Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Das Zytoskelett ist ein Netzwerk von Proteinfilamenten, das sich über das Zytoplasma eukaryotischer Zellen erstreckt und die Zelloberfläche mit dem Zellkern verbindet. Es verfügt über einzigartige Materialeigenschaften, die mechanischen Schutz vor großen und wiederholten mechanischen Belastungen bieten, aber auch dynamische Zellformänderungen^{vorantreiben 1}. Rekonstituierte Zytoskelettnetzwerke können zu einer Reihe interessanter dynamischer Verhaltensweisen führen, von der Einsperrung eingebetteter Teilchen bis hin zu ballistischen Bewegungen, die von molekularen Motoren angetrieben werden 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Zu den Methoden zur Analyse der Dynamik solcher Netzwerke gehören die Verfolgung der Bewegung eingebetteter Tracer-Mikrosphären 6,7,12,13,14, die Bildanalyse zur Verfolgung der Größe proteindichter Cluster im Laufe der Zeit 8, die dynamische Lichtstreuung 15, die Teilchenbild-Velocimetrie^{4,16,17,18,19} , die spektrale Leistungsdichte von Bildern über die Zeit^{berechnet 19} und Kymographenanalyse²⁰. Da immer mehr Studien über rekonstituierte Zytoskelettnetzwerke durchgeführt werden, sei es, um zelluläre Mechanik oder aktive Materie zu verstehen, werden robuste, unvoreingenommene und reproduzierbare Methoden zur Charakterisierung der Dynamik immer notwendiger. Die differentielle dynamische Mikroskopie (DDM)^21,22, eine relativ neue Technik, die zur Untersuchung der Zytoskelettdynamik verwendet wurde^, ist eine solche Technik, die die Dynamik mit wenigen benutzerdefinierten Parametern effizient quantifiziert. Mit dem hier beschriebenen Softwarepaket können Forscher mit wenig Erfahrung in der Programmierung oder Bildanalyse DDM für ihre eigene Arbeit nutzen.

DDM ist eine Bildanalysetechnik, um die Dynamik einer Probe zu extrahieren. Wie die Partikelverfolgung oder die Geschwindigkeitsmessung von Partikelbildern erfordert DDM eine Zeitreihe von Bildern (oft Tausende von Bildern), die typischerweise mit einem Mikroskop aufgezeichnet werden. Im Gegensatz zur Partikelverfolgung müssen einzelne Merkmale oder Tracer-Perlen im Bild nicht lokalisiert (oder sogar lokalisierbar) sein. Im Gegensatz zur Partikelverfolgung und der Geschwindigkeitsmessung von Partikelbildern stellt man die Ensembledynamik mit DDM mit relativ wenigen benutzerdefinierten Parametern wieder her. Mit DDM werden Bilder im Fourier-Raum analysiert, um die Abklingzeit von Dichteschwankungen über einen Bereich von Wellenzahlen zu bestimmen, q, wobei q = 2πu ist, und u die Größe der Raumfrequenzen ist, . Man erhält streuende Informationen, aber mit Real-Space-Bildern^, die auf einem Mikroskop aufgenommen wurden^21,22,23. Daher kann man die verschiedenen kontrasterzeugenden Methoden der Mikroskopie nutzen, wie z.B. Weitfeldfluoreszenz^22,24, konfokale Fluoreszenz 25, polarisierte 26^, Dunkelfeld-27 oder Lichtblattfluoreszenz ²⁸ Mikroskopie. Darüber hinaus können Bilder, die für die DDM-Analyse verwendet werden, für die Partikelverfolgung oder die Partikelbild-Velocimetrie verwendet werden, um ergänzende Informationen bereitzustellen.

Diese Kombination von Eigenschaften aus der dynamischen Lichtstreuung und der optischen Mikroskopie macht DDM zu einer leistungsstarken und vielseitigen Technik. Seit seiner Erstbeschreibung durch Cerbino und Trappe im Jahr²⁰⁰⁸ 21, wo DDM nachweislich die Diffusion von 73 nm kolloidalen Partikeln misst, wurde DDM verwendet, um fließende Kolloide 29, kolloidale Aggregation^30,31, die Viskoelastizität von nematischen Flüssigkristallen²⁶, die Dynamik kolloidaler Gele 32, Grobschäume^33, Nanopartikel in geschlossenen Umgebungen ^{34, 35,36,37}, bakterielle Motilität 38,39,40,41, die Diffusion von schwach streuenden Proteinclustern 42^, Kapillarwellen an Fluidgrenzflächen ⁴³ und andere Systeme. Diejenigen, die eine vollständigere Liste von Publikationen suchen, die DDM verwenden, können sich auf gründliche Übersichtsarbeiten zu diesem Thema 22,23,44,45 beziehen.

DDM wurde auch verwendet, um die Dynamik biologischer Netzwerke zu untersuchen. Drechsler et al. verwendeten DDM, um die Dynamik von Aktin in lebenden Drosophila-Eizellen ^{zu messen 46}. Burla et al. quantifizierten die Dynamik von Tracerpartikeln in Netzwerken von Hyaluron- und Hyaluronan-Kollagen-Verbundwerkstoffen⁴⁷. Mehrere Anwendungen von DDM zur Untersuchung der Dynamik von Tracerpartikeln in rekonstituierten Zytoskelettnetzwerken^9,10, des Transports von DNA-Molekülen in solchen Netzwerken^48,49 und der Dynamik aktiver rekonstituierter Netzwerke wurden ebenfalls dokumentiert ^11,50,51. Ein Vorteil von DDM bei der Messung der Dynamik in solchen Systemen besteht darin, dass einzelne Partikel oder Moleküle nicht lokalisiert und verfolgt werden müssen. So kann beispielsweise die Dynamik von DNA-Molekülen in überfüllten Umgebungen mit DDM gemessen werden, obwohl es schwierig ist, solche kleinen und nicht-sphärischen Moleküle zu verfolgen. Darüber hinaus kann man mit der Fluoreszenzmikroskopie die Dynamik einzelner Bestandteile in einem komplexen Komposit selektiv mit Hilfe der mehrfarbigen Markierung messen.

Um DDM durchzuführen, wird im Laufe der Zeit eine Abfolge von Bildern aufgenommen, I(x,y,t). Für eine gegebene Verzögerungszeit, Δt, werden alle (oder eine Teilmenge von) Bildpaaren gefunden, die durch diese Verzögerungszeit getrennt sind. Die quadratische Fourier-Transformation der Differenz jedes Paares,

wird zusammen berechnet und gemittelt. Diese Menge, , wird radial gemittelt, vorausgesetzt, die Dynamik ist isotrop. Daraus ergibt sich die DDM-Matrix (auch Bildstrukturfunktion genannt), . Dieser Vorgang ist in Abbildung 1 grafisch dargestellt. Um die Dynamik der Stichprobe aus dieser DDM-Matrix zu bestimmen, wird angenommen, dass die DDM-Matrix die Form

wobei A die Amplitude ist, die von den Details des Mikroskops und der Struktur der Probe abhängt, B der Hintergrund ist, der vom Rauschen in den Bildern abhängt, und f (q,Δ t) die Zwischenstreufunktion (ISF) ist, die Informationen über die Dynamik^21,22 enthält. In einfachen Fällen

wobei τ eine charakteristische Zerfalls- oder Dekorrelationszeit ist. Ein solches ISF wurde in mehreren Studien verwendet, in denen DDM auf ergodischen Systemen wie verdünnten kolloidalen Suspensionen 21,24,27,37,40,52 eingesetzt wurde. Andere Formen des ISF können jedoch verwendet werden, um verschiedene Arten von Dynamiken zu modellieren. Zum Beispiel kann man eine kumulante Expansion verwenden, um die ISF für polydisperse Proben als

wobei μ ein Maß für die Polydispersität^42,53 ist; Wenn Dichtefluktuationen um zwei getrennte Moden abklingen, kann man eine ISF wie

²⁶, ^{54, 55, 56, 57};

andere ISFs können für schwimmende Mikroorganismen oder andere aktive Partikel^{verwendet werden} 38,39,40,41,58,59.

Abbildung 1: Überblick über die DDM-Analyse. Aus der Zeitreihe der Bilder wird die Fourier-Transformation der Bildunterschiede berechnet, um die DDM-Matrix zu berechnen. Die DDM-Matrix kann an ein Modell angepasst werden, um die Zeitskala der Dichteschwankungen über einen Bereich von q-Werten zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Hier wird die Verwendung eines in Python entwickelten DDM-Analysesoftwarepakets, PyDDM, beschrieben. Dieses Softwarepaket baut auf der Arbeit unserer Forschungslabors und anderer veröffentlichter Studien in den letzten Jahren auf. Zu den Hauptmotivatoren für die Erstellung dieses Softwarepakets gehört die Notwendigkeit, (1) Metadaten und Parameter, die in der Analyse verwendet werden, zu verfolgen und zu speichern; (2) gründliche Dokumentation mit detaillierten Analysebeispielen von Anfang bis Ende; und (3) eine einfache Möglichkeit, verschiedene mathematische Modelle zur Anpassung der Daten zu verwenden (z. B. das Hinzufügen von ISF-Modellen, wie sie kürzlich für aktive Filamente⁶⁰ entwickelt wurden, wäre einfach). Es gibt auch andere Softwarepakete für die DDM-Analyse, obwohl nicht alle gut dokumentiert und in einer Open-Source-Programmiersprache geschrieben sind. Beispielsweise gibt es C++-Code mit Computing auf GPUs (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, C++-Code, der Fourier-Transformationen rechtzeitig verwendet, um Berechnungen zu beschleunigen (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, MATLAB- und Python-Versionen (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, MATLAB-Code (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ und MATLAB-Code mit Unsicherheitsquantifizierung ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶² Da dieses PyDDM-Paket gut dokumentiert ist und viel Flexibilität bei der Berechnung und Analyse der DDM-Matrix bietet, kann es hoffentlich für Forscher nützlich sein, die DDM unabhängig von ihrem Hintergrund in der Programmierung oder Bildanalyse implementieren möchten.

Das Protokoll zeigt, wie dieses Softwarepaket verwendet werden kann, um die Dynamik von in vitro rekonstituierten Zytoskelettnetzwerken zu quantifizieren. Dies geschieht durch die Verwendung von zwei verschiedenen Sätzen von Bilddaten: (1) Bilder von Submikron-Tracer-Partikeln, die in ein Vimentin-Netzwerk eingebettet sind, das mit Hellfeldmikroskopie aufgenommen wurde, und (2) Bilder von fluoreszenzmarkierten Aktin- und Mikrotubuli-Filamenten in einem verschränkten Kompositnetzwerk mit Myosin-gesteuerter Aktivität, die mit laserscannender konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden. Die Analysen dieser beiden Datensätze heben bemerkenswerte Stärken von DDM hervor, einschließlich seiner Fähigkeit, Bilder zu analysieren, die mit einer Vielzahl von Bildgebungsmodalitäten aufgenommen wurden (z. B. Hellfeld oder konfokale Fluoreszenz), Dynamik aus eingebetteten Tracern oder aus markierten Filamenten zu extrahieren und eine Vielzahl von Dynamiken zu quantifizieren (z. B. subdiffusiv und eingeschränkt oder ballistisch).

HINWEIS: Eine Jupyter Notebook-Datei, die den Code enthält, der zu jedem Schritt im folgenden Protokoll gehört, finden Sie im folgenden GitHub-Repository, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Eine PDF-Datei dieser Datei ist in der Ergänzungsdatei 1 enthalten. Darüber hinaus finden Sie eine exemplarische Vorgehensweise für den Code und die Dokumentation der einzelnen Funktionen und Klassen auf der Website https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Software-Installation

1. Um den Beispiel-DDM-Analysedateien zu folgen, installieren Sie Jupyter Notebook zum Ausführen des Codes. Installieren Sie andere erforderliche allgemeine Python-Pakete, einschließlich NumPy und Matplotlib. Diese Pakete werden alle mit der Anaconda-Distribution gebündelt (siehe https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Installieren Sie das Python-Paket^{xarray 63}. Dieses Paket ist zum Organisieren und Speichern von Metadaten und Analyseparametern erforderlich. Wenn Sie die Anaconda-Distribution verwenden, installieren Sie xarray (zusammen mit den empfohlenen Abhängigkeiten) mit dem folgenden Befehl:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 Engpass
3. Installieren Sie das PyYAML-Paket mit dem folgenden Befehl:
   conda install -c anaconda yaml
   Dieses Paket ist notwendig, um Metadaten über die zu analysierenden Bilder und die vom Benutzer für die Analyse und Anpassung eingestellten Parameter zu lesen.
4. Installieren Sie das PyDDM-Paket, indem Sie es aus dem GitHub-Repository herunterladen oder den Befehl git verwenden:
   Git-Klon https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planen der Imaging-Sitzungen

1. Wählen Sie die optimale verfügbare Abbildungsmodalität und die optischen Einstellungen. Wie bereits erwähnt, kann DDM mit einer Reihe von Mikroskopiemethoden verwendet werden.
2. Um die Planung des geeigneten Objektivs und der zu verwendenden Bildgröße zu unterstützen, bestimmen Sie den Wellenzahlenbereich q, der basierend auf der Pixelgröße und der Gesamtbildgröße untersucht wird. Vergewissern Sie sich, dass die Wahl der Vergrößerung und des Sichtfelds für das Experiment optimal ist, basierend auf diesen Berechnungen. Für die hier analysierten Bilder wurden ein 60x 1,4 NA Objektiv und eine Bildgröße von 256 x 256 Pixel mit einer Pixelgröße von 0,83 μm für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk verwendet. Für die Bilder von Perlen, die in ein Vimentin-Netzwerk eingebettet sind, wurden ein 100x 1,4 NA Objektiv und eine Bildgröße von 512 x 512 Pixel mit einer Pixelgröße von 0,13 μm verwendet.
   HINWEIS: Das Minimum q wird durch 2π/NΔ x festgelegt, wobei die Bildgröße (als quadratisch angenommen) N × N Pixel mit einer Pixelgröße von Δx beträgt. Das Maximum q ist das Minimum von π/Δx und 2π NA/λ, wobei NA die numerische Apertur des Bildobjektivs und λ die Wellenlänge des Lichts ist (für die Hellfeldbildgebung kann man NA durch (_NA-Objektiv +_{NA-Kondensator})/2 ersetzen).
3. Betrachten Sie als Nächstes den Bereich der zu untersuchenden Zeitskalen. Typischerweise wird die DDM-Analyse auf Sequenzen von mindestens 1000 Frames durchgeführt.
   1. Um die geeignete Bildrate zu bestimmen, berücksichtigen Sie die erwartete Zeit, die Features in der Stichprobe benötigen, um eine Entfernung in der Größenordnung der minimal auflösbaren Längenskala (entsprechend der maximalen q) zu verschieben.
   2. Bei der Betrachtung der oberen Grenze des Bereichs der untersuchten Zeitskalen ist zu berücksichtigen, dass typischerweise das Leistungsspektrum von Hunderten von Bildunterschieden einer gegebenen VerzögerungszeitΔt zusammen gemittelt wird, um ausreichende Statistiken zur Reduzierung des Rauschens zu liefern. Erfassen Sie daher Bildsequenzen, die länger als die maximal untersuchte Zeitskala sind.
      HINWEIS: Wenn ein erwarteter Diffusionskoeffizient, D, oder Geschwindigkeit, v, bekannt ist, dann kann man erwartete charakteristische Zerfallszeiten mit τ = 1/Dq² oder τ = 1/vq zusammen mit dem Bereich von q schätzen, der basierend auf dem Sichtfeld und der Pixelgröße bestimmt wurde. Der Bereich der erwarteten τ-Werte über den zugänglichen q-Bereich kann bei der Auswahl der Bildrate und der Anzahl der zu erfassenden Frames helfen.

3. Probenvorbereitung und Bildaufnahme

HINWEIS: Einzelheiten zu den Einstellungen für die Probenvorbereitung und Bildgebung, die für die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" ^{dargestellten} Daten verwendet werden, finden Sie in früheren Veröffentlichungen der Autoren^11,51,64 und Supplementary File 2.

1. Basierend auf der Berücksichtigung der zu untersuchenden Zeit- und Längenskalen erfassen Sie Bildsequenzen von idealerweise über 1000 Bildern.
   HINWEIS: Der Code analysiert quadratische Bilder oder quadratische Bereiche von Interesse innerhalb des Bildes, also passen Sie die Rahmengröße entsprechend an.
2. Speichern Sie Bildsequenzen als dreidimensionalen Graustufen-TIFF-Stapel. Alternativ kann das von Nikon Instruments-Systemen verwendete Format, das ND2-Format, vom installierten Paket gelesen werden. Wenn Bilder in einem anderen Format gespeichert sind, verwenden Sie ImageJ oder ein anderes Bildverarbeitungsprogramm, um die Bilder in einen TIFF-Stapel zu konvertieren.
   HINWEIS: Wenn Sie ND2-Dateien verwenden, muss das Paket nd2reader von https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader installiert sein.

4. Parameter-Setup

1. Erstellen Sie eine Kopie der Parameterdatei example_parameter_file.yml, die im PyDDM-Code-Repository unter dem Beispielordner bereitgestellt wird. Öffnen Sie diese YAML-Datei mit einem Texteditor wie NotePad++ oder dem Texteditor in JupyterLab. Eine Beispieldatei für YAML-Parameter, die bei der Analyse der im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dargestellten Daten verwendet wird, finden Sie unter Ergänzende Datei 2.
2. Geben Sie in der kopierten YAML-Datei das Datenverzeichnis und den Dateinamen an, die der zu analysierenden Bildsequenz entsprechen. Geben Sie im Abschnitt Metadaten die Pixelgröße und die Bildrate an.
3. Geben Sie im Abschnitt Analysis_parameters Details dazu an, wie die DDM-Matrix berechnet werden soll. Einige Parameter sind hier optional.
   1. Geben Sie mindestens Werte für die Parameter number_lag_times und last_lag_time an. Diese entsprechen der Anzahl der verschiedenen Verzögerungszeiten, für die die DDM-Matrix berechnet werden soll, bzw. der längsten zu verwendenden Verzögerungszeit (in Frames). Für die hier verwendeten Daten von Tracerperlen in Vimentin-Netzwerken waren die Parameter number_lag_times und last_lag_time 60 bzw. 1000. Der Code berechnet die DDM-Matrix für Verzögerungszeiten von 1 Frame (oder einer anderen minimalen Verzögerungszeit, wenn der optionale Parameter first_lag_time angegeben ist) bis zum last_lag_time mit logarithmischem Abstand.
      HINWEIS: Wenn M-Frames erworben würden, könnte man die DDM-Matrix für eine Verzögerungszeit berechnen, die so groß wie M-1 ist. Bei schlechten Statistiken zu einer so großen Verzögerung sind die Daten jedoch wahrscheinlich verrauscht. Die längste Verzögerungszeit, für die die DDM-Matrix berechnet wird, hängt von den Details der Daten ab, aber wir empfehlen, etwa ein Drittel der gesamten Bildseriendauer zu versuchen.
4. Geben Sie im Abschnitt Fitting_parameters an, wie die DDM-Matrix oder die Zwischenstreufunktion (ISF) angepasst werden sollte. Geben Sie den Namen des Modells unter dem Modellparameter ein. Geben Sie die anfängliche Schätzung, die untere Grenze und die obere Grenze für jeden der Anpassungsparameter im ausgewählten Modell an.
   HINWEIS: Um eine Liste der möglichen Fitting-Modelle anzuzeigen, führen Sie die Funktion print_fitting_models aus. Die Modelle finden Sie auch in der Online-Dokumentation auf der PyDDM-Website.

5. Berechnung der DDM-Matrix

1. Initialisieren Sie eine Instanz der DDM_Analysis Klasse. Geben Sie dazu die oben beschriebenen Metadaten und Analyseparameter an, indem Sie den Dateinamen der YAML-Datei mit dem vollständigen Dateipfad an DDM_Analysis übergeben. Alternativ können Sie die Metadaten und Parameter als Datenstruktur des Python-Wörterbuchs übergeben.
2. Führen Sie die Funktion calculate_DDM_matrix aus, um die DDM-Matrix zu berechnen. Diese Berechnung kann je nach Rahmengröße und Anzahl der Verzögerungszeiten mehrere Minuten oder länger dauern. Siehe Abbildung 2 für typische Laufzeiten.
3. Überprüfen Sie die zurückgegebenen Daten, die sich in einer Datenstruktur aus dem xarray-Paket befinden, das als Dataset bezeichnet wird. Diese Datenstruktur wird unter dem Attribut ddm_dataset gespeichert.
   HINWEIS: In dieser Datenstruktur werden nicht nur die DDM-Matrix, sondern auch zugehörige Variablen und Metadaten gespeichert. Es wird auch in einem netCDF-Format (Network Common Data Form) auf der Festplatte gespeichert.
4. Überprüfen Sie die Plots und Figuren, die generiert und angezeigt werden. Diese Zahlen werden auch als PDF-Datei im Datenverzeichnis gespeichert.
   1. Sehen Sie, dass eines der generierten Diagramme den ensemblegemittelten quadratischen Modul der Fourier-transformierten Bilder als Funktion von q zeigt. Standardmäßig verwendet der Code dies, um den Hintergrundparameter B zu schätzen. Schätzen Sie den Hintergrund von, indem Sie davon ausgehen, dass er sich im Grenzbereich des großen q B / 2 nähert, wobei B der Hintergrund ist.
   2. Wenn q kein Plateau erreicht, verwenden Sie eine andere Methode zur Schätzung von B. Um dies zu erreichen, setzen Sie den Parameter background_method entweder in der YAML-Datei oder als optionales Schlüsselwortargument auf die Funktion calculate_DDM_matrix. Weitere Einzelheiten zu den Methoden zur Schätzung von B finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.

Abbildung 2: Rechenzeit für die Berechnung der DDM-Matrix. In (A) und (B) wird die Zeit für die Berechnung der DDM-Matrix angezeigt, , . Die in allen Fällen verwendeten Daten sind ein Film mit 5000 Bildern und einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln. Die DDM-Matrix wurde für 30 Verzögerungszeiten berechnet, logarithmisch verteilt zwischen 1 Frame (0,01 s) und 1000 Frames (10 s). Der Code wurde auf einem Intel i7-10700 2,90 GHz Desktop-Computer mit 32 GB RAM ausgeführt. In (A) wird der Effekt der Variation der Anzahl der Bildunterschiede gezeigt, die bei der Berechnung der DDM-Matrix für jede Verzögerungszeit verwendet werden. Dazu werden die Bilder zu einer Bildgröße von 256 x 256 bindiert. Für jedeVerzögerungszeit Δ t werden Bilder, die durch dieses Δt getrennt sind, subtrahiert und die resultierende Matrix wird Fourier-transformiert. Für ein gegebenes Δ t können alle durch diesesΔ t getrennten Bildpaare verwendet werden (blau dargestellt), es können nur nicht überlappende Bildpaare verwendet werden (z. B. die Rahmen 1 und 10, 10 und 19 usw.; braun dargestellt), oder 300 Bildpaare oder weniger können für jedes Δt verwendet werden. In (B) wird der Effekt der Änderung der Bildgröße auf die Rechenzeit gezeigt. Die Bilder wurden entweder durch Gruppierung von 2 x 2, 4 x 4 oder 8 x 8 Pixeln in den Papierkorb gelegt, was zu Bildgrößen von 256 x 256, 128 x 128 bzw. 64 x 64 führte. Für jedes werden etwa 300 Bildpaare verwendet, um die DDM-Matrix für jedes Δt zu berechnen. (C) Aus der DDM-Matrix kann die Zwischenstreufunktion (ISF) extrahiert werden. Dies ist für die drei Fälle in (A) dargestellt. Die blauen Datenpunkte (ohne Offset) entsprechen dem ISF, wenn die maximale Anzahl von Bildpaaren für jedes Δt verwendet wird; die braunen Datenpunkte (mit einem Offset von 0,1) entsprechen dem ISF, wenn für jedes Δt nicht überlappende Bildpaare verwendet werden; und die rosa Datenpunkte (mit einem Offset von 0,2) entsprechen dem ISF, wenn für jedes Δt höchstens 300 Bildpaare verwendet werden. Die ISF, die mit nicht überlappenden Bildpaaren gefunden wurde, zeigt Lärm bei langen Δt. In diesem Fall werden nur wenige Bildpaare bei langenΔ t verwendet (z. B. werden für Δt von 1000 Bildern nur 4 Bildpaare verwendet). (D) Durch Anpassung des ISF an eine Exponentialfunktion wird die charakteristische Abklingzeit τ für jede Wellenzahl q bestimmt. In Rosa werden die Ergebnisse nach dem Binning der Originalbilder um 2 x 2 angezeigt, was zu einer Bildgröße von 256 x 256 führt. In Grau werden die Ergebnisse nach dem Binning um 8 x 8 angezeigt, was zu einer Bildgröße von 64 x 64 führt. Durch das Binning der Daten gehen Informationen über die Dynamik bei höheren Wellenzahlen verloren, aber die Berechnung der DDM-Matrix für die 64 x 64-Bilder ist etwa 16x schneller als für die 256 x 256-Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Anpassung der DDM-Matrix oder der ISF

1. Initialisieren Sie eine Instanz der DDM_Fit Klasse. Geben Sie dazu den Dateinamen der YAML-Datei, die die Bildmetadaten und Parameter für die Anpassung enthält, an DDM_Fit weiter.
2. Entscheiden Sie, welches Modell für die DDM-Matrix oder das ISF zum Anpassen der Daten verwendet werden soll. Listen Sie die verfügbaren Modelle auf, indem Sie die Funktion print_fitting_models ausführen. Geben Sie das zu verwendende Modell in der YAML-Parameterdatei oder mithilfe der Funktion reload_fit_model_by_name an.
3. Legen Sie die anfänglichen Vermutungen und Grenzen für jeden Parameter im ausgewählten Modell in der bereitgestellten YAML-Parameterdatei fest. Um die anfängliche Schätzung für einen beliebigen Parameter zu ändern, verwenden Sie die Funktion set_parameter_initial_guess. Setzen Sie Grenzen für die Parameter mit der Funktion set_parameter_bounds. Zum Beispiel, wie in der Ergänzungsdatei 2 zu sehen, für die Daten von Tracer-Perlen im Vimentin-Netzwerk, war die anfängliche Schätzung für die Zerfallszeit 1 s und die Grenzen für diesen Parameter waren 0,01 s und 2000 s.
4. Führen Sie die Anpassung mit der Funktion fit aus. Weisen Sie der Ausgabe dieser Funktion eine Variable zu, um einfach auf die Ergebnisse zugreifen zu können.
   HINWEIS: Diese Funktion kann viele optionale Argumente annehmen. In der Codedokumentation und in den bereitgestellten Beispielen finden Sie eine Liste solcher Argumente und wann Sie sie auf nicht standardmäßige Werte festlegen sollten.

7. Interpretation der Passformergebnisse

1. Generieren Sie Diagramme zur Überprüfung der Anpassungen und der q-Abhängigkeit der Anpassungsparameter mit der Funktion fit_report.
   HINWEIS: Diese Funktion generiert eine Reihe von Plots, die auch als PDF gespeichert werden. Optionale Argumente für diese Funktion können verwendet werden, um die erzeugten Plots zu ändern.
2. Zu den generierten Diagrammen gehört eine Abbildung mit 2 x 2 Unterdiagrammen, die die DDM-Matrix oder ISF (abhängig vom gewählten Anpassungsmodell) bei vier q-Werten (angegeben als optionales Argument für fit_report) sowie die berechnete DDM-Matrix oder ISF unter Verwendung des Modells und der Best-Fit-Parameter zeigen. Um die DDM-Matrix oder ISF zusammen mit der besten Anpassung auf interaktive Weise darzustellen, verwenden Sie die Klasse Browse_DDM_Fits, wie in den bereitgestellten Beispielen gezeigt, wenn die Jupyter Notebook-Umgebung verwendet wird.
3. Bestimmen Sie aus dem Diagramm der charakteristischen Abklingzeit τ im Vergleich zur Wellenzahl q, ob die Dynamik diffusiven, subdiffusiven, ballistischen oder einer anderen Art von Bewegung folgt. Dies kann durch die Suche nach der Potenzgesetzbeziehung zwischen τ und q erfolgen.
   HINWEIS: Auf dem Log-Log-Diagramm von τ vs. q, das von der Funktion fit_report generiert wird, werden drei Zeilen angezeigt, die den Potenzgesetzanpassungen über einen bestimmten Bereich von q-Werten entsprechen. Die durchgezogene schwarze Linie entspricht der Anpassung τ vs. q an ein Potenzgesetz, τ = 1 / Kq^β, wobei K und β freie Parameter sind. Die gestrichelte Linie in Orange entspricht der Anpassung an die einfache Diffusion, τ = 1 / Dq², wobei D ein Diffusionskoeffizient ist. Die gestrichelte Linie in Blau entspricht der Anpassung an τ = 1 / vq, wobei v eine Geschwindigkeit ist.

8. Speichern der Ergebnisse

1. Die Ergebnisse der Anpassung werden in einem xarray-Dataset gespeichert. Verwenden Sie die xarray-Funktion to_netcdf oder das integrierte Pickle-Modul von Python, um diese Datenstruktur auf der Festplatte zu speichern. Verwenden Sie die xarray-Funktion open_dataset, um diese netCDF-Dateien zu laden.
2. Verwenden Sie die Funktion save_fit_results_to_excel, um die Anpassungsergebnisse zusammen mit den Daten in einer Arbeitsblattdatei zu speichern.

Hier zeigen wir Beispiele für die Analyse, die mit PyDDM aus zwei verschiedenen Experimenten durchgeführt wurde. In einer Reihe von Experimenten wurden Submikron-Tracer-Perlen in Netzwerke eingebettet, die aus dem Zwischenfilamentprotein Vimentin bestanden, und mit einer 100-fachen Objektivlinse im Hellfeldmodus bei 100 Bildern/s abgebildet (Abbildung 3A). Vimentin wird in mesenchymalen Zellen exprimiert und ist eine Schlüsseldeterminante für die mechanischen Eigenschaften des Zytoplasmas 65 und die mechanische Stabilität des Zellkerns in Zellen, die eine begrenzte Migrationdurchführen 66,67. Bisher wurden rekonstituierte Vimentin-Netzwerke hauptsächlich durch makroskopische Rheologieuntersucht 64,68,69, während die Dynamik vergleichsweise wenig Beachtung gefunden hat 13,70,71. Weitere Einzelheiten zu diesen Experimenten finden Sie in der Ergänzungsdatei 2. In den anderen Experimenten wurden aktive Zytoskelettnetzwerke mit Aktin, Mikrotubuli und Myosin hergestellt. Spektral unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen ermöglichten die Aufnahme der Aktin- und Mikrotubuli-Filamente mit einem zweifarbigen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop unter Verwendung einer 60-fachen Objektivlinse bei 2,78 Bildern / s (Abbildung 3B, C). Aktin- und Mikrotubuli-Filamente sind beide wichtige Treiber dynamischer Zellformveränderungen, deren Wirkung durch mechanische und biochemische Wechselwirkungen koordiniert wird72. Weitere Details zu diesen Experimenten finden Sie in11. Einzelne Frames aus Bildsequenzen, die in diesen Experimenten aufgenommen wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Bilder aus der analysierten Zeitreihe . (A) Hellfeldbild von 0,6 μm Perlen in einem Vimentin-Netzwerk. (B,C) Abbildung der (B) Mikrotubuli und (C) Aktin in einem aktiven Aktin-Mikrotubuli-Komposit, aufgenommen mit einem 60-fachen Objektiv auf einem konfokalen Laser-Rastermikroskop unter Verwendung von 561 nm Anregungslicht für die Mikrotubuli-Bildgebung und 488 nm Anregungslicht für die Aktin-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für Bilder von Tracerperlen in Vimentin-Netzwerken wurden Filme von 5000 Bildern mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln bei 100 Bildern/s aufgenommen. Aus diesen wurde die DDM-Matrix mit 60 logarithmisch verteilten Verzögerungszeiten zwischen 1 und 1000 Frames oder 0,01 s und 10 s berechnet. Um den Hintergrund zu schätzen, wurde B, der Mittelwert der quadrierten Fourier-transformierten Bilder, berechnet und auf 55,73 gesetzt. Es wurde angenommen, dass über die größten 10% der q-Werte diese Menge gleich B/2 ist und dass B unabhängig von q ist. Dies ist die Standardmethode des Pakets zum Schätzen von B, aber andere Methoden sind möglich, indem der Parameter background_method auf einen anderen Wert festgelegt wird.

Mit den aus ermittelten Parametern A(q) und B kann man die Zwischenstreufunktion (ISF) aus der DDM-Matrix extrahieren. Beispiele für ISFs sind in Abbildung 4 dargestellt. In Abbildung 4A ist der ISF aus Bildern von Perlen mit einem Durchmesser von 0,6 μm dargestellt, die in ein Netzwerk mit einer Vimentinkonzentration von 19 μM eingebettet sind. In Abbildung 4B ist der ISF für die gleiche Art von Perlen in einem Netzwerk mit einer Vimentinkonzentration von 34 μM dargestellt. Interessanterweise ist der ISF in keinem der beiden Fälle auf Null gesunken. In großen Verzögerungszeiten sollte sich der ISF für ergodische Systeme Null nähern. Das heißt, in solchen Systemen sollten Dichteschwankungen über große Verzögerungszeiten vollständig dekorrelieren. Die Tatsache, dass der ISF hier nicht auf Null zerfiel, könnte aus ungenauen Schätzungen von A(q) und B resultieren, die verwendet wurden, um den ISF aus der berechneten DDM-Matrix zu finden. Insbesondere kann die hier angewandte Methode B in bestimmten Szenarien62 überschätzen. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass die Dynamik der Tracer-Perlen wirklich nicht ergodisch ist, da die Perlen eine vergleichbare Größe wie die Netzwerkmaschenweite haben und daher eingesperrt werden können. Andere Daten bestätigten die Feststellung der Nichtergodizität. Die Perlengröße von 0,6 μm war nämlich größer als der berechnete Durchschnittswert für die Maschenweiten von 0,4 μm für die 19 μM-Konzentration und 0,3 μm für die 34-μM-Konzentration. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Einzelpartikelverfolgung dieser Tracer-Perlen, die später gezeigt werden, auch eine begrenzte Bewegung.

Abbildung 4: Zwischenstreufunktionen bei mehreren Wellenzahlen für Vimentin-Netzwerke. Der ISF wird als Funktion der Verzögerungszeit für q-Werte von etwa 1 bis 9 μm-1 dargestellt. (A) Die ISF aus Bildern von 0,6 μm-Kügelchen in einem Vimentin-Netzwerk mit einer Vimentin-Konzentration von 19 μM. (B) Die ISF aus Bildern von 0,6 μm-Perlen in einem Vimentin-Netzwerk mit einer Vimentin-Konzentration von 34 μM. Das lange Lag-Time-Plateau des ISF bei einem Wert deutlich über Null deutet auf Nichtergodizität hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Da die Dynamik wahrscheinlich nicht ergodisch ist, sind die ISFs an die Form angepasst, wobei C der Nichtergodizitätsfaktor 32 ist. Diese Form des ISF wurde in früheren Studien zur nicht-ergodischen Dynamik verwendet, wie z.B. der von kolloidalen Gelen32,74 oder Tracerpartikeln in Aktin-Mikrotubuli-Netzwerken 10. Die gepunkteten schwarzen Linien in Abbildung 4 zeigen die Anpassungen zusammen mit den Daten. Aus diesen Anpassungen kann man nun die q-Abhängigkeit der Zerfallszeit τ und des Nichtergodizitätsparameters C betrachten.

Abbildung 5: Abklingzeit vs. Wellenzahl für Vimentin-Netzwerke. Von der Anpassung an die ISF wird die Abklingzeit τ für einen Bereich von q-Werten bestimmt. Aus Gründen der Klarheit zeigen wir nicht den Wert von τ für jedes q, sondern nur eine logarithmisch beabstandete Menge. In blau (tan) sind die Daten aus Bildern von 0,6 μm Perlen innerhalb von Vimentin-Netzwerken mit einer Vimentin-Konzentration von 19 μM (34 μM). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen in τ über mehrere Filme dar (vier Filme für die Daten mit dem 19-μM-Netzwerk [blau] und fünf Filme für die Daten mit dem 34-μM-Netzwerk [tan]). Rote gestrichelte Linien markieren geschätzte Grenzen für unsere zeitliche und räumliche Auflösung, wie in den Ergebnissen beschrieben. Die durchgezogene schwarze Linie zeigt eine Skalierung, die auf diffusive Bewegung hinweisen würde. Keiner der beiden Datensätze folgt dieser Skalierung. Vielmehr zeigen Perlen im 19-μM-Netzwerk subdiffusive Bewegung (mit β > 2), und Perlen im 34-μM-Netzwerk zeigen eine begrenzte oder eingesperrte Bewegung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Zerfallszeiten zeigten eine große Unsicherheit, sowohl bei den niedrigen q- als auch bei den hohen q-Extremen, wie in Abbildung 5 zu sehen ist. Die Fehlerbalken in diesem Diagramm zeigen die Standardabweichung zwischen vier Videos, die für den Fall der niedrigeren Vimentin-Konzentration analysiert wurden, oder fünf Videos, die für die höhere Konzentration analysiert wurden. Um die Quelle der großen Unsicherheit an diesen Extremen zu verstehen, betrachten Sie sowohl die zeitliche als auch die räumliche Auflösung. Ungefähre Grenzen der Auflösung werden mit drei roten gestrichelten Linien angezeigt. Die beiden horizontalen Linien entsprechen den untersuchten minimalen und maximalen Verzögerungszeiten. Angesichts der Bildrate von 100 Frames/s und der maximalen Verzögerungszeit, die 1000 Frames (20% der gesamten Videodauer) entspricht, ging die Genauigkeit verloren, wenn die Dynamik schneller als 0,01 s oder langsamer als 10 s gemessen wurde. Bei den niedrigeren q-Werten waren die angepassten Werte für τ größer als 10 s. Daher ist in Zerfallszeiten, die größer als die maximale Verzögerungszeit sind, mit großen Unsicherheiten zu rechnen. Am oberen Ende des q-Bereichs näherte sich die Zerfallszeit der minimalen Verzögerungszeit von 0,01 s, blieb aber darüber. Anstatt durch die zeitliche Auflösung begrenzt zu sein, kann bei diesen höheren q-Werten die räumliche Auflösung der begrenzende Faktor sein. Bei einer Pixelgröße von 0,13 μm lag der größte Wert für q bei etwa 24 μm-1. Die beugungsbegrenzte Auflösung erlaubt jedoch nicht unbedingt genaue Messungen der Dynamik bei diesen hohen Raumfrequenzen. Die Annäherung an die optische Auflösung als führt zu einer oberen Wellenzahlgrenze von etwa 16 μm-1, wenn man die numerische Apertur der Objektivlinse, NA, von 1,4 und die Wellenlänge des Lichts berücksichtigt. Dies ist durch die vertikale rote gestrichelte Linie in Abbildung 5 gekennzeichnet. Tatsächlich waren die Daten bei großen Werten von q verrauscht. Schon vor dieser ungefähren Obergrenze von q wurde eine erhöhte Unsicherheit in τ beobachtet, und dies könnte auf eine Überschätzung von qmax zurückzuführen sein. Eine schlechtere optische Auflösung als vorhergesagt kann darauf zurückzuführen sein, dass eine Ölimmersionslinse verwendet wurde, um über das Deckglas hinaus in eine wässrige Probe zu fotografieren, oder weil die Kondensatorlinse nicht perfekt ausgerichtet war.

Für die 0,6-μm-Perlen, die in das weniger konzentrierte Netzwerk eingebettet sind (19 μM Vimentin), kann aus dem Log-Log-Diagramm der Abklingzeit im Vergleich zur Wellenzahl beobachtet werden, dass die Abklingzeit mit der Wellenzahl in einer Weise abnahm, die mit einem Potenzgesetz übereinstimmt (Abbildung 5). Es scheint jedoch nicht dem zu folgen, was für eine normale diffusive Bewegung zu erwarten wäre, wobei . Vielmehr nahm τ mit zunehmendem q stärker ab. Dies deutet auf eine subdiffusive Bewegung hin, die häufig bei Perlen in überfüllten Umgebungen wie diesen auftritt. Die Anpassung τ(q) über den Bereich von 1,4 μm-1 bis 12,3 μm-1 an ein Potenzgesetz der Form τ = 1/Kqβ ergibt die Transportparameter K = 0,0953 μm β/s und β = 2,2. Für diejenigen, die eher daran gewöhnt sind, über normale Diffusion vs. Subdiffusion in Bezug auf die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) von Tracer-Partikeln als Funktion der Verzögerungszeit nachzudenken (dh MSD = K 'Δ t α), ist es hilfreich zu erkennen, dass der subdiffusive Skalierungsexponent in der MSD-Gleichung, α, äquivalent zu α = 2 / β ist. Mit anderen Worten, der Wert von β = 2,2 ist konsistent mit einem subdiffusiven Skalierungsexponenten in der MSD-Gleichung von α = 0,9. Man würde PyDDM so einstellen, dass es τ (q) über diesen Bereich von q-Werten anpasst, indem man die Indizes des Arrays von q entweder mit dem Parameter Good_q_range in der YAML-Datei angibt oder indem man das optionale Argument forced_qs an die Funktion generate_fit_report übergibt. Der Bereich von q von 1,4 μm-1 bis 12,3 μm-1 würde für die Daten hier Indizes des Arrays von q von 15 bis 130 entsprechen.

Für die 0,6 μm-Kügelchen im konzentrierteren Netzwerk (34 μM) zeigte die Zerfallszeit wenig Abhängigkeit von q. Dies ist wahrscheinlich auf die Nichtergodizität von Perlen in einem Netzwerk mit einer kleineren Maschenweite zurückzuführen. Um die Nichtergodizität in diesem System zu untersuchen, sollte der Nichtergodizitätsparameter C als Funktion von q aufgetragen werden, wie in Abbildung 6. Für die 0,6 μm Perlen im 19 μM Vimentin-Netzwerk ≈ C 0,2 mit geringer Abhängigkeit von q (nicht gezeigt). Für das Netzwerk mit 34 μM Vimentin und für ein Netzwerk mit einer noch höheren Konzentration von 49 μM Vimentin war der Logarithmus von C jedoch proportional zu q2, wie in Abbildung 6 gezeigt. Diese Beziehung zwischen C und q wird für eine begrenzte Bewegung erwartet. Für Perlen, die in Taschen des Netzwerks gefangen sind, wird erwartet, dass der MSD bei ausreichend langen Verzögerungszeiten ein Plateau erreicht (d. h. , wobei der MSD und δ2 der maximale MSD ist). Da der ISF als MSD ausgedrückt werden kann und da der nichtergodische ISF zu langen Verzögerungszeiten (d. h. ) nach C geht, erhältman die Beziehung 32,75. Daher kann man C(q) verwenden, um δ 2 zu finden, und dies ergab δ 2 = 0,017 μm 2 und 0,0032 μm 2 für die 34 bzw. 49 μM Vimentin-Netzwerke (entsprechend δ = 0,13 μm und 0,057 μm).

Abbildung 6: Nichtergodizitätsparameter vs. Wellenzahl für Vimentin-Netzwerke. Von der Anpassung an die ISF wird der Nichtergodizitätsparameter C für einen Bereich von q-Werten bestimmt. In tan (rot) sind die Daten aus Bildern von 0,6 μm Perlen innerhalb von Vimentin-Netzwerken mit einer Vimentin-Konzentration von 34 μM (49 μM). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen in τ über mehrere Filme dar (fünf Filme für die Daten mit dem 34-μM-Netzwerk [tan] und vier Filme für die Daten mit dem 49-μM-Netzwerk [rot]). Die y-Achse hat eine logarithmische Skalierung. Man beobachtet eine q-Abhängigkeit von C , die folgt , die es ermöglicht, die maximale mittlere quadratische Verschiebung zu extrahieren, δ2. Passungen an werden mit den durchgezogenen Linien angezeigt . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Man kann andere Methoden verwenden, um die Einschlussgröße δ aus den Daten sowie den subdiffusiven Exponenten zu extrahieren, der bei der Untersuchung von τ(q) auf Perlen innerhalb des 19 μM Vimentin-Netzwerks gefunden wurde. Erstens kann man die von Bayles et al.76 und Edera et al.77 beschriebene Methode verwenden, um die MSD aus der DDM-Matrix zu extrahieren. Insbesondere erfordert diese Methode keine Anpassung der DDM-Matrix. Man muss nur die DDM-Matrix D(q,Δ t) und (aus der A(q) und B bestimmt werden können) berechnen. Dann, um die MSD zu finden, verwendet man die Beziehung . Beachten Sie, dass diese Methode zum Auffinden des MSD davon ausgeht, dass die Verteilung der Partikelverschiebungen Gauß ist, obwohl frühere Arbeiten gezeigt haben, dass in bestimmten Fällen MSDs, die von DDM abgeleitet sind, mit MSDs aus der Partikelverfolgung übereinstimmen, selbst wenn die Verschiebungen nicht Gauß73 sind. Für dieses System gibt es, wie erwartet78, eine Nicht-Gaußianität in der Verteilung großer Verschiebungen, wie in Abbildung S1 zu sehen ist. Im PyDDM-Paket sollte die Funktion extract_MSD ausgeführt werden, die . Zweitens kann man die Verfolgung einzelner Partikel verwenden, um die MSD zu finden. Obwohl DDM zur Analyse von Bildern verwendet werden kann, bei denen entweder die hohe Dichte von Partikeln oder die begrenzte optische Auflösung eine genaue Partikellokalisierung verhindert, konnten wir für die Bilder von 0,6-μm-Perlen in Vimentin-Netzwerken Perlen mit der Trackpy-Software (https://github.com/soft-matter/trackpy) 79 Perlen lokalisieren und verfolgen. Dieses Partikelverfolgungs-Softwarepaket verwendet die von Crocker und Grier80 beschriebenen Algorithmen.

Abbildung 7: Mittlere quadratische Verschiebung im Vergleich zur Verzögerungszeit für Vimentin-Netzwerke. Die MSD wurde mit zwei Methoden bestimmt. Zuerst wurde der MSD aus der DDM-Matrix berechnet (dargestellt mit durchgezogenen Symbolen). Als nächstes wurde die MSD mithilfe von Single-Particle Tracking (SPT) bestimmt, um Partikeltrajektorien (offene Symbole) zu finden. Fehlerbalken werden auf die gleiche Weise bestimmt, wie in den beiden vorherigen Abbildungslegenden beschrieben. (A) Muskel-Skelett-Erkrankungen für 0,6-μm-Perlen im 19-μM-Vimentin-Netzwerk weisen auf eine subdiffusive Bewegung hin, wobei eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden zur Ermittlung der Muskel-Skelett-Erkrankungen besteht. (B) Muskel-Skelett-Erkrankungen für 0,6-μm-Kügelchen im 49-μM-Vimentin-Netzwerk weisen auf eine Bewegung in Käfighaltung hin, wobei eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden zur Ermittlung der Muskel-Skelett-Krankheit und mit der maximalen Muskel-Skelett-Erkrankung aus dem Nichtergodizitätsparameter besteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die MSDs vs. Lag-Zeit für 0,6 μm-Beads im 19-μM-Vimentin-Netzwerk und im 49-μM-Vimentin-Netzwerk sind in Abbildung 7 dargestellt. In beiden Fällen stimmte die aus DDM ermittelte MSD gut mit der MSD überein, die durch Single-Particle Tracking (SPT) gefunden wurde. Darüber hinaus betrug für das weniger konzentrierte Netzwerk der subdiffusive Skalierungsexponent (α in ) etwa 0,9. Dies steht im Einklang mit der τ(q)-Skalierung von gefunden, indem der ISF angepasst wird, um τ(q) zu bestimmen (d. h. 2/2,2 = 0,9). Für das konzentriertere Netzwerk stagniert die MSD bei längeren Verzögerungszeiten. Die maximale MSD, die durch Analyse der q-Abhängigkeit des Nichtergodizitätsparameters gefunden wurde (dargestellt in Abbildung 7B mit der horizontalen Linie bei δ 2 = 0,0032 μm2), war ungefähr derselbe Wert, auf den sich die Muskel-Skelett-Erkrankungen von SPT und DDM zuzubewegen schienen. In Abbildung 7A besteht eine Diskrepanz zwischen den aus DDM ermittelten MSDs mit der längsten Verzögerungszeit und SPT. Während dies auf eine begrenzte Anzahl von langen Verzögerungszeittrajektorien zurückzuführen sein kann, kann es auch der Fall sein, dass eine weitere Optimierung des Bereichs der q-Werte, für die die DDM-Matrix verwendet wird, um für jede Verzögerungszeit zu schätzen (wie von Bayles et al.76 und Edera et al.77 getan), unsere Ergebnisse verbessern würde. Und eine solche Optimierung wird im Mittelpunkt der zukünftigen Arbeit stehen.

Diese Experimente, bei denen Bildsequenzen von Tracer-Perlen aufgezeichnet wurden, die in ein Netzwerk von Vimentin-Zwischenfilamenten eingebettet waren, ermöglichten unabhängige Analysen: DDM (mit dem hier beschriebenen Paket) und SPT (mit Trackpy). Beide Analysen können den Grad der Subdiffusion und der Einschlusslänge aufdecken, so dass man zwei unabhängige Bildanalysetechniken verwenden kann, um komplementäre Metriken bereitzustellen. Es gibt zusätzliche Mengen, die man aus SPT und DDM vergleichen kann. Zum Beispiel kann sich die Heterogenität in der Dynamik der Stichprobe als Nicht-Gaußianität in der Verteilung der Partikelverschiebungen (d. h. der Van-Hove-Verteilung) aus SPT sowie in einer aus DDM bestimmten ISF, die zu einem gestrecktenExponential 34,35 passt, offenbaren. Abbildung S1 zeigt die Van-Hove-Verteilung für die 0,6-μm-Partikel in Vimentin-Netzwerken und diskutiert den Dehnungsexponenten, der bei der Anpassung der ISFs gefunden wurde - Metriken, die in früheren Studien im Tandem verwendet wurden, um die heterogene Dynamik von Partikeln in biomimetischen Systemen 9,10,47 oder anderen überfüllten Umgebungen zu demonstrieren 34 . Als weiteres Beispiel kann der ISF aus Partikeltrajektorien berechnet werden, die mit SPT gemessen und mit den DDM-erworbenen ISFs verglichen werden. Während die mittleren quadratischen Verschiebungen und Verschiebungsverteilungen die Metriken sind, die am häufigsten aus der SPT-Analyse gezogen werden, kann man die ISF auch aus Partikeltrajektorien berechnen, mit (siehe Abbildung S2). Dieser ISF kann mit DDM-generierten ISFs verglichen und verwendet werden, um eine Dynamik aufzudecken, die im MSD59 nicht offensichtlich ist.

Während die Aufnahme von Bildern von Tracer-Partikeln innerhalb eines Netzwerks es ermöglichen kann, die komplementären Analysemethoden von SPT und DDM zu verwenden, ist es wichtig zu beachten, dass ein Vorteil von DDM gegenüber SPT darin besteht, dass keine Bilder von Perlen (oder anderen Merkmalen) benötigt werden, die leicht lokalisiert und verfolgt werden können. Um diesen Punkt zu demonstrieren, heben wir als nächstes die Analyse aktiver Netzwerke von Aktin- und Mikrotubuli-Filamenten hervor, wobei die fluoreszierende Markierung von Aktin und Tubulin die Abbildung beider Filamenttypen ermöglicht, die sich über verschiedene Fluorophore voneinander unterscheiden, mit einem mehrfarbigen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop.

Die Bilder wurden mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop von Aktin-Mikrotubuli-Netzwerken mit Aktivität aufgenommen, die durch Myosin (Kaninchen-Skelettmuskel-Myosin II; Zytoskelett #MY02). Details der Experimente und Ergebnisse wurden zuvorbeschrieben 11, und die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Analyse von zwei Filmen, die in den ergänzenden Materialien (Filme S1 und S4) für11 bereitgestellt wurden. Beide Bildsequenzen wurden mit 2,78 Bildern/s für 1000 Bilder aufgenommen.

Zur Analyse dieser Bilder wurde die DDM-Matrix für 50 Verzögerungszeiten von 0,4 s bis 252 s (1 Frame bis 700 Frames) berechnet. Die DDM-Matrix wurde dann an das Modell angepasst, wobei die Zwischenstreufunktion war . Es gibt daher vier Anpassungsparameter: A, τ, s und B. Die Ergebnisse dieser Anpassungen sind in Abbildung 8 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass die DDM-Matrix für einen bestimmten q-Wert bei niedrigen Verzögerungszeiten ein Plateau aufwies, mit der Verzögerungszeit zunahm und dann zu großen Verzögerungszeiten ein Plateau aufwies (oder Anzeichen eines Plateaubeginns zeigte). Die DDM-Matrix für die unteren Werte von q erreichte bei langen Verzögerungszeiten kein Plateau. Man sollte daher eine schlechte Genauigkeit bei der Messung der Zerfallszeit für diese niedrige q-Dynamik (große Längenskala) erwarten.

Die charakteristischen Abklingzeiten τ von der Anpassung an die DDM-Matrix sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Ergebnisse werden für ein aktives Aktin-Mikrotubuli-Verbundnetzwerk (ähnlich dem Film S1 11) und für ein aktives Aktinnetzwerk (ähnlich dem Film S411) vorgestellt. Beide Netzwerke wurden mit den gleichen Konzentrationen von Aktin und Myosin hergestellt, aber das reine Aktinnetzwerk wurde ohneTubulin erzeugt, wie in 11 beschrieben. Für diese beiden Arten von aktiven Netzwerken war die beobachtete Potenzgesetzbeziehung . Diese Skalierung zeigt eine ballistische Bewegung an und dass die Myosin-getriebene Kontraktion und der Fluss die thermische Bewegung der Filamente dominieren. Aus τ = (vq)-1 konnte eine charakteristische Geschwindigkeit v von etwa 10 nm/s für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerk und 75 nm/s für das aktive Aktinnetzwerk gefunden werden. Diese Werte stimmen mit der Partikelbild-Velocimetrie-Analyse der gleichen Videos überein, die in11 gezeigt werden. Die Skalierung hielt bei den niedrigeren q-Werten für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk nicht an. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die wahren Zerfallszeiten für dieses Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk bei den niedrigeren q-Werten länger sind als die maximale Verzögerungszeit der berechneten DDM-Matrix. Die maximale Verzögerungszeit ist mit der horizontalen roten Linie in Abbildung 9 angegeben, und die Zerfallszeiten wichen von der erwarteten Skalierung in der Nähe dieser längeren Zeiten ab.

Abbildung 8: DDM-Matrix vs. Verzögerungszeit für ein aktives Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk. Die DDM-Matrix für mehrere Werte von q wird als Funktion der Verzögerungszeit aus einem Film eines zusammengesetzten Netzwerks dargestellt, das aus 2,9 μM-Aktinmonomeren, 2,9 μM-Tubulindimeren und 0,24 μM-Myosin besteht. Diese Daten zeigen die Analyse nur des Mikrotubuli-Kanals einer mehrfarbigen Zeitreihe von Bildern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Abklingzeit vs. Wellenzahl für aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerke. Aus der Anpassung der DDM-Matrix wird die Abklingzeit τ als Funktion der Wellenzahl q ermittelt. Dargestellt ist τ vs q für Bilder eines aktiven Aktin-Mikrotubuli-Netzwerks (Analyse nur des Mikrotubuli-Kanals) in braun und für Bilder eines aktiven Aktinnetzwerks in grün. Beide Netzwerke haben die gleichen Konzentrationen von Aktin und Myosin (2,9 μM bzw. 0,24 μM); Der Aktin-Mikrotubuli-Komposit hat 2,9 μM Tubulin-Dimere. Die Zerfallszeiten für das aktive Aktinnetzwerk sind viel kleiner als die Zerfallszeiten für das aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerk, was auf eine schnellere Bewegung des aktiven Aktinnetzwerks hinweist. In beiden Fällen ist die Dynamik ballistisch, da die Daten einem Trend folgen. Inset: Das Diagramm der ISFs im Vergleich zur Verzögerungszeit, skaliert durch die Wellenzahl (Δt × q), zeigt einen Zusammenbruch der ISFs über einen Bereich von q-Werten. Dies deutet auch auf ballistische Bewegung hin. Die in diesem Inset gezeigten ISFs stammen aus dem aktiven Aktinnetzwerk. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für diese Daten aktiver Netzwerke haben wir uns für die DDM-Matrix entschieden.  Dies steht im Gegensatz zu dem, was für die Daten von Perlen im Vimentin-Netzwerk getan wurde, wo A (q) und B ohne jegliche Anpassung zur Isolierung der ISF, f (q,Δ t) geschätzt wurden. In diesem Fall wurden für die aktiven Netzdaten A und B als Anpassungsparameter belassen, da die zur Schätzung von B verwendeten Methoden nicht zu guten Anpassungen führten. Die Standardmethode zur Schätzung von B besteht darin, zu berechnen und davon auszugehen, dass dies im Großen und Ganzen nach B/2 geht. Diese Methode überschätzte B jedoch für diese Daten, was sich in der Tatsache zeigte, dass bei der Berechnung der auf diese Weise geschätzten (nicht gezeigten) ISFs aus B zu frühen Verzögerungszeiten größer als 1 waren (während sie von einem Maximum von 1 entweder auf Null oder einen Nichtergodizitätsparameter mit zunehmender Verzögerungszeit gehen sollten). Man kann andere Methoden zur Schätzung von B mit dem Parameter background_method auswählen. Eine dieser anderen Methoden besteht darin, B zu frühen Verzögerungszeiten als das Minimum der DDM-Matrix zu schätzen (festgelegt mit background_method=1). Eine ähnliche Methode wurde von Bayles et al.76 verwendet, obwohl sie nicht davon ausgingen, dass B mit q konstant war. Eine andere Möglichkeit besteht darin, B als Durchschnittswert über alle Verzögerungszeiten der DDM-Matrix beim maximalen q (festgelegt mit background_method=2) zu schätzen. Diese verschiedenen Methoden zur Schätzung des Hintergrunds sowie die Ergebnisse, mit denen B als freier Anpassungsparameter zugelassen werden kann, sind in Abbildung 10 dargestellt. Aus diesen Diagrammen kann man sehen, dass die Amplitude, A, bei den größten untersuchten q-Werten nicht Null erreichte, da sie bei großen q kein Plateau erreichte (Abbildung 10B), und da D (q max, Δ t) von einem niedrigerenVerzögerungszeitplateau zu einem höheren Verzögerungszeitplateau überging (dh bei q max gab es ein Nicht-Null-A; Abbildung 10D). Daher wäre weder eine Schätzung von B als noch wie angemessen. Man sollte vs. q und D(qmax, Δ t) vs.Δ t inspizieren, bevor man entscheidet, wie (oder ob) man B schätzt.

Abbildung 10: Hintergrund vs. Wellenzahl für aktive Aktin-Mikrotubuli-Netzwerke. Aus der Anpassung der DDM-Matrix kann man den Hintergrund B als Funktion der Wellenzahl q finden. Gezeigt wird B vs. q für Bilder eines aktiven Aktin-Mikrotubuli-Netzwerks (das nur den Mikrotubuli-Kanal analysiert), das aus diesen Passungen mit den violetten Symbolen bestimmt wird . Die drei durchgezogenen Linien in (A) zeigen Schätzungen des Hintergrunds, der ohne Anpassung gefunden wurde. Die obere, dunkelste Linie in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund mit , was angemessen sein kann, wenn ein Plateau auf einen konstanten Wert bei großem q erreicht wird. Beachten Sie von (B), dass bei der größten untersuchten q noch kein konstanter Wert erreicht wurde. Daher wird bei der Verwendung dieser Methode der Hintergrund überschätzt. Die untere Zeile in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund mit . Wenn die DDM-Matrix ein niedriges Verzögerungszeitplateau aufweist, wie in (C) mit der roten Linie gezeigt, kann diese Methode zur Schätzung des Hintergrunds geeignet sein. Die mittlere, hellste Linie in (A) zeigt den geschätzten Hintergrund von . Diese Methode kann geeignet sein, wenn bei qmax die Amplitude A Null erreicht hat. Aus (D) geht hervor, dass die Amplitude ungleich Null ist und diese Methode daher den Hintergrund überschätzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Wahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikelverschiebungen. Wahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikelverschiebungen zeigen Nicht-Gaußianität für Vimentinkonzentrationen von 34 μM und 49 μM. Einzelpartikel-Tracking von Perlen mit einem Durchmesser von 0,6 μm wurde in Vimentin-Netzwerken unterschiedlicher Konzentration durchgeführt. Unterschiedliche Verzögerungszeiten werden in den Verschiebungsverteilungen für die drei Bedingungen angezeigt. (A) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 19 μM Vimentin-Netzwerk ist mit einer Gaußschen Funktion vereinbar. Die Breite des Gauß nimmt mit zunehmender Verzögerungszeit zu. (B) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 34-μM-Vimentin-Netzwerk zeigt eine größere Nicht-Gaußianität, insbesondere bei großen Verschiebungen, als im 19-μM-Fall. (C) Die Verteilung der Partikelverschiebungen in einem 49 μM Vimentin-Netzwerk zeigt ebenfalls eine Nicht-Gaußianität. Darüber hinaus nehmen die Breiten der Verteilungen mit der Verzögerungszeit nicht so signifikant zu wie in den Proben mit niedrigeren Vimentin-Konzentrationen, was auf eine begrenzte Bewegung hinweist. Nicht-Gaußsche Van-Hove-Verteilungen (beobachtet für alle Vimentin-Proben, aber am deutlichsten in den höheren Konzentrationen) sind mit einer heterogenen Dynamik verbunden, wie sie häufig beim Transport von Partikeln in überfüllten und begrenzten Umgebungen beobachtet wird. Ein weiterer Indikator für den heterogenen Transport, der aus der DDM-Analyse bestimmt wird, ist der Dehnungsexponent, der verwendet wird, um die Zwischenstreufunktion anzupassen (die Parameter s in der Gleichung für die ISF, die hier verwendet wird: + ). Die durchschnittlichen Dehnungsexponenten über den q-Bereich von 0,4 μm-1 bis 9,4 μm-1 sind, von der höchsten Vimentinkonzentration bis zur niedrigsten, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 und 0,86 ± 0,04 (Mittelwert ± Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Die Zwischenstreufunktionen aus DDM und SPT. Die Zwischenstreufunktionen (ISF) für fünf verschiedene Wellenzahlen werden gezeigt. Die ISF-Verzögerungszeit, die durch DDM gefunden wurde, wird mit kreisförmigen Markern dargestellt und die ISF aus Einzelteilchentrajektorien mit offenen Quadraten berechnet. Gepunktete schwarze Linien zeigen die Passungen zu den von DDM erworbenen ISFs. Der ISF wird aus Einzelteilchentrajektorien berechnet, wobei . In (A) ist der ISF für 0,6 μm Partikel in den 19 μM Vimentin-Netzwerken dargestellt. In (B) ist der ISF für 0,6 μm Partikel in den 34 μM Vimentin-Netzwerken dargestellt. Die Diskrepanzen in der ISF, die von DDM und SPT gefunden wurden, sind wahrscheinlich auf eine begrenzte Anzahl von langen Verzögerungszeitverläufen zurückzuführen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Protokoll für die Verwendung von DDM. Die Eingabe und Ausgabe der im Protokoll angezeigten Schritte werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Details zur Probenvorbereitung und Beispielparameterdateien für vimentin-Netzwerke. Detaillierte Schritte zur Probenvorbereitung und Bildaufnahme auf vimentin-Netzwerken werden bereitgestellt. Zusätzlich wird eine Beispielparameterdatei für die Analyse von Daten bereitgestellt, die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zu vimentin-Netzwerken vorgestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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