiche per ottimizzare il dispositivo7.
Per ottenere la precisione richiesta, è stata eseguita la rettifica superficiale per rimuovere uno strato di 30 μm della superficie acrilica spostando la punta da 200 μm attraverso l'intera superficie acrilica a 14.500 giri / min. Questo processo consente di ottenere una nuova origine sull'asse z lungo l'intera superficie per una maggiore precisione in altezza. È fondamentale allineare sempre l'acrilico nella stessa posizione in modo che le coordinate di origine sugli assi x e y (precedentemente impostate) coincidano con uno degli angoli dell'acrilico. Allo stesso modo, si dovrebbe assicurarsi che l'acrilico sia perfettamente posizionato sulla base; In caso contrario, la superficie potrebbe non usurarsi correttamente, causando problemi nelle seguenti fasi di assemblaggio.
Una volta completato il processo di rettifica superficiale, il programma porta automaticamente la punta della fresa a una coordinata specifica in cui verrà lavorato il vincolo di 5 μm che forma l'intrappolamento. È fondamentale evitare che la punta della fresa si sollevi dalla superficie una volta raggiunta questa coordinata. Si consiglia di identificare se la microfresatrice dispone di un'opzione che impedisce alla punta di fresatrice di staccarsi dalla superficie una volta terminato il processo di rettifica. In caso contrario, sarà necessario riposizionare manualmente la fresa su questa coordinata, il che potrebbe causare errori di precisione della posizione.
Per lavorare la restrizione sfalsata nell'acrilico, è necessario sovradimensionare di 1,5 μm. Per un'altezza di 5 μm, la piattaforma piezoelettrica è stata sollevata a 6,5 μm perché il microcanale tende ad appiattirsi un po 'nel processo di sigillatura dei canali. Inoltre, la lunghezza finale della restrizione nel dispositivo è di soli 50 μm; Tuttavia, viene lavorato più a lungo per garantire che comunichi con entrambe le estremità del canale principale quando viene lavorato successivamente. In una fase, i canali profondi 200 μm vengono fabbricati utilizzando la punta da 200 μm di diametro e una velocità di rotazione di 11.000 giri/min. Pertanto, la lavorazione dei canali larghi 200 μm in acrilico richiede solo pochi secondi.
Il prossimo passo nella fabbricazione del dispositivo è quello di lavorare i fori che collegano i canali all'esterno. Questi fori vengono utilizzati per posizionare i tubi flessibili che consentono al dispositivo di essere facilmente collegato alla pompa a siringa che lo aziona. Uno dei problemi riscontrati qui è il posizionamento dei tubi. Una distanza ottimale è fondamentale per consentire il flusso dei reagenti ed evitare di creare una tenuta con la faccia dell'acrilico non lavorato. Per ovviare a questo inconveniente, i fori vengono lavorati in due fasi per creare un limite in cui i tubi non superino la profondità desiderata.
Con la fresatrice da 800 μm, il modello dei fori è stato fresato sulla stessa faccia precedentemente microfresata. I fori sono lavorati all'estremità di ciascun canale con un diametro di 1,2 mm e una profondità di 0,65 mm, che è la metà dello spessore dell'acrilico. Inoltre, due fori sono lavorati negli angoli controlaterali del rettangolo, che consentono di allineare l'acrilico a faccia in giù sulla piattaforma con pilastri. È importante utilizzare un raschietto o un cutter per rimuovere l'acrilico dalla piattaforma piezoelettrica per evitare di romperlo. Sul lato opposto dell'acrilico, il diametro dei fori è di 1,5 mm (più grande della metà precedente), che è uguale al diametro del tubo da fissare. La profondità è di 0,7 mm e deve essere leggermente superiore alla metà del foro frontale anteriore per garantire che entrambi i fori lavorati comunichino tra loro. La barriera formata dal foro di diametro inferiore impedisce al tubo di raggiungere il fondo e bloccare l'ingresso. Questa implementazione nel protocollo migliora notevolmente il posizionamento dei tubi di ingresso e uscita del fluido sul chip.
Un passo fondamentale nella produzione dei dispositivi è la sigillatura. È necessario sigillare la faccia che contiene i canali lavorati con una copertura acrilica non lavorata con le stesse dimensioni. La sigillatura dei fogli con un metodo che non si avvicina alla temperatura di transizione vetrosa dell'acrilico consente di ottenere canali privi di deformazioni. Attraverso il metodo di incollaggio utilizzato, un sottile film di solvente tra i due fogli di PMMA dissolve un film sottile dalla superficie del foglio di PMMA, quindi evapora e infine ricollega i monomeri dei fogli di PMMA a una specifica temperatura operativa.
Il metodo ampiamente descritto di esposizione al vapore di cloroformio è stato utilizzato per sigillare questo dispositivo acrilico. Come precedentemente riportato in letteratura, il cloroformio fornisce un'elevata forza di legame; Tuttavia, poiché il cloroformio attacca l'acrilico in modo molto aggressivo, l'acrilico non dovrebbe mai entrare in contatto diretto con il cloroformio liquido, ma solo con il cloroformio gassoso. È essenziale mantenere una distanza ottimale tra il cloroformio evaporante e l'acrilico. Abbiamo creato un semplice sistema utilizzando una piastra di Petri di vetro, in cui l'acrilico è stato aderito al coperchio. È stata utilizzata una piattaforma composta da nove vetrini uniti e attaccati al coperchio della piastra di Petri, su cui gli acrilici sono stati fatti aderire con nastro biadesivo per regolare la distanza. Sebbene il processo di cloroformio gassoso sia molto sensibile alle variazioni della temperatura ambiente, la temperatura delle piastre di Petri può essere controllata posizionandole all'interno di una scatola di polistirolo. Il sigillo d'acqua impedisce al cloroformio di evaporare troppo rapidamente.
Al contrario, ci sono altri metodi di giunzione segnalati che sono più veloci e non richiedono attrezzature speciali; Tuttavia, alcuni sono adatti solo per unire due fogli acrilici senza lavorazione. Allo stesso modo, è difficile controllare la forza di adesione poiché il solvente deve essere versato direttamente tra i due fogli acrilici18, con un alto rischio di fusione di strutture di piccole dimensioni come la restrizione micromillata di 5 μm.
Utilizzando il protocollo qui descritto, sono state ottenute guarnizioni omogenee con una pressa fatta in casa, con la quale sono state controllate la pressione e la temperatura di tenuta. Per la costruzione di questa pressa, sia una struttura in alluminio che una cerniera creano una leva che amplifica la forza meccanica proveniente da un peso di 5 kg ad un fattore di 9:1. Gli elementi riscaldanti trasferiscono il loro calore su lastre di alluminio spesse 2 cm che sono a contatto con i pezzi acrilici.
Una volta sigillati gli strati acrilici, l'ultimo passo nel processo di fabbricazione consiste nel collegare i tubi esterni agli ingressi e alle uscite corrispondenti del dispositivo. L'adesivo liquido viene applicato esternamente una volta che i tubi sono all'interno dei fori. Se il diametro del tubo è inferiore ai fori, l'adesivo liquido può entrare nel dispositivo, intasando i canali.
I metodi di fabbricazione diretta sul substrato, come la microfresatura, presentano alcuni svantaggi, come la rugosità della superficie lavorata e le strutture con bordi scarsamente delimitati9. Nonostante la rugosità della superficie lavorata dei canali, non è necessario alcun trattamento aggiuntivo per questo dispositivo. Un punto importante da notare su questo protocollo di legame è che il cloroformio consente di ridurre la rugosità dei microcanali fresati lucidando le superfici esposte al solvente. La lucidatura della superficie è così buona che anche la qualità ottica è migliorata19.
Quando il dispositivo è stato fabbricato, deve essere preparato per essere utilizzato in un test immunologico. Il lavaggio ad ultrasuoni del dispositivo è di grande importanza per rimuovere eventuali detriti acrilici indesiderati che potrebbero ostruire i canali e interferire con il test immunologico.
Inoltre, è necessario prestare particolare attenzione al corretto blocco dei canali per evitare interazioni non specifiche e segnali di rumore di fondo elevati. È stato dimostrato che il blocco con BSA al 5% riduce il rumore del legame non specifico degli anticorpi nei canali e 1 ora di incubazione è sufficiente. Le microparticelle di ferro sono rivestite con uno strato di silice-PEG per impedire il legame non specifico in esse. Inoltre, le microparticelle vengono bloccate con BSA (contemporaneamente ai canali) prima di formare la trappola nel dispositivo. L'incubazione notturna a 4 °C è migliore, il che significa che è necessario 1 giorno per la fabbricazione e l'incubazione del dispositivo prima del test immunologico. La riduzione della rugosità da parte del cloroformio e il blocco delle superfici per ridurre le interazioni non specifiche hanno dimostrato di funzionare eccezionalmente bene, consentendo a questa piattaforma di raggiungere un limite di rilevazione paragonabile all'ELISA standard in un test immunologico modello4.
La formazione della trappola di microparticelle nella restrizione del microcanale è un processo manuale. Sebbene non esista un controllo preciso del numero di microparticelle che entrano, ci basiamo su una stima della lunghezza delle particelle compattate. È possibile rendere la trappola più grande o rimuovere facilmente l'eccesso. Le particelle scartate si accumulano nel canale laterale e non devono essere rimosse dal chip. È fondamentale impedire alle microparticelle di fluire nel canale principale, poiché possono interagire con le nanoparticelle a monte della trappola e modificare le misurazioni del test immunologico.
Come prova di concetto, abbiamo implementato l'immunorilevazione di un complesso formato da proteina lisozima coniugata a nanoparticelle di diametro 100 nm mediante incubazione dell'anticorpo primario specifico e del corrispondente anticorpo secondario marcato con HRP. L'immunocomplesso si forma all'esterno del dispositivo. Tuttavia, è possibile eseguire l'intero test immunologico all'interno del dispositivo. Le proprietà magnetiche delle nanoparticelle consentono una facile manipolazione con un separatore a magneti permanenti al neodimio ad alte prestazioni. È sufficiente mantenere il microtubo di reazione per 15 minuti per consentire alle nanoparticelle di essere attratte dal magnete verso la parete del microtubo, il che facilita le fasi di lavaggio del test immunologico all'esterno del dispositivo.
Il punto forte di questo dispositivo è che è semplice, veloce (tempo di analisi totale di 40 min 4 rispetto a4-6 h per ELISA) ed economico (paragonabile al prezzo di un test a flusso laterale). Tutte queste caratteristiche rendono questo profilo del dispositivo un buon candidato per lo sviluppo di POCT. Inoltre, il dispositivo può rilevare quantitativamente concentrazioni di analiti simili al gold standard ELISA4, che è estremamente prezioso per gli studi epidemiologici e il processo decisionale nella salute pubblica. Di solito, i sistemi microfluidici per i saggi immunologici hanno buoni limiti di rilevazione ma lunghi tempi di analisi, o hanno tempi di analisi brevi ma limiti di rilevazione subottimali4. Combinando nanoparticelle magnetiche come supporto immunitario ed enzimi fluorogenici per il rilevamento, questa piattaforma ha un breve tempo di analisi e un buon limite di rilevamento (nel lavoro precedente, abbiamo trovato un limite di rilevazione di 8 pg / mL usando la biotina come antigene, che è paragonabile a un ELISA 4standard). Infine, questa tecnologia ha un importante vantaggio rispetto ai test a flusso laterale: la possibilità di dare risultati quantitativi e non solo qualitativi ("sì" o "no"). A differenza della maggior parte degli altri sistemi microfluidici sviluppati in laboratori in cui vengono utilizzati materiali rari, questo sistema è realizzato in acrilico (PMMA), un termoplastico a basso costo altamente compatibile con la produzione di massa di dispositivi diagnostici medici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Conacyt, Messico sotto sovvenzione 312231 del "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", e da AMEXCID e dal Ministero delle Relazioni Estere del Messico (SRE) sotto la sovvenzione "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO ringrazia Conacyt Mexico per la borsa di studio di dottorato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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