Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene

Zusammenfassung

Hierbei wird ein Verfahren beschrieben, um die Bindungsaffinität (K_D) von radioaktiv markierten Antikörpern an immobilisierte Antigene zu bestimmen. K_D ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, die aus einem Sättigungsbindungsexperiment bestimmt werden kann, indem die gesamte, spezifische und unspezifische Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers in verschiedenen Konzentrationen an sein Antigen gemessen wird.

Zusammenfassung

Die Bestimmung der Bindungsaffinität (K_D) ist ein wichtiger Aspekt bei der Charakterisierung radioaktiv markierter Antikörper (rAb). Typischerweise wird die Bindungsaffinität durch die Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_D dargestellt und kann als die Konzentration von Antikörpern berechnet werden, bei der die Hälfte der Antikörperbindungsstellen im Gleichgewicht besetzt ist. Diese Methode kann auf jeden radioaktiv markierten Antikörper oder andere Protein- und Peptidgerüste verallgemeinert werden. Im Gegensatz zu zellbasierten Methoden ist die Wahl immobilisierter Antigene besonders nützlich, um Bindungsaffinitäten nach Langzeitlagerung von Antikörpern zu validieren, Bindungsaffinitäten von Fragment-Antigen-Bindungsregion-Armen (Fab) in bispezifischen Antikörperkonstrukten zu unterscheiden und festzustellen, ob es eine Variabilität in der Antigenexpression zwischen verschiedenen Zelllinien gibt. Bei dieser Methode wird eine feste Menge Antigen in spezifizierte Vertiefungen auf einer zerbrechlichen 96-Well-Platte immobilisiert. Dann wurde die unspezifische Bindung in allen Vertiefungen mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Anschließend wurde der rAb in einem Konzentrationsgradienten zu allen Vertiefungen gegeben. Es wurde ein Konzentrationsbereich gewählt, damit der rAb eine Sättigung erreichen kann, d. h. eine Antikörperkonzentration, bei der alle Antigene kontinuierlich an das rAb gebunden sind. In bestimmten Vertiefungen ohne immobilisiertes Antigen kann eine unspezifische Bindung des rAb bestimmt werden. Durch Subtrahieren der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung in den Vertiefungen mit immobilisiertem Antigen kann die spezifische Bindung des rAb an das Antigen bestimmt werden. Das K_D des rAb wurde aus der resultierenden Sättigungsbindungskurve berechnet. Als Beispiel wurde die Bindungsaffinität mit radioaktiv markiertem Amivantamab bestimmt, einem bispezifischen Antikörper für epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) und zytoplasmatische mesenchymal-epitheliale Übergangsproteine (cMET).

Einleitung

Radioaktiv markierte Antikörper (rAb) haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Medizin. Während die Mehrheit in der Onkologie als bildgebende und therapeutische Mittel eingesetzt wird, gibt es bildgebende Anwendungen für rheumatologische Entzündungen, Kardiologie und Neurologie¹. Imaging rAbs hat eine hohe Empfindlichkeit, Läsionen zu erkennen und hat das Potenzial, bei der Patientenauswahl für die Behandlung zu helfen ^2,3,4,5. Sie werden auch wegen ihrer Spezifität für ihre jeweiligen Antigene zur Therapie eingeset....

Protokoll

HINWEIS: Eine grafische Darstellung des Protokolls finden Sie in Abbildung 2.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Protokolls Zeilen- und Spaltenbeschriftungen werden als Leitfaden für die Einrichtung der zerbrechlichen 96-Well-Platte angegeben.....

Ergebnisse

Diese Methode berechnet die Bindungsaffinität (K_D) für einen rAb basierend auf dem Sättigungsbindungsassay, bei dem verschiedene Konzentrationen von rAb zu einer festen Menge immobilisierten Antigens hinzugefügt wurden. Die Bindungskurve sollte dem logarithmischen Wachstum folgen, wo sie zunächst steil ist und dann stagniert, wenn das Antigen gesättigt ist. Um sicherzustellen, dass die bestimmte K_D genau ist, müssen die rAb-Konzentrationen hoch genug sein, um eine Sättigung zu erreichen. Für diesen .......

Diskussion

Im Rahmen der Entwicklung von rAbs ist es wichtig sicherzustellen, dass ein rAb mit hoher Bindungsaffinität spezifisch an sein Ziel bindet. Die Bestimmung der Bindungsaffinität kann darüber informieren, ob die Immunreaktivität des rAb durch Radiokonjugation durch den Radioligandensättigungsassay unter Verwendung eines immobilisierten Antigens beeinflusst wird. Die Bestimmung der rAb-Bindung an BSA kann verwendet werden, um die unspezifische Bindung zu quantifizieren, um die spezifische Bindung an das immobilisierte Antig.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma-Zähler	Hidex	Hidex Automatischer Gamma-Zähler
GraphPad Prism Software	GraphPad		Version 9.2; wird für statistische Analysen in dieser Studie verwendet
Immunbrechbare MaxiSorp 96-Well-Platten	Thermo Scientific	473768
Mikrotiterplatten-Dichtband	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190144
Natriumbicarbonat	JT Baker	3506-01
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949