Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Unser Protokoll kann die Dynamik in vielen Systemen mit einer Reihe von optischen Mikroskopietechniken quantifizieren. Wir zeigen auf, wie diese Methode insbesondere dazu beitragen kann, die Dynamik rekonstituierter Zytoskelettnetzwerke zu charakterisieren. Der Hauptvorteil der Verwendung unseres Softwarepakets für differentielle dynamische Mikroskopie besteht darin, dass es gut dokumentiert ist, über mehrere Beispielanalysedateien verfügt und leicht angepasst werden kann, um verschiedene Arten von Dynamik zu untersuchen.

Mit unserem Softwarepaket kann die Dynamik nicht nur in rekonstituierten Zytoskelettnetzwerken, sondern auch in anderen weichen und biologisch relevanten Materialien quantifiziert werden. Basierend auf den Zeit- und Längenskalen zur Sonde erfassen Sie Bildsequenzen von über 1.000 Bildern mit Mikroskopsteuerungssoftware wie Micro-Manager. Erstellen Sie im Beispielordner im PyDDM-Code-Repository eine Kopie der Parameterdatei mit dem Namen example_parameter_file.yml.

Öffnen Sie diese EML-Datei mit einem Texteditor wie Notepad+ oder dem Texteditor in JupyterLab. Geben Sie in der kopierten EML-Datei das Datenverzeichnis und den Dateinamen an, die der zu analysierenden Bildsequenz entsprechen. Geben Sie im Abschnitt Metadaten die Pixelgröße und die Bildrate an.

Wählen Sie im Abschnitt Analyseparameter die Parameter für die Berechnung der DDM-Matrix aus, z. B. die Anzahl der verschiedenen Verzögerungszeiten und die längste Verzögerungszeit. Geben Sie im Abschnitt Anpassungsparameter Details zum Anpassen der DDM-Matrix oder der Zwischenstreufunktion an, z. B. den Namen des Modells und des Modellparameters, die Anfangsschätzung, die untere Grenze und die obere Grenze. Initialisieren Sie eine Instanz der DDM-Analyseklasse, indem Sie die Metadaten in den Analyseparametern bereitstellen, indem Sie den Dateinamen der EML-Datei mit dem vollständigen Dateipfad zur DDM-Analyse übergeben.

Alternativ können Sie die Metadaten und Parameter als Datenstruktur des Python-Wörterbuchs übergeben. Führen Sie die Funktion aus, um die DDM-Matrix zu berechnen. Überprüfen Sie die zurückgegebenen Daten mit den zugehörigen Variablen und Metadaten, die als Dataset im Xarray-Paket gespeichert sind.

Überprüfen Sie dann die Plots und Figuren, die als PDF-Datei und das Datenverzeichnis gespeichert werden. Eines dieser Diagramme zeigt die Standardmethode für die Schätzung des Hintergrunds. Ändern Sie bei Bedarf die Methode, bei der der Hintergrund geschätzt wird, mithilfe der Parameterhintergrundmethode entweder in der EML-Datei oder als optionales Schlüsselwortargument in die Funktion DDM-Matrix berechnen.

Initialisieren Sie eine Instanz der DDM-Anpassungsklasse, indem Sie den Dateinamen der EML-Datei übergeben, die die Bildmetadaten und Anpassungsparameter enthält. Listen Sie die verfügbaren Modelle auf, indem Sie die Funktion passende Modelle drucken ausführen. Geben Sie das zu verwendende Modell in der EML-Parameterdatei oder mithilfe der Funktion Anpassungsmodell nach Name neu laden an.

Legen Sie für jeden Parameter im ausgewählten Modell die anfänglichen Vermutungen und Grenzen fest, wenn sie von den in der EML-Datei angegebenen Werten abweichen, indem Sie die Funktionen set parameter initial guess und set parameter bounds verwenden. Führen Sie die Anpassung mit der Funktion fit aus. Generieren Sie mit dem Funktionsanpassungsbericht Diagramme zur Überprüfung der Anpassungen in der q-Abhängigkeit der Anpassungsparameter.

Überprüfen Sie die Ausgabe einschließlich der Abbildung mit zwei mal zwei Nebendiagrammen, die die DDM-Matrix oder ISF bei vier q-Werten zusammen mit der Anpassung anzeigen. Verwenden Sie die Klassensuche DDM Fits in der Jupyter Notebook-Umgebung, um die DDM-Matrix oder ISF zusammen mit der besten Passform auf interaktive Weise darzustellen. Wenn Sie auf einen Punkt im Abklingzeit- und Wellenzahldiagramm klicken, werden die Daten und die Anpassung angezeigt.

Überprüfen Sie die Ergebnisse der in einem Xarray-Dataset gespeicherten Anpassung und verwenden Sie die Funktion zwei netCDF oder das integrierte Pickle-Modul von Python, um diese Datenstruktur auf der Festplatte zu speichern. Die DDM-Analyse wurde an der Hellfeld-Bildserie von 0,6-Mikron-Perlen in einem Vimentin-Netzwerk und konfokalen Mikroskopbildern aus einem aktiven Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk mit spektral unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt. Zwischenstreufunktionen wurden als Funktion der Verzögerungszeit bei verschiedenen Wellenzahlen und einem Netzwerk mit einer Vimentinkonzentration von 19 Mikromolaren und 34 Mikromolaren dargestellt.

Das lange Verzögerungszeitplateau der Funktion bei einem Wert weit über Null weist auf Nichtergodizität hin. Die Zerfallszeit tau, dargestellt als Funktion von q für zwei Netzwerke mit unterschiedlichen Vimentinkonzentrationen zeigt subdiffusive oder begrenzte Bewegung. Die Nichtergodizitätsparameter c, die als Funktion von q im Quadrat für das Netzwerk mit 34 und 49 mikromolarem Vimentin aufgetragen wurden, zeigten, dass der Logarithmus von c proportional zu q im Quadrat war, wie für eine begrenzte Bewegung erwartet.

Die mittleren Quadratverschiebungs- versus Verzögerungszeitdiagramme zeigten, dass die aus DDM ermittelten Werte gut mit denen übereinstimmten, die durch Einzelpartikelverfolgung gefunden wurden. Für das konzentriertere Netzwerk stagniert der Wert bei längeren Verzögerungszeiten. DDM-Matrix versus Verzögerungszeit für ein aktives Aktin-Mikrotubuli-Kompositnetzwerk zeigte, dass die DDM-Matrix für einen bestimmten q-Wert bei niedrigen Verzögerungszeiten ein Plateau aufwies und dann bei großen Verzögerungszeiten weiter auf einem Plateau anstieg.

Die charakteristischen Zerfallszeiten tau von der Anpassung an die DDM-Matrix zeigen, dass die Beziehung zwischen tau und q auf ballistische Bewegung hinweist. Nach der Entwicklung dieses PyDDM-Softwarepakets haben wir es verwendet, um die anisotrope und zeitvariable Dynamik von aktiven Zytoskelettnetzwerken und anderen Systemen zu untersuchen.