Ein klinisch relevantes Mausmodell der Peritonealfibrose mittels Dialysat und Kathetern

Zusammenfassung

Patienten mit schwerer Peritonealfibrose weisen eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Der Mechanismus der Peritonealfibrose ist unklar. In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches experimentelles Mausmodell der Peritonealfibrose, die durch die Injektion von Peritonealdialyseflüssigkeit induziert wird.

Zusammenfassung

Peritonealfibrose kann bei Patienten auftreten, die sich einer Peritonealdialyse (PD) unterziehen, und Patienten mit schwerer Peritonealfibrose haben eine hohe Morbidität und Mortalität. Peritonitis, Peritonealdialyseflüssigkeit mit hohem Glukosegehalt und eine lange Periode der Parkinson-Krankheit führen zum Ausbruch der Peritonealfibrose. Eine tierexperimentelle Studie zur Peritonealfibrose ist aufgrund der Einschränkungen von Human- und In-vitro-Studien erforderlich. Die meisten Tiermodelle ahmen jedoch keine klinischen Bedingungen nach. Um die Peritonealfibrose zu untersuchen, entwickelten wir ein klinisch relevantes Mausmodell, indem wir einen Peritonealkatheter implantierten und 2,5 % hochglukosereiche PD-Flüssigkeit plus 20 mM Methylglyoxal (MGO) täglich für 21 Tage in die Peritonealhöhle injizierten. Die Implantation des Peritonealkatheters vermeidet Peritonealverletzungen durch Nadeln und ahmt klinische Parkinson-Patienten nach. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass sich Myofibroblasten im fibrotischen Peritoneum anreicherten. Die Versuchsgruppe hatte ein geringeres Ultrafiltrationsvolumen und eine geringere Transportfunktion der Peritonealmembran (Peritonealgleichgewichtstest). In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll des Modells zur Verfügung.

Einleitung

Die Peritonealdialyse (PD) ist eine Art der Nierenersatztherapie, die von etwa 11 % der Patienten mit Niereninsuffizienz im Endstadium (ESRD) erhalten^{wird 1}. Studien haben gezeigt, dass sich bei Patienten, die PD² erhalten, eine Peritonealfibrose entwickelt. Die Verkapselung der Peritonealsklerose (EPS), einer schweren Form der Peritonealfibrose, führt zu einer hohen Morbidität und Mortalität³. Zu den Risikofaktoren für Peritonealfibrose gehören Peritonitis, Peritonealdialyseflüssigkeit mit hohem Glukosegehalt, eine lange Parkinson-Periode und genetische Faktoren⁴. Der Mechanismus der Peritonealfibrose beinhaltet komplexe Veränderungen in der peritonealen Mikroumgebung und die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen. In-vitro-Experimente und klinische Beobachtungen beschränken sich auf mechanistische Einblicke in die Peritonealfibrose, und es werden Tiermodelle benötigt. Versuchstiere wie Hunde, Kaninchen, Schweine, Ratten und Mäuse werden in der Regel in der Erforschung menschlicher Krankheiten⁵ eingesetzt, wobei Mäuse aufgrund ihrer geringen Größe, geringen Kosten und einfachen Experimente am häufigsten verwendet werden. Darüber hinaus können spezifische Zellen in Krankheitsmodellen von Mäusen mit Hilfe von Lineage-Tracing-Techniken untersucht werden.

Die Etablierung eines geeigneten Tiermodells wäre hilfreich, um die Pathophysiologie der Peritonealfibrose zu verstehen. Im Idealfall sollte dieses Modell kostengünstig sein, leicht zu reproduzieren sein und die Grundlage für die klinische Behandlung der Peritonealfibrose bilden.

Derzeit verfügbare Tiermodelle der Peritonealfibrose werden mit der intraperitonealen Injektion von hochglukosereicher Parkinson-Flüssigkeit täglich für 28 Tage, Chlorhexidingluconat (CG) dreimal wöchentlich für 3 Wochen oder einer Einzeldosis Natriumhypochlorithypochlorit ^6,7,8 etabliert. Diese Modelle haben jedoch Einschränkungen. Die Injektion von Parkinson-Flüssigkeit mit hohem Glukosegehalt ist zwar für die klinische Praxis von großer Bedeutung, induziert aber nur eine leichte Peritonealfibrose und lässt die klinischen Zustände einer schweren Peritonealfibrose, wie z. B. EPS, nicht rekapitulieren. CG oder Hypochlorit können durch chemische Schädigung eine schwere Peritonealfibrose induzieren, die EPS nachahmt⁹. CG und Hypochlorit können jedoch Peritonealschäden und Fibrose durch unterschiedliche Mechanismen von PD-Flüssigkeit mit hohem Glukosegehalt induzieren.

Diese Studie beschreibt das Protokoll zur Entwicklung eines murinen Modells der Peritonealfibrose. Bei diesem Modell wird zuerst ein PD-Katheter eingeführt, und dann werden 21 Tage lang tägliche Injektionen von hochglukosereicher PD-Flüssigkeit plus Methylglyoxal (MGO) durchgeführt. MGO ist ein toxisches Glukoseabbauprodukt in der Parkinson-Flüssigkeit und fördert die Bildung fortgeschrittener Glykationsendprodukte, die Entzündungen und Angiogenese induzieren^10,11. Die Zugabe von MGO zu einer PD-Flüssigkeit mit hohem Glukosegehalt induziert die Akkumulation von Myofibroblasten und fördert die Peritonealfibrose. Dieses Modell ahmt somit klinische Zustände nach.

Protokoll

Die Experimente wurden gemäß dem National Taiwan University College of Medicine und dem College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt. Alle Mäuse wurden unter Standardpflege untergebracht.

1. Tierversuch

1. Verwenden Sie männliche und weibliche C57BL/6-Wildtyp-Mäuse (WT), die älter als 11 Wochen sind.
2. Bereiten Sie das chirurgische Material vor, einschließlich eines französischen Silikonanschlusses für die Maus, Handschuhe, Abdecktücher, Katheter, Nähte und Nadeln.
3. Implantieren Sie den Mausanschluss wie folgt:
   1. Betäuben Sie die Mäuse mit Ketamin/Xylazin (100/10 mg/kg Körpergewicht) durch subkutane Injektion.
      1. Überprüfen Sie die Atemfrequenz und die Anästhesietiefe der Mäuse während der Operation, um die Anästhesiebedingungen sicherzustellen.
         HINWEIS: Wenn die Atemfrequenz der Mäuse schnell und kurz wird, fügen Sie 20% der vorherigen Dosis hinzu.
   2. Bringen Sie die Mäuse während der Narkose in Bauchlage. Rasieren und reinigen Sie für die Operation eine 2 cm x 3 cm große Fläche auf dem linken Rücken und desinfizieren Sie die Haut mit Povidon-Jod.
   3. Machen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt in der Haut auf dem linken Rücken.
   4. Präparieren Sie vorsichtig zwischen Haut und Muskeln auf dem linken Rücken, um einen Abstand von 1 cm x 2 cm für die Implantation des Mausports zu schaffen.
   5. Perforieren Sie ein kleines Loch über dem linken Rückenmuskel.
   6. Führen Sie den gesamten 4-französischen distalen Teil des Mausports in die Bauchhöhle ein
   7. Naht (4-0 Nylon) die Wurzel des Mausports mit dem Rückenmuskel.
   8. Stecken Sie den Kopf des Mausports zwischen die Haut und den Rückenmuskel.
   9. Verschließen Sie die Haut mit Reflexklammern (7 mm).
      HINWEIS: Reflexclips sind besser als Nähte, da Mäuse oft in die Wunde beißen.
   10. Starten Sie das Experiment nach 7 Tagen nach der Implantation des Mausports. Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Versuchs- und Kontrollgruppen ein.
   11. Desinfizieren Sie die Haut an der Zugangsstelle mit Povidon-Jod, bevor Sie Flüssigkeit injizieren.
   12. Injizieren Sie die PD-Flüssigkeit (PDF) Gruppe mit 2,5 % PD-Flüssigkeit und 20 mM MGO in insgesamt 2 mL intraperitoneal täglich für 21 Tage. Injizieren Sie der Kontrollgruppe normale Kochsalzlösung (NS).

2. Peritonealfunktionstest (Peritonealäquilibrierungstest)

1. Bereiten Sie 2,5 % PD-Flüssigkeit (2 ml) vor und messen Sie die Glukosekonzentration der PD-Flüssigkeit, definiert als anfängliche Glukosekonzentration (D0).
2. Injizieren Sie die PD-Flüssigkeit in den Mausanschluss.
3. Nach 30 Minuten töten Sie die Mäuse über eine Überdosierung von Isofluran (100%).
4. Sammeln Sie die intraabdominale Flüssigkeit mit einer Spritze und messen Sie dann das Flüssigkeitsvolumen, das als Ultrafiltrationsvolumen definiert ist.
5. Messen Sie die Glukosekonzentration der intraabdominalen Flüssigkeit, definiert als die endgültige Glukosekonzentration (D).
6. Berechnen Sie das Peritonealgleichgewicht oder die Peritonealfunktion¹².
   HINWEIS: Peritonealer Gleichgewichtstest¹² = Endgültige Glukosekonzentration in der PD-Flüssigkeit (D) / Anfängliche Glukosekonzentration in der PD-Flüssigkeit (D0). Die Glukosekonzentration wird durch das Hexokinase-Verfahren mit einem biochemischen Analysator¹³ nachgewiesen.

3. Gewebeaufbereitung und histologische Analyse

1. Entnehmen Sie das Bauchfellgewebe: rechte obere Bauchdecke (1 cm x 1 cm) und Leber. Fixieren Sie das Peritonealgewebe 2 h lang mit 4 % Paraformaldehyd und dann über Nacht in 18 % Saccharoselösung⁷.
2. Bereiten Sie 4 μm dicke Schnellschnitte des Peritonealgewebes vor und führen Sie die histologische Analyse durch, wie zuvor veröffentlicht⁷.
3. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch.
   1. Verwenden Sie primäre Antikörper gegen die folgenden Proteine für die Immunmarkierung: α-glattes Muskelaktin (SMA; 2 h, 1:200) zum Nachweis von Myofibroblasten, Cytokeratin (2 h, 1:200) zum Nachweis von Mesothelzellen und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (5 min, 1:1000) zum Nachweis von Zellkernen.
4. Geben Sie die erhaltenen Daten in einem geeigneten Format an.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden die Daten als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistischen Analysen wurden mit einer geeigneten statistischen Analysesoftware (Table of Materials) durchgeführt, und die statistische Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA oder einen t-Test bewertet.

Ergebnisse

Es wurde die Histologie des Peritonealgewebes untersucht, die zeigte, dass die Peritonealfibrose in der Gruppe PD fluid plus MGO (PDF) erfolgreich induziert wurde. Die Immunfluoreszenzfärbung des viszeralen Peritoneums der Leberoberfläche zeigte eine stärkere Akkumulation von Myofibroblasten im verletzten Peritoneum der PDF-Gruppe als in der Kontrollgruppe (Abbildung 1). Wie in Abbildung 2A gezeigt, hatte die PDF-Gruppe ein geringeres Ultrafiltrationsvolumen als...

Diskussion

Das Bauchfell besteht aus einem viszeralen und einem parietalen Bauchfell, das die Bauchorgane und Bauchwände bedeckt. Es besteht aus einer Monoschicht von Mesothelzellen, einer submesothelialen Schicht, Serosa, Fibroblasten, Lymphozyten und sezernierten Proteinen¹⁴. Unter Peritonealfibrose versteht man den Verlust und die Denudation von Mesothelzellen, die submesotheliale Verdickung und die Ansammlung vieler Entzündungszellen wie Myofibroblasten und Makrophagen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Weitspektrum-Cytokeratin-Antikörper	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemischer Analysator
DAPI, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-Antikörper	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapiert			jede
FITC-Ziege Anti-Kaninchen	Jackson ImmunoResearch Secondary Antikörper	111-095-144
Handschuhe			für
alle GraphPad Prizm	GraphPad	Software GraphPad Software 9.0
Handschuhe			für
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Maus Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Maus 4-Französischer Silikonanschluss
Monoklonales Anti-Aktin, α-glatte Muskulatur-Cy3 Antikörper	Sigma-Aldrich	C6198
Nadeln			beliebig
Reflex Clips 7 mm			beliebig
Naht 4-0 Nylon			beliebig