Bestimmung der Bindungsaffinität (K_D) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene

Diese Methode kann die Bindungsaffinität eines radioaktiv markierten Antikörpers für sein Antigen bestimmen. Es wird auch die Spezifität der Bindung messen. Der Hauptvorteil dieser einfachen Methode ist die spezifische Charakterisierung der Bindungsaffinität nur des radioaktiv markierten Antikörpers ohne Interferenz durch den unkonjugierten elterlichen Antikörper.

Diese Technik validiert quantitativ die Fähigkeit eines radioaktiv markierten Antikörpers, an sein Ziel zu binden. Dies ist wichtig für Anwendungen in der Kernbildgebung und in der Kerntherapie bei einer Vielzahl von Erkrankungen. Das Verfahren wird von Erika Belitzky, einer Postgraduiertenmitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert.

Bereiten Sie zunächst einen Immobilisierungspuffer vor, indem Sie 191 Milligramm Natriumbicarbonat und 23,9 Milligramm Natriumcarbonat zu einem 50-Milliliter-Konustubus hinzufügen. Dann 40 Milliliter 18 Megaohm Wasser hinzufügen und durch Vortexen auflösen. Stellen Sie nun den pH-Wert auf 9,0 ein, bevor Sie das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter bringen.

Als nächstes bereiten Sie 200 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 200 Milliliter PBS und 100 Mikroliter Tween 20 zu einer 250-Milliliter-Flasche hinzufügen. Bereiten Sie auch 50 Milliliter Bindungspuffer vor, indem Sie 50 Milligramm BSA und 25 Mikroliter Tween 20 bis 50 Milliliter PBS hinzufügen und durch Vortexen mischen. Fügen Sie 1,5 Gramm BSA zu 50 Millilitern PBS hinzu, um den blockierenden Puffer vorzubereiten, und wirbeln Sie vorsichtig zum Mischen.

Verdünnen Sie das Antigen im Immobilisierungspuffer. Nehmen Sie dann eine zerbrechliche 96-Well-Flachbodenplatte und fügen Sie 100 Mikroliter Antigen zum Boden jedes Bohrlochs von 24 Vertiefungen in einem acht mal drei Array hinzu. Die Platte mit Siegelband abdecken und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag den Teller dreimal mit Waschpuffer waschen. Drehen Sie die Platte zügig in der Spüle um, um die Flüssigkeit zu entsorgen, und tippen Sie die Platte auf einen Stapel Papierhandtücher, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie dann zu den Vertiefungen, die das Antigen enthalten, 300 Mikroliter Waschpuffer pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette hinzu.

Fügen Sie 300 Mikroliter Blockpuffer pro Vertiefung sowohl zu 24-Antigen-beschichteten Vertiefungen als auch zu 24 leeren Vertiefungen der 96-Well-Platte hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei Umgebungstemperatur und waschen Sie jede Vertiefung der Platte dreimal mit 300 Mikrolitern Waschpuffer. Machen Sie dreifache serielle Verdünnungen des radioaktiv markierten Antikörpers im Bindungspuffer für acht Reihen, die als A bis H auf der Platte bezeichnet werden.

Berechnen Sie zunächst das Volumen des radioaktiv markierten Antikörpers, das erforderlich ist, um eine 1,2-Milliliter-Lösung der ersten Konzentration herzustellen. Dann fügen Sie 800 Mikroliter Bindungspuffer zu Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die mit B bis H gekennzeichnet sind, und fügen Sie das erforderliche Volumen des Bindungspuffers zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung A hinzu.Fügen Sie das berechnete Volumen des radioaktiv markierten Antikörpers zu Röhrchen A hinzu und wirbeln Sie vorsichtig vor. Drehen Sie sich dann mit einer Mini-Mikrozentrifuge nach unten, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Als nächstes fügen Sie 400 Mikroliter Flüssigkeit von zwei A zu Röhrchen B hinzu.Nach dem Vortexen drehen Sie es mit einer Mini-Mikrozentrifuge nach unten. In ähnlicher Weise fügen Sie Lösung aus Röhrchen B zu Röhrchen C, C zu D bis zu Röhrchen H hinzu.Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung pro Verdünnung zu drei mit Antigen immobilisierten Vertiefungen und drei nur mit BSA blockierten Vertiefungen hinzu. Fügen Sie nun 100 Mikroliter jeder Verdünnung zu den Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die als A-Standard bis H-Standard gekennzeichnet sind, und speichern Sie diese Röhrchen als radioaktiv markierte Antikörperstandards, die im Gammazähler untersucht werden sollen.

Bebrüten Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schaukeln. Beschriften Sie Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Well, wie im Manuskript beschrieben. Saugen Sie den radioaktiv markierten Antikörper mit einem Vakuumsauger aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte ab.

Fügen Sie nun mit einer Mehrkanalpipette 300 Mikroliter Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu. Saugen Sie den Waschpuffer ab und wiederholen Sie das Waschen vier weitere Male. Brechen Sie die Vertiefungen in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen auf.

Zählen Sie die Radioaktivität in den Röhrchen mit dem als H1, H2, H3, H3 markierten Antigen bis A1, A2, A3 und dann mit BSA, das nur als H4, H5, H6 markiert ist, zu A4, A5, A6 mit einem Gammazähler. Radiomarkiertes Amivantamab zeigte eine spezifische Bindung für EGFR- und cMET-Proteine. In ähnlicher Weise wurden Bindungsaffinitäten auch von einarmigen radioaktiv markierten Fabs beibehalten, die an EGFR- und cMET-Proteine gebunden waren.

Die Sättigungsbindungsdiagramme zeigten, dass bei zu niedrigen Konzentrationen radioaktiv markierter Antikörper keine Sättigung erreicht wurde, wie die lineare Kurve zeigt. Konzentrationen von radioaktiv markierten Antikörpern, die zu hoch waren, führten zu einer Sättigung ohne deutliches logarithmisches Wachstum, wie das horizontale Plateau zeigt. Auch eine hohe unspezifische Bindung wurde aufgrund hoher Konzentrationen von radioaktiv markierten Antikörpern beobachtet.

Dieses Verfahren kann mehrere Versuche erfordern, um den Konzentrationsbereich für jeden spezifischen radioaktiv markierten Antikörper zu optimieren. Verwenden Sie Daten aus negativen Ergebnissen, um zukünftige Experimente zu entwerfen. Sobald die Bindungsaffinität bekannt ist, kann sie als Benchmark für andere In-vitro-Assays im Rahmen der Charakterisierung eines radioaktiv markierten Antikörpers verwendet werden.