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Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

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DOI:

10.3791/63950

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30. November 2022

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1Biobank for Translational and Digital Medicine Unit, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Division of Pathology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 3Department of Oncology and Hemato-Oncology, University of Milan, 4Patient Safety & Risk Management Service, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 5Scientific Directorate, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Zusammenfassung

Biobanken sind wichtige Forschungsinfrastrukturen, die auf die Sammlung, Lagerung, Verarbeitung und gemeinsame Nutzung hochwertiger humanbiologischer Proben und zugehöriger Daten für Forschung, Diagnose und personalisierte Medizin abzielen. Die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology (IEO) ist ein Meilenstein auf diesem Gebiet. Biobanken arbeiten mit klinischen Abteilungen, internen und externen Forschungsgruppen und der Industrie zusammen und unterstützen die Behandlung und den wissenschaftlichen Fortschritt von Patienten, einschließlich innovativer Diagnostik, Biomarkerentdeckung und klinischem Studiendesign. Angesichts der zentralen Rolle von Biobanken in der modernen Forschung sollten Biobanking-Standardarbeitsanweisungen (SOPs) äußerst präzise sein. SOPs und Kontrollen durch zertifizierte Spezialisten gewährleisten höchste Probenqualität für die Umsetzung wissenschaftlich fundierter, diagnostischer, prognostischer und therapeutischer personalisierter Strategien. Trotz zahlreicher Bemühungen zur Standardisierung und Harmonisierung von Biobanken sind diese Protokolle, die strengen Regeln, Qualitätskontrollen und Richtlinien folgen, die auf ethischen und rechtlichen Grundsätzen basieren, jedoch nicht leicht zugänglich. Dieses Papier stellt die Standardarbeitsanweisungen der Biobank eines großen Krebszentrums vor.

Einleitung

Biobanken sind Biorepositorien, die auf die Sammlung, Lagerung, Verarbeitung und gemeinsame Nutzung menschlicher biologischer Proben und zugehöriger Daten für Forschung und Diagnose abzielen. Ihre Rolle ist nicht nur für die Entdeckung und Validierung von Biomarkern von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Entwicklung neuer Medikamente1. Daher ist die überwiegende Mehrheit der translationalen und klinischen Forschungsprogramme auf den Zugang zu qualitativ hochwertigen Bioproben angewiesen. In dieser Hinsicht gelten Biobanken als Brücke zwischen akademischer Forschung und der pharmazeutischen/biotechnologischen Industrie 2,3,4,5. Aufgrund der beispiellosen Möglichkeiten, die Big Data Collecting und künstliche Intelligenz bieten, entwickelt sich die Rolle von Biobanken in der Krebsforschung kontinuierlich weiter6.

Das breite Spektrum an Biomaterialien, die von Biobanken verarbeitet werden, ist mit klinisch-opathologischen Informationen gekoppelt, einschließlich demographischer und Umweltdaten, Tumortyp, histologischer Grad, Stadium, Vorhandensein einer lymphovaskulären Invasion und Biomarkerstatus 7,8. Je mehr qualitativ hochwertige Proben und Daten verfügbar sind, desto schneller wird die Forschung voranschreiten und sich auf die Gesundheitsversorgung auswirken9. Es gibt einen strengen regulatorischen Rahmen, der auf ethischen und rechtlichen Grundsätzen basiert und weit verbreiteten SOPs, Qualitätskontrollen und Richtlinien folgen sollte (z. B. das U.S. National Cancer Institute, die U.K. Confederation of Cancer Biobanks und die E.U. International Society for Biological and Environmental Repositories)10,11.

Die Entwicklung von SOPs für alle wichtigen Aspekte von Biobanken bringt mehrere Vorteile in Bezug auf Qualität, Rückverfolgbarkeit, Konsistenz, Reproduzierbarkeit und Durchlaufzeiten12,13. Ein weiterer wichtiger Aspekt der SOP-Implementierung ist die Optimierung des Biobankmanagements, die bessere Problemlösungen und alternative Verfahren für Biobankmitarbeiter und Forscher ermöglicht14. All diese Facetten sind Teil des Biobank-Workflows (Abbildung 1).

Diagramm der Biobank; Der Prozess umfasst LIMS, Datenschutz, Bioproben, Forschung, rechtliche und soziale Aspekte.
Abbildung 1: Verschiedene Faktoren, die zur Optimierung des Biobankings beitragen. Abkürzung: LIMS = Labor-Informations-Management-System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diese hochspezifischen und sensiblen Daten erfordern strenge Management-Standardverfahren im Biobanking. Ein detailliertes und validiertes Projektformular sollte allen Forschern zur Verfügung gestellt werden, die Zugang zu den Biobankproben und -daten benötigen. Die in der Anfrage bereitgestellten Informationen sollten die Studienmethodik und das Studiendesign, die Ziele, die Ziele und das Budget umfassen. Es sollte ein technisch-wissenschaftlicher Ausschuss für Biobank eingerichtet werden, dessen Hauptaufgabe die Bewertung von Anträgen für Forschungsprojekte ist. Dieses Gremium sollte Mitglieder der Biobank-Einheit, der klinischen Abteilungen, der Forschungsgruppen, des Datenschutzes, der Rechtsabteilung und der Technologietransferstelle umfassen.

Die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit des European Institute of Oncology (IEO) ist eine weltweite Referenz für Biobanken in Bezug auf Qualität und Quantität der erbrachten Dienstleistungen sowie Innovation. Diese vollständig zertifizierte Einrichtung (UNI EN ISO 9001:2015-Certiquality) ist ein integraler Bestandteil des italienischen BBMRI-ERIC-Knotens (d.h. Biobanking and BioMolecular Resources Research Infrastructure) und interagiert sowohl mit klinischen Einheiten als auch mit der Forschungsinfrastruktur.

Es gibt eine große Heterogenität in den Arten von Bioproben, die von Biobanken gelagert werden. Dazu gehören Gewebeproben - entweder frisch gefrorene oder paraffinkonservierte - Bioflüssigkeiten (z. B. Plasma, Serum, Blut, Urin, Stuhl), Zellkulturen und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs). Unsere Biobank arbeitet synergetisch mit der europäischen Forschungsinfrastruktur für Biobanking (BBMRI-ERIC), die eines der größten Biobanknetzwerke in Europa ist und ein Portal für den Zugang zu Biobanken und biomolekularen Ressourcen bietet, die von nationalen Knoten koordiniertwerden 15. Neben BBMRI-ERIC hat auch die International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER) eine wichtige Rolle bei der Standardisierung von Betriebsverfahren für Biobankinggespielt 16.

Die Biobank-Einheit, die Teil der Abteilung für Pathologie ist, engagiert sich für die Zentralität des Patienten, die Unterstützung der Entwicklung der klinischen Forschung, die kontinuierliche Verbesserung, die Verbesserung der Humanressourcen, die internationale Zusammenarbeit, die Unterstützung von Schulungsveranstaltungen, die Sicherheit am Arbeitsplatz und das wissenschaftliche und technologische Wachstum. Die gemeinsame Vision ist es, die nationalen und europäischen Meilensteine für Biobanken in Bezug auf Qualität und Quantität von Dienstleistungen und Innovation zu schaffen. Die gesammelten biologischen Proben werden verwendet, um neue Biomarker und neue Medikamente zu identifizieren (z. B. um zunehmend personalisierte Therapien zu entwickeln) und um die beste verfügbare Behandlung für Patienten durch Exzellenz in der Forschung zu gewährleisten.

Jede biologische Probe wird nach vorheriger Überprüfung auf das Vorhandensein der vom Patienten ausgedrückten Vereinbarung über die Teilnahme an der wissenschaftlichen Forschung gesammelt und behandelt15. Biologisch gesammelte Proben werden zur Durchführung von Forschungsprojekten oder klinischen Studien verwendet und umfassen überschüssige (dh nicht für diagnostische Zwecke benötigte) pathologische und nicht-pathologische chirurgische Proben, flüssige Biopsien (z. B. Blut, Serum, Plasma und Urin) und andere biologische Proben. Diese Biomaterialien werden nach speziellen Kryokonservierungsprotokollen gelagert. Dieses Papier enthält die Biobankprotokolle eines großen Krebszentrums.

Protokoll

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die SOPs, die für Brust-, Eierstock-, Prostata-, Lungen- und Darmkrebs verwendet werden. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden vom Wissenschaftlich-Technischen Ausschuss, der Ethikkommission (EC) und den Direktoren für Brust-, Gynäkologie-, Urologie-, Thoraxchirurgie- und Verdauungschirurgie-Programme genehmigt. Die Studienverfahren folgen der Deklaration von Helsinki von 1964, der Datenschutz-Grundverordnung (DSGVO) von 2018 und den nachfolgenden Änderungen. Eine institutionelle Forschungsbeteiligungsvereinbarung (RPA), abgeleitet aus dem DSGVO-Gesetz, stellt die informierte Einwilligung aller Patienten dar, biologische Proben sowie persönliche, klinische und genetische Daten zu sammeln. Die RPA wurde von allen Patienten zur Speicherung, Verarbeitung und Nutzung der erhaltenen Daten für wissenschaftliche Zwecke erhalten.

1. Voraussetzungen für biologische Proben

  1. Überprüfen Sie, ob ein Patient die Bedingungen für die Aufnahme in die Aufnahme auf der Grundlage des RPA- und Projektprotokolls erfüllt, und stellen Sie allen Patienten eine detaillierte RPA-Beschreibung zur Verfügung.
    1. Erhöhen Sie das Patientenengagement, z. B. senden Sie ein Lehr-Cartoon-Video in Wartezimmern, um die Patienten über die Bedeutung und die Auswirkungen von RPA zu informieren. Stellen Sie allen Patienten Gadget-Lesezeichen zur Verfügung (siehe die frei zugängliche kurze Cartoon-Animation unter https://www.ieo.it/it/PER-I-PAZIENTI/I-diritti-del-paziente/Consensi-informati/ und https://vimeo.com/679070846).
    2. Schulung des Personals für die Durchführung der Einwilligungsverabreichung während jeder Krankenhausaufenthaltsphase und Bereitstellung zusätzlicher Informationen, wenn die Patienten an einer bestimmten Studie teilnehmen.
      HINWEIS: Wenn die RPA nicht signiert ist, werden keine biologischen Proben gesammelt.
    3. Vermeiden Sie Fälle, die eine Infektion durch SARS-CoV-2 (COVID-19), Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV) und Humanes Immundefizienzvirus (HIV) aufweisen.

2. Biobank-Software

  1. Verwenden Sie LIMS-Software (Laboratory Information Management System), um alle biologischen Proben zu verfolgen. Stellen Sie die Verfügbarkeit eines guten Betriebssystems sicher, das bei der Patientenregistrierung automatisch persönliche und klinische Informationen erhält und in Krankenakten, Verwaltungsfälle, RPA und pathologische Patientendaten integriert werden kann, wie in Abbildung 2 dargestellt.
  2. Stellen Sie die Erfassung der biologischen Proben mit der Biobank-Software sicher.
    1. Identifizieren Sie Patienten mithilfe von Codes. Weisen Sie jeder Person einen eindeutigen Code zu, der mit der Krankenaktennummer übereinstimmt (individueller Besuch, Art der Patientenleistung).
      HINWEIS: Bei der Registrierung wird die wissenschaftliche RPA im Betriebssystem elektronisch aktualisiert.
  3. Generieren einer aliquoten ID
    1. Geben Sie das Jahr und die anatomische Stelle oder den Biofluidtyp (Tabelle 1) an, von dem die Probe stammt (Tabelle 2), und fügen Sie eine fortlaufende eindeutige Nummer pro Probe hinzu.
    2. Fügen Sie bei bilateralen Organen eine fortlaufende Nummer hinzu, um den Ursprung der biologischen Probe vom rechten oder linken Organ zu unterscheiden. Weisen Sie die Abkürzung mit dem Suffix 1 (für links) oder 2 (für rechts) zu - zwei Ziffern.
      HINWEIS: Zum Beispiel sieht eine detaillierte ID wie "12-B-00100-01" aus, wobei 12 das Jahr und B das Organ = Brust angibt.
  4. Registrieren Sie sich mit einer ID für jeden Aliquot
    1. Verfolgen Sie zwei Makrotypen biologischer Proben: Feststoffe und Flüssigkeiten.
    2. Unterteilen Sie in Unterkategorien: frische Proben und gefrorene Proben.

Diagramm des Biobank-Managementsystems; LIMS, Datenbankstruktur für Abfragen, Statistiken, klinische Daten.
Abbildung 2: Eine repräsentative Schnittstelle der Biobank LIMS. Die wissenschaftliche RPA wird elektronisch vom Server für klinische Aufzeichnungen aktualisiert. Abkürzungen: LIMS = Labor-Informations-Management-System; RPA = Research Participation Agreement. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Biofluid-Typen und entsprechende Codes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Gewebeprobentypen und entsprechende Codes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Probenentnahme

  1. Tägliche Erstellung des Operationsplans
    1. Stellen Sie fest, ob der Patient die RPA unterzeichnet hat oder nicht und ob er berechtigt ist.
    2. Überprüfen Sie die folgenden Bedingungen:
      1. Überprüfen Sie die Einhaltung der Einschlusskriterien durch den Patienten: Melden Sie jeden positiven Fall von HIV, HBV, HCV und COVID-19 in das entsprechende Feld für das Infektionsrisiko "RI", um die Entnahme biologischer Proben zu vermeiden.
      2. Überprüfen Sie, ob der Patient an einer klinischen Studie oder einem bestimmten genehmigten Forschungsprojekt teilnimmt, indem Sie das Feld Studie/Projekt in jedem Patientenprofil korrekt ausfüllen.
      3. Informieren Sie Techniker, wenn das Infektionsrisiko unbekannt ist. Verwerfen Sie Proben mit positiven Ergebnissen oder unbekannten Risiken.
  2. Verarbeiten und lagern Sie Proben in der Biobank, wie in Abbildung 3 dargestellt.
    1. Sammeln Sie frische und gefrorene Gewebeproben von Patienten, die sich einer Operation unterzogen haben.
    2. Sammeln Sie zytologische Proben, entweder durch aspirative oder esfoliative Techniken, für chirurgisch entfernte kleine Läsionen.
    3. Sammeln Sie biologische Flüssigkeiten (z. B. Blut, Serum, Plasma, PBMC, Wangenschleimhautabstrich, Urin, Kot und Aszites) von Patienten in der prähospitalisierten Phase, Patienten, die an klinischen Studien teilnehmen, und allen anderen Probanden, die an genehmigten Screening-Projekten beteiligt sind.

Diagramm zur Entnahme von Bioflüssigkeiten und Gewebeproben für Patienten; Enthält Blut, Serum, Plasma, Gewebealiquote.
Abbildung 3: Beispielhierarchie. Von einem einzigen Patienten werden mehrere Unterkategorien von Episoden verarbeitet und in der Biobank gespeichert. Abkürzungen: PMBCs = periphere mononukleäre Blutzellen; LIMS = Labor-Informations-Management-System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Blutentnahme

  1. Sammeln Sie das Blut des Patienten in 6-ml-Vakutainern, die das Gerinnungshemmer Na 2 EDTA (7,2 mg, sprühgetrocknet) enthalten. Registrieren Sie die Staubsauger mit der Nummer der Krankenakte und dem Episodencode und verarbeiten Sie sie auf zwei verschiedene Arten: frisch oder gefroren.
  2. Für frische Proben registrieren Sie die Blutproben in der Biobank-Software. Beschriften Sie die Staubsauger mit dem Biobank-ID-Code und liefern Sie sie an die autorisierten Benutzer aus.
  3. Für gefrorene Proben, die in der Biobank gelagert werden, bereiten Sie zwei Cryobank 2D-kodierte Röhrchen mit jeweils 900 μl Blut vor (Abbildung 4). Registrieren Sie die Aliquots in der Biobank-Software, legen Sie sie auf eine bestimmte Barcode-Platte und lagern Sie sie in Gefrierschränken (−80 °C), um eine konstante Temperatur zu gewährleisten.

Fläschchen für Laborproben, Barcode-Scanner und Mikroröhrchenschalen für die biologische Analyse.
Abbildung 4: Gefrorenes Probenmaterial . (A) 2D-Barcode-Röhrchen, (B) Barcode-Lesegerät für Einzelröhrchen und (C) Röhrenplatte für Registrierung und Lagerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Entnahme von Serumproben

  1. Sammeln Sie das Blut des Patienten in 6 ml Vakuum-"Kunststoff-Serumröhrchen", die sprühbeschichtete Kieselsäure enthalten, um die Gerinnung zu induzieren. Lassen Sie die Staubsauger 3 h bei Raumtemperatur (RT), um die Gerinnung einzuleiten, und zentrifugieren Sie dann bei 828 x g für 10 min bei 20 °C.
  2. Lagern Sie Serum (450 μL) in 0,5 ml Cryobank 2D-kodierten Röhrchen mit insgesamt 3-4 Aliquoten für jede Probe. Wenn das Serumvolumen des letzten Aliquots weniger als 450 μL beträgt, geben Sie es bei der Registrierung als "LEFTOVER" an, um die korrekte Menge des gefrorenen Serums zu verfolgen.
  3. Registrieren Sie die Aliquots in der Biobank-Software, legen Sie sie auf eine bestimmte Barcode-Platte und lagern Sie sie in Gefrierschränken (−80 °C), um eine konstante Temperatur zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die Anzahl der Aliquots hängt von der anfänglichen Menge an entnommenem Vollblut und der Menge des erhaltenen Serums ab.

6. Periphere mononukleäre Blutzellisolierung

  1. Öffnen Sie die Laminar-Flow-Haube und reinigen Sie sie mit 70% Ethanol. Bereiten Sie den Beutel für biologische Abfälle, sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ein leeres steriles 50 ml konisches Röhrchen vor.
  2. Gießen Sie das Blut (aus EDTA-Sammelröhrchen) in das leere sterile 50 ml konische Röhrchen und verdünnen Sie es 1:1 mit sterilem 1x PBS (z. B. 15 ml Blut + 15 ml 1x PBS). Verwenden Sie das PBS, um den Blutschlauch zu spülen.
  3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 30 min bei 20 °C und verarbeiten Sie die Röhrchen unter einer Biogefahrenhaube. Gewinnen Sie die mittlere weiße Schicht mit PBMCs mit einer Pasteur-Pipette zurück und legen Sie sie in ein neues steriles 50-ml-konisches Röhrchen. Fügen Sie bis zu 45 ml PBS hinzu, um die PBMCs zu waschen, zu mischen und bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zu zentrifugieren. Gewinnen Sie das Pellet zurück, resuspendieren Sie es in PBS und zählen Sie die Zellen mit Einweg-Burker-Kammern.
    HINWEIS: Das Volumen von PBS hängt vom Pellet ab. Aus 15 ml Blut ein Resuspensionsvolumen von 2-3 ml und dann eine Verdünnung von 1:10 zu zählen. Gleichung (1) verwenden:
    Mittelwert von 3 Quadraten × 10.000 × Verdünnungsfaktoren × ml Resuspensionsvolumen = Anzahl der Gesamtzellen (1)
  4. Die PBMCs erneut mit PBS waschen, mischen und bei 400 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Verdünnen Sie die PBMCs bei 2-3 x 106 Zellen/ml im Gefriermedium (fetales Rinderserum (FBS) + 10% Dimethylsulfoxid [DMSO]). Bereiten Sie Cryobank 2D-kodierte Röhrchen vor, indem Sie 1 ml resuspendierte Zellen in jedes Kryoröhrchen geben, sie in eine spezielle Kryobox legen und so schnell wie möglich bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Das Gefriermedium besteht aus FBS mit sterilem 10% DMSO und wird in Aliquots bei −20 °C für bis zu 6 Monate gelagert. Nach dem langsamen Auftauen bei 4 °C muss es innerhalb von 2 Wochen verwendet werden.

7. Plasmaprobenentnahme

  1. Sammeln Sie das Blut des Patienten in 6-ml-Vakutainern, die das Gerinnungshemmer Na 2 EDTA (7,2 mg, sprühgetrocknet) enthalten. Zentrifugieren Sie den Staubsauger mit Vollblut bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um das Plasma zu trennen.
  2. Entfernen Sie die obere Plasmaschicht mit einer 3-ml-Pasteur-Pipette, geben Sie sie in ein steriles konisches 15-ml-Sterilröhrchen und zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um kontaminierende Blutzellen zu entfernen. Übertragen Sie das Plasma in 1 ml Cryobank 2D-codierte Röhrchen.
  3. Registrieren Sie die Aliquots in der Biobank-Software, legen Sie sie auf eine bestimmte Barcode-Platte und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank (−80 °C), um eine konstante Temperatur zu gewährleisten.

8. Probenentnahme für Stuhl und Wangenschleimhautabstrich

  1. Sammeln Sie Kot und Wangenschleimhautabstriche in 15-ml-Röhrchen, die die folgende spezifische Lösung enthalten: 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 10 mM EDTA, pH 7,5.
  2. Registrieren Sie die Röhrchen in der Biobank-Software. Beschriften Sie die Röhrchen mit den Biobank-Codes.
  3. Bewahren Sie den Kot und die Wangenschleimhautabstriche bei 4 °C im Biobankkühlschrank auf.

9. Gewebeaufbereitung

  1. Lassen Sie Gewebeproben von einem Pathologen untersuchen, um festzustellen, ob das Material, das für diagnostische Verfahren nicht erforderlich ist, für Forschungszwecke ausreicht.
    HINWEIS: Wenn das Gewebevolumen weniger als 1,5 mm3 beträgt, wird es entweder in OCT gelagert oder als frische Probe (A) bereitgestellt, die mit einer bestimmten Forschungsanfrage verknüpft ist.
  2. Wenn möglich, sammeln Sie auch das nicht-pathologische Gegenstück (NP) des pathologischen Gewebes (P). Legen Sie die Proben in sterile Zellkultur-Petrischale, die als P und NP gekennzeichnet sind (Abbildung 5). Halten Sie das Gewebe auf dem Eis bei 4 °C und teilen Sie es in jeweils drei Teile (A, B und C), wenn genügend Material vorhanden ist.
    1. Frische Gewebeproben (A): Legen Sie frische Aliquots von P - und NP-Gewebe in Röhrchen mit dem entsprechenden Kulturmedium, das in jedem spezifischen Protokoll definiert ist, und senden Sie sie an externe Forschungseinheiten (z. B. Forschungslabors).
    2. OCT-Gewebeproben (B): Legen Sie frische Aliquots von P - und NP-Gewebe in Kryoformen, füllen Sie sie mit OCT-Harz (10,24% Polyvinylalkohol, 4,26% Polyethylenglykol und 85,5% nicht reaktive Inhaltsstoffe) und legen Sie sie sofort in eine Schockfrostapparatur bei −80 °C.
      HINWEIS: Bei −80 °C braucht OCT-eingebettetes Gewebe 60-150 s, um einzufrieren.
    3. Gewebeproben (C): Legen Sie die restlichen Gewebeproben in Cryobank 2D-kodierte Röhrchen in den Flash-Freeze-Apparat.
  3. Lagern Sie die Platten bei −80 °C.
    HINWEIS: Führen Sie für jedes eingefrorene OCT-Aliquot vor der Verteilung und seiner Verwendung einen Qualitätstest durch, um eine histologische Bewertung zu erhalten, wie in Abschnitt 11 beschrieben.

Diagramm zur Verarbeitung von Gewebeproben, das das Kryoformen, die LIMS-Registrierung und die Lagerung bei -80 °C zeigt.
Abbildung 5: Biobank-Workflow für Gewebeproben. Abkürzungen: LIMS = Labor-Informations-Management-System; OCT = optimale Schnitttemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

10. Einfrieren von Gewebe

  1. Gefrieren Sie Gewebe schnell in Isopentandämpfen mit einem Flash-Freeze-Gerät. Die Gewebeproben werden 3 min lang bei −120 °C in Isopentan gelegt und in den Kryokonservierungsräumen bei −80 °C gelagert.
    HINWEIS: Es werden zwei Methoden zum Einfrieren von Proben von Tumor und gesundem Gewebe unter Verwendung von Flash-Freeze verwendet, um die Integrität der Nukleinsäuren zu erhalten.

11. Qualitätskontrolle des Gewebes

  1. Bewahren Sie das Kryostatinstrument in einem Kühlcontainer bei einer Temperatur zwischen -20 ° C und -40 ° C auf und schneiden Sie einige Kryoabschnitte aus dem OCT-Block17. Führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E) an der Kryosektion des Gewebesdurch 18. Analysieren Sie die Morphologie des Gewebes unter einem Lichtmikroskop19.
    HINWEIS: Die Profile haben eine geeignete Dicke von 3-12 μm.
    1. Füllen Sie ein spezielles Formular aus (Tabelle 3).

Tabelle 3: Qualitätskontrollform von OCT-eingebetteten und gefrorenen Gewebeschnitten. Abkürzung: OCT = optimale Schnitttemperatur. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

12. Anforderung und Entnahme von Proben zu Forschungszwecken

  1. Gespeicherte Aliquots anfordern:
    1. Besorgen Sie sich ein ausgefülltes Formular mit dem Namen des Forschungsprojekts, dem Hauptforscher (PI), dem Abholdatum und einer kurzen Beschreibung. Führen Sie eine Abfrage in der Softwaredatenbank (DB) aus, wählen Sie das Aliquot aus, generieren Sie eine Abholliste für die Techniker und überprüfen Sie den Barcode für jedes abgerufene Aliquot.
      HINWEIS: Um Proben aus der Biobank zu erhalten, müssen sich Forscher unseres Instituts oder externe Mitarbeiter (gewinnorientiert oder gemeinnützig) mit einem speziellen Formular bewerben, und das Projekt wird von einer technisch-wissenschaftlichen Kommission und der Ethikkommission bewertet.

Ergebnisse

Nach den oben beschriebenen SOPs haben wir von April 2012 bis Dezember 2021 insgesamt 38.446 annotierte biologische Flüssigbiopsien und insgesamt 10.205 Gewebeproben entnommen (Abbildung 6A). Darüber hinaus analysierten wir detailliert die entnommenen Proben aus den Abteilungen Urologie, Gynäkologie, Senologie sowie den Abteilungen Kopf-Hals-, Bauch-Becken- und Thoraxchirurgie. Die höchste Anzahl von Gewebeproben, die wir sammelten, stammten von Brusttumoren (Abbildung 6B,C). Seit 2019 haben wir auch damit begonnen, andere biologische Proben wie Urin, Stuhl und Wangenschleimhautabstriche zu sammeln, nachdem die Nachfrage im Laufe der Jahre deutlich gestiegen ist (Abbildung 6D).

Wie in Abbildung 6A dargestellt, litt die Menge der gesammelten Proben, insbesondere Gewebe, im Zeitraum 2020-2021 unter der COVID-19-Pandemie und der damit verbundenen Verringerung der onkologischen Verfahren. Wichtig ist, dass die wissenschaftliche Arbeit in diesem Zeitraum nicht abgenommen hat, da in den Vorjahren ordnungsgemäß gelagerte und kommentierte Biobankproben verwendet wurden. Die richtige Sammlung biologischer Proben und damit verbundener klinisch-pathologischer Daten ermöglichte es uns, eine gut strukturierte und wettbewerbsfähige retrospektive und prospektive Biobank zu haben. Zu diesem Zweck muss die Auswahl der chirurgischen Probe vom Pathologen durchgeführt werden, um sowohl eine korrekte Diagnose zu gewährleisten als auch die Möglichkeit zu haben, mit geeigneten Gewebeproben zu forschen. In unserer Biobank sind spezifische Arbeitsabläufe fest etabliert und befolgt, so dass wir im Rahmen von Biobanken für die Forschung standardisierte Verfahren anwenden, die der Zertifizierung ISO 9001 entsprechen.

Kumulative Daten zur Entnahme von Gewebe- und biologischen Proben von 2012 bis 2021, dargestellt in mehrlinienigen Diagrammen.
Abbildung 6: Kumulative Bioprobensammlung der Biobank am Europäischen Institut für Onkologie, von 2012 bis 2021. Kumulative Entnahme von (A) Gewebeproben (orange Kurve) und Blut mit Serumproben (blaue Kurve); kumulative Entnahme von (B) Brustgewebeproben (rote Kurve); kumulative Entnahme von (C) Eierstockgewebeproben (grüne Kurve), Prostata (graue Kurve), Lunge (hellblaue Kurve) und Dickdarmgewebeproben (gelbe Kurve). Von 2019 bis 2021 kumulative Sammlung von (D) zusätzlichen biologischen Proben: Kot (blaue Linie), ein Wangenschleimhautabstrich (rosa Linie), Plasma (hellgrüne Linie) und Urin (violette Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Obwohl die Onkologie enorme Fortschritte gemacht hat, bleibt Krebs weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität20. Das Verständnis der Tumorheterogenität, ihrer zeitlichen Entwicklung im Laufe der Zeit und der Ergebnisse einer gezielten Behandlung hängt strikt von einer genauen Datenerhebung im Rahmen der klinischen Routineversorgung ab21. In dieser Hinsicht gewinnt der "Multi-Omics"-Ansatz in der onkologischen prädiktiven Pathologiean Dynamik 22. Die traditionelle gewebebasierte Biomarkerbewertung wird mit mehreren neuen Bioanalyten wie Blut, Plasma, Urin, Speichel und Stuhl integriert 23,24,25,26. Daher sind Biobanken heute als zentrale Infrastrukturen zur Verbesserung der klinischen Praxis anerkannt. Wenn wir auf die Geschichte der Krebsforschung zurückblicken, stellen wir fest, dass die beeindruckendsten und bahnbrechendsten Entdeckungen ohne direkte Untersuchung von Krebsgewebe oder Flüssigbiopsien niemals möglich gewesen wären. Im Laufe der Zeit hat sich die Quelle von Krebsgewebe und die Art der zu untersuchenden Flüssigbiopsie von groben Sektionen, zufälligen "Zufallsbegegnungen" und in einigen Fällen illegalem Handel zu organisierten Krebssammlungen und strategischen modernen Onkologiebanken entwickelt. Die Berücksichtigung vieler ethischer Fragen hat sich sowohl in der Praxis als auch in den wesentlichen Faktoren, die moderne Onkologiebanken von den onkologischen Sammlungen der Vergangenheit unterscheiden, erheblich verändert.

Aufgrund der Fortschritte in der Krebsforschung und der großen Menge an molekularen Informationen, die heute von modernen Technologien bereitgestellt werden, wird es immer offensichtlicher, dass Biobanken, insbesondere in Krebszentren, mit verschiedenen Arten von methodischen Problemen konfrontiert sein können. Unter diesen ist die Technologie zu einer universellen Herausforderung geworden, die eine SOP-Standardisierung und -Harmonisierung immer noch verhindert. Ein weiterer kritischer Aspekt für die Aufrechterhaltung der Kernaktivitäten der Biobank ist eine integrierte LIMS-Software, die in der Lage ist, alle Krankenhaus-IDs und alle kodifizierten klinischen Daten aus der Software des Krankenhauses zu empfangen und automatisch zu verwalten. Es ist bemerkenswert, dass andere wertvolle Software zur Verwaltung von Biobanken und einige Freeware für die Biobankverwaltung 27,28,29,30,31 erworben werden kann. Ein weiterer kritischer Schritt in Biobanken ist die Umsetzung des Beteiligungspaktes für alle Patienten und der rechtlichen und ethischen Vereinbarung, die für die Speicherung klinischer Daten und Bioproben erforderlich ist10,32.

In dieser Hinsicht enthält dieses Protokoll klar definierte Richtlinien, die die Sammlung und Lagerung von Bioproben ohne Zustimmung nicht zulassen. Dies ist auch ein kritischer Punkt, da Patienten ihre Teilnahme auch nach der Lagerung ihrer Proben zurückziehen können. Daher wurden Methoden implementiert, um solche Proben schnell aus dem Biobankensystem zu entnehmen. Bioproben, die von Patienten stammen, die von unserer Biobank rekrutiert werden, folgen strengen Protokollen für die Sammlung und Lagerung. In diesem Zusammenhang wurden einige wichtige Aspekte zur Überwachung dieses Prozesses bewertet und kontinuierlich verbessert. Insbesondere erfordert die ISO9001-Zertifizierung mehrere Leistungsindikatoren, wie z. B. die warme ischämische Zeit, die je nach Gewebequelle für weniger als 30 Minuten oder 60 Minuten aufrechterhalten werden muss. Darüber hinaus werden Flüssigbiopsien und biologische Flüssigkeiten nach standardisierten Protokollen nach strengen Zeitverfahren 15,33,34,35,36 gesammelt.

Spezifische Merkmale sind in den Arbeitsabläufen von Biobanken von großer Bedeutung. Dazu gehören die Anwesenheit eines zertifizierten Pathologen, der die Probenahme des Gewebes aus diagnostischen Gründen garantiert, und die Entnahme von Gewebe für Biobanking in einem Zeitrahmen, der mit einer hohen Qualität der Proben vereinbar ist (ischämische Zeit ist eine wichtige Indikation für einige Arten von Forschung, wie RNA-abhängige Assays, die weniger warme ischämische Zeit erfordern). Darüber hinaus ist die Verwaltung des Platzbedarfs für die Probenlagerung in Biobanken von großer Bedeutung. Die Anzahl der gesammelten Flüssigbiopsien könnte durch das Studiendesign beeinflusst werden. Flüssigbiopsien können häufig sowohl während der präoperativen als auch der Nachbeobachtungsphase entnommen werden, wie in jedem Studiendesign definiert.

Aufgrund von Screening-Kampagnen zur Krebsprävention und der Früherkennung von Tumoren, d.h. kleinen Brusttumoren in frühen Entwicklungsstadien, sowie der Verfügbarkeit minimalinvasiver Operationstechniken hat sich die Anzahl der für die Forschung verfügbaren Gewebeproben reduziert (da die meisten Gewebeproben immer für diagnostische Zwecke verwendet werden). Die Kapazitäten zur Sammlung und Lagerung biologischer Proben haben sich in den letzten Jahren erheblich verbessert. Dies konnte für biologische Flüssigkeiten beobachtet werden, was die erhöhte Kapazität dieser Biobank widerspiegelt, die Forschungsgruppen dieses Instituts bei der wachsenden Nachfrage nach patientenbasiertem annotiertem Material zu unterstützen. Trotz dieser Verbesserungen haben wir einige Einschränkungen für multizentrische Studien erlebt, die eine Koordination zwischen Biobanken aus verschiedenen Teilen der Welt erfordern, die nur durch die Implementierung ähnlicher Verfahren integriert werden können.

Nachdem die meisten ethischen und technischen Fragen im Zusammenhang mit Biobanking, einschließlich der Sammlung aller klinischen und demografischen Informationen, ausgeschlossen wurden, besteht das nächste Ziel darin, die Digitalisierung aller histologischen Präparate und Färbungen für Diagnose- und Forschungszwecke umzusetzen. Dies ist von grundlegender Bedeutung für die nächste Generation von Studien, die von einer vollständig integrierten digitalen Pathologie und Biobank profitieren werden, die zum Standard für die Zukunft werden wird. Nur eine große Reihe von Patienten mit integrierten Daten und digitalen Bildern kann multizentrische, große Studien zur künstlichen Intelligenz (KI) zur Verbesserung der Krebspatientenversorgung vorantreiben. Zusammenfassend glauben wir, dass eine gute Gesundheitsversorgung nicht mit Diagnose und Behandlung endet. Best Practices umfassen die Suche nach Wegen zur kontinuierlichen Diagnose und Verbesserung der Behandlung für jede Krankheit, insbesondere für solche, die die Lebenserwartung oder -qualität stark beeinträchtigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken allen Patienten, die sich in den letzten zehn Jahren durch die Spende ihrer Bioproben aktiv an unseren Forschungsprogrammen beteiligt haben. Ohne sie wäre diese Forschung nicht möglich. Wir danken auch allen Mitarbeitern des IEO, Krankenschwestern, Technikern, Biologen, Ärzten und den Direktoren aller klinischen und Forschungseinheiten. Die Autoren danken Prof. Pier Paolo Di Fiore und Prof. Giancarlo Pruneri für ihre Anleitung. Schließlich widmen wir diese Arbeit Prof. Umberto Veronesi, dem Gründer des IEO, und seinem bahnbrechenden Ansatz zur Integration von Krebsforschung und Patientenversorgung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Blue Max Con Tubes 15 mLFalcon B.D352096
Blue Max Con Tubes 50 mLEuroclone Spa FLC352070
Box mit 81 Positionen für die GewebeaufbewahrungEttore Pasquali Srl.06.0945.00
cf-DNA/cf-RNA KonservierungsgefäßeNorgen Biotek63950Konservierung und Isolierung von cf-DNA und cf-RNA aus einem einzigen Röhrchen, insbesondere Konservierung von cf-DNA/ct-DNA für 30 Tage bei Raumtemperatur und bis zu 8 Tage bei 37 μd; C
Cryomold Standard (25 x 20 x 5 mm)Olympus Italia S.r.l.4557Einweg-Kryomold-Kunststoffformen erzeugen einen gleichmäßig geformten, flachen Probenblock, wenn sie mit O.C.T.
Dimethylsulfoxid-Kunststoffflasche - 1 LVwr International S.R.L.MFCD00002089Es dient dazu, die Rekonstitution des Mediums für die Lagerung von gefrorenen Zellen zu konservieren
Dpbs 1x W/o Ca Und Mg - 500 mLMicrotech SrlTL1006-500MLWaschpufferzelle
Dualfilter T.I.P.S 1.000 µ LEuroclone Spa4809
Dualfilter T.I.P.S 200 & Mikro; LEuroclone Spa4823
Easytrack Barcode-Lesegerät für Einzelröhrchen-Datamatrix Twin Helix SrlTH-ETR44002D-Barcode-Röhrchenleser mit USB-Anschluss
Fötales Rinderserum Herkunft Brasilien S/filMicrotech S.R.LRM10532-500MLAuftauen bei +4 &Grad; C, in der Regel zwei Tage lang, und sobald es geschmolzen ist, beginnt die Dekomplementation bei 56 & Grad; C für 45 min
Auf Zimmertemperatur abkühlen lassen und aliquotieren. Frieren Sie sie wieder auf -20 & Grad ein; C, und denken Sie daran, sie jedes Mal aufzutauen, wenn die Aliquots benötigt werden
Ficoll Paque Plus (ge) 6 x 500 mLEuroclone SpaGEH17144003Ficoll ist ein Medium für Dichtegradient, Es ist steril und gebrauchsfertig. Es dient dazu, mononukleäre Zellen aus peripherem Blut, Knochenmark und Nabelschnurblut zu gewinnen.
Fixierlösung Killik von 100 mL (OCT)Bio-optica Milano S.p.a.05-9801Geleinschlussmedium, das das wasserlösliche Gewebe (z.B. Biopsien, Frusteln) bei Kälte verfestigt.
Milestonen.a.Gefriergerät
Serie Forma 8600 Gefriertruhen (Temperaturbereich: -50 &Grad; C bis -86 &Grad; C) 85 LiterThermo Fisher Scientific Srl803CVOrizzontal-Gefrierschrank
Isopentane  500mL Vwr International S.R.L.24872260Flüssigkeit in der FLASH-FREEZE  Kamera zum Einfrieren enthalten 
Nautilus Lims SoftwareThermo Scientific™n.a.DieSoftwareimplementierung ist in der Lage, die biologischen Proben aller Patienten zu verfolgen. Erhält während der Registrierung aufgrund der Integration mit IEO-Betriebssystemen automatisch persönliche und klinische Informationen. Nautilus ist über drei IEO-Betriebssysteme in den Webdienst integriert: BAC - IEO-Zentralregister mit persönlichen Informationen, wHospital - Krankenakte 
Pasteurpipette 10 mL  Euroclone S.p.A.CC4488
Pasteurpipette 3 mLEuroclone SpaAPT1502
PATHOXDedalus ItaliTesi Elettronica e Sistemi Informativi S.p.A.a S.p.A.n.v.  PATHOX - Managementsystem für die Pathologie, in dem mehrere Faktoren für die Biobank registriert werden, wie z.B. die histologischen Proben, die zugehörigen Diagnosen und Biomarker
Petrischale, Polystyrol - Größe 100 mm x 20 mm, schiebbarEuroclone SpaFLC353003
Set mit 4 Adaptern 19 x 5/7 mL vacThermo Fisher Scientific Srl75003680
Set mit 4 Adaptern 4 x 50 konischThermo Fisher Scientific Srl75003683
Set mit 4 Adaptern 9 x 15 mL konischThermo Fisher Scientific Srl75003682
Einweg-Objektträger zum Zählen von ZellenBiosigma S.P.A.347143/001Speziell für die individuelle Zellzählung
verwendet Stempel Freezerbondz für Gewebeboxen, stickstoff-flüssig , H 9,53 mm x L 25,40 mmTwin Helix SrlTHT-152-492-3
Thermo Scientific  Ultratiefkühlschränke der TSX-Serie (-50 &Grad; C bis -86 &Grad; C) 949 LiterThermo Fisher Scientific SrlTSX70086VVertikaler Gefrierschrank
Thermo Scientific Kühlzentrifuge SL16RThermo Fisher Scientific Srl75004030
Etiketten für Taschentuchboxen in PermanentTwin Helix SrlTHT-199-482-3
Tuerks SolutionMerck Life Science S.R.L.1092770100In der Lichtmikroskopie wird es speziell als Färbung für Leukozyten
TX-400 Rotor TX-400 schwingende Eimer holThermo Fisher Scientific Srl75003181
Weiße Box zur AufbewahrungBio Optica07-7300
wHospital SoftwarewHealth Lutech Groupn.a. verwendet.wHospital - System zur Verwaltung von Krankenakten mit persönlichen Informationen, Verwaltungsfällen und der Einverständniserklärung der Patienten
verwendet werden.

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