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Methodenartikel

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

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DOI:

10.3791/63953

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24. Mai 2022

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung von lentiviralen Partikeln für die Abgabe von Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) sowohl an humane embryonale Stammzellen (hESCs) als auch an neurale Vorläuferzellen (NPCs), die von hESCs mit hoher Effizienz gewonnen werden. Lentivirale Partikel wurden durch Co-Transfizierung von HEK293T-Zellen unter Verwendung von Eintrittsvektoren (mit shRNAs) zusammen mit Verpackungsplasmiden (pAX und pMD2.G) unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) erzeugt. Viruspartikel wurden mittels Ultrazentrifugation konzentriert, was zu durchschnittlichen Titern über 5 x 107 führte. Sowohl hESCs als auch NPCs konnten mit diesen lentiviralen Partikeln mit hoher Effizienz infiziert werden, wie die Puromycin-Selektion und die stabile Expression in hES-Zellen sowie die vorübergehende GFP-Expression in NPCs zeigen. Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse eine signifikante Verringerung der Expression von Genen, auf die shRNAs abzielen. Darüber hinaus behielten die Zellen ihre Pluripotenz sowie ihr Differenzierungspotenzial bei, was durch ihre anschließende Differenzierung in verschiedene ZNS-Linien belegt wird. Das aktuelle Protokoll befasst sich mit der Abgabe von shRNAs; Der gleiche Ansatz könnte jedoch für die ektopische Expression von cDNAs für Überexpressionsstudien verwendet werden.

Einleitung

Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen werden, sind pluripotent und können unter In-vitro-Bedingungen in Abhängigkeit von äußeren Faktoren in verschiedene Zelltypen differenziert werden 1,2. Um das Potenzial von hES-Zellen voll auszuschöpfen, ist es unerlässlich, schnelle und zuverlässige Genabgabemethoden für diese Zellen zu haben. Herkömmlicherweise können die verwendeten Techniken grob in zwei Arten eingeteilt werden: nichtvirale und virale Gen-Delivery-Systeme 3,4. Die am häufigsten verwendeten nichtviralen Genabgabesysteme sind Lipofektion, Elektroporation und Nukleofektion. Nichtvirale Verabreichungssysteme sind vorteilhaft wegen weniger Insertionsmutationen und einer Gesamtabnahme der Immunogenität 5,6. Diese Methoden führen jedoch zu einer geringen Transfektionseffizienz und einer kurzen Dauer der transienten Genexpression, was eine große Einschränkung für Langzeitdifferenzierungsstudien darstellt7. Elektroporation führt zu besseren Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Lipofektion; Es führt jedoch zu mehr als 50% Zelltod 8,9,10. Mit Hilfe der Nukleofektion können das Zellüberleben und die Transfektionseffizienz durch die Kombination von Lipofektion und Elektroporation verbessert werden, aber der Ansatz erfordert zellspezifische Puffer und spezielle Ausrüstung und wird daher für skalierte Anwendungen ziemlich kostspielig11,12.

Im Gegensatz dazu haben virale Vektoren verbesserte Transfektionseffizienzen sowie eine insgesamt geringe Zytotoxizität nach der Transduktion gezeigt. Darüber hinaus werden die gelieferten Gene stabil exprimiert und machen diese Methode daher ideal für Langzeitstudien13. Zu den am häufigsten verwendeten viralen Vektoren für die Genabgabe in hES-Zellen gehören lentivirale Vektoren (LVS), die eine Transduktionseffizienz von mehr als 80% unter Verwendung von Viruspartikeln mit hohem Titerergeben können 14,15. Lipofektion und CaPO4-Fällung gehören zu den am häufigsten verwendeten Methoden, um HEK293T-Zellen oder seine Derivate mit Gentransfervektoren zusammen mit Verpackungsplasmiden vorübergehend zu transfektieren, um lentivirale Partikelzu erhalten 16. Obwohl die Lipofektion zu einer guten Transfektionseffizienz und einer geringen Zytotoxizität führt, wird die Technik durch ihre Kosten behindert, und eine Skalierung auf lentivirale Partikel mit hohem Titer wäre sehr kostspielig. Die CaPO4-Fällung führt zu relativ ähnlichen Transfektionseffizienzen wie bei der Lipofektion. Obwohl kostengünstig, führt die CaPO 4-Fällung zu einem signifikanten Zelltod nach Transfektionen, was es schwierig macht, Batch-to-Batch-Variationen zu standardisieren undzu vermeiden 17. In diesem Szenario ist die Entwicklung einer Methode, die eine hohe Transfektionseffizienz, eine geringe Zytotoxizität und Kosteneffizienz bietet, entscheidend für die Herstellung von lentiviralen Partikeln mit hohem Titer, die in hES-Zellen verwendet werden sollen.

Polyethylenimin (PEI) ist ein kationisches Polymer, das HEK293T-Zellen mit hoher Effizienz ohne viel Zytotoxizität transfizieren kann und im Vergleich zu lipofektionsbasierten Methoden vernachlässigbare Kosten verursacht18. In dieser Situation kann PEI für skalierte Anwendungen der LVS-Produktion mit hohem Titer durch die Konzentration von lentiviralen Partikeln aus Kulturüberständen unter Verwendung verschiedener Techniken verwendet werden. Der vorgestellte Artikel beschreibt die Verwendung von PEI zur Transfizierung von HEK293T-Zellen und die lentivirale Vektorkonzentration mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen. Mit dieser Methode erhalten wir regelmäßig Titer weit über 5 x 107 IE / ml mit geringen Variationen. Die Methode ist einfach, unkompliziert und kostengünstig für skalierte Anwendungen zur Genabgabe an hES-Zellen und von hESCs abgeleitete Zellen.

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Protokoll

1. Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI- oder Lipofectamine 3000-Reagenz

  1. Kultur HEK293T-Zellen in DMEM + 10% FBS + 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21% O2, bis sie zu 90% konfluent sind, bevor sie zur Transfektion ausgesät werden. Verwenden Sie eine relativ niedrige Passageanzahl von Zellen für eine Virusproduktion mit hohem Titer (idealerweise weniger als P30).
  2. Samen Sie 4 x 106 Zellen in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium in einer 100 mm Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.
  3. Verdünnen Sie für jede Transfektion die Plasmid-DNA (1 mg/ml Vorräte) in 1 ml serumfreiem DMEM-Medium in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen unter Verwendung des folgenden Verhältnisses von Eintritts- und Verpackungsplasmiden:
    Eintrittsvektor = 10 μg
    psPAX2,0 = 7,5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Wirbeln Sie für 10 s und drehen Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um es zu sammeln.
  5. Geben Sie 70 μL (1 mg/ml Stammlösung) PEI in die Röhre und wirbeln und drehen Sie sie kurz wie oben beschrieben, um sie zu sammeln. Das verwendete PEI-Volumen basiert auf einem Verhältnis von 1:3 aus Gesamt-DNA (μg):P EI (μg).
  6. Für die Lipofectamin-basierte Transfektion verdünnen Sie die oben genannten Vektoren in 500 μL serumfreier DMEM-Medien, die 45 μL Reagenz P enthalten, das im Kit enthalten ist, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
  7. Verdünnen Sie 70 μL Reagenz L, das im Kit enthalten ist, mit 500 μL serumfreien DMEM-Medien und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
  8. Kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen.
  9. Tropfenweise 1 ml DNA/PEI oder 1 ml DNA/Lipofectamin-Komplexe in die Platte gebende Zellen geben und 6 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21%O2 inkubieren.
  10. Nach 6 h auf frische, vollständige Wachstumsmedien (10 ml) umstellen und die Zellen mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O 2 in den befeuchteten Inkubator zurückbringen.

2. LVS-Sammlung und Ultrazentrifugation

  1. Nach 2 Tagen Transfektion sammeln Sie die virushaltigen Medien und überlagern die Zellen erneut mit 10 ml frischen, vollständigen Wachstumsmedien.
  2. Sammeln Sie nach 3 Tagen Transfektion die virushaltigen Medien und kombinieren Sie sie mit den virushaltigen Medien, die zum Zeitpunkt von 2 Tagen gesammelt wurden.
  3. Zentrifugieren Sie den viralen Überstand bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zelltrümmer zu pelletieren.
  4. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm porengroßen Filter mit niedriger Proteinbindung (entweder PES oder SFCA) und lagern Sie ihn bei 4 °C, bis er für die Ultrazentrifugation bereit ist. Der filtrierte Überstand, der lentivirale Partikel enthält, kann 5 Tage lang bei 4 °C gelagert werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust an viralen Titern kommt.
  5. Sterilisieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen, die Becher halten, indem Sie sie 10 min lang mit 70% Ethanol waschen, an der Luft trocknen, schließen und bei 4 ° C aufbewahren.
  6. 36 ml filtrierte Medien, die lentivirale Partikel enthalten, in ein steriles Ultrazentrifugenröhrchen geben.
  7. Füllen Sie 5 ml einer sterilen Stripette mit 4 ml steriler 20%iger Saccharoselösung (hergestellt in PBS) und dosieren Sie sie direkt auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens (UC), das LVS enthält. Es ist wichtig, dass die Saccharoselösung nicht mit dem Medium vermischt wird und einen Gradienten am Boden des Röhrchens bildet.
  8. Balancieren Sie alle Ultrazentrifugenröhrchen mit serumfreien DMEM-Medien, legen Sie sie in die kalten Ultrazentrifugenröhrchen-Haltebecher und schließen Sie die Deckel.
  9. Drehen Sie die Röhrchen bei 125.000 x g für 2 h bei 4 °C.
  10. Nach dem Spin entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie den Inhalt des Röhrchens in einem Behälter mit Bleichmittel umkehren, ohne das Pellet zu stören. Markieren Sie das Pellet, falls sichtbar.
  11. Legen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in ein 50 ml steriles Röhrchen und fügen Sie 200 μL sterile DPBS genau an der Oberseite des Pellets hinzu. Über Nacht ungestört bei 4 °C aufbewahren.
  12. Am nächsten Tag vorsichtig mischen, indem Sie 40x auf und ab pipettieren.
  13. In einer Tischzentrifuge kurz mit 13.000 x g drehen, um Ablagerungen zu pelletieren.
  14. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre und aliquotieren Sie das Viruspräparat als 20 μL Aliquote. Bei −80 °C lagern.
  15. 5 μL des Präparats für virale Titermessungen beiseite legen.

3. LVS-Titermessung für pLKO.1-basierte Vektoren

  1. Bestimmen Sie den Titer von lentiviralen Partikeln mittels einer qPCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  2. Für eine Standardkurve bereiten Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen von Standardkontroll-DNA (im Kit enthalten) vor, indem Sie in jedem Schritt 5 μL DNA in 45 μL nukleasefreiesH2Overdünnen. Verwenden Sie Verdünnungen von 1:100 bis 1:100.000, um eine Standardkurve zu erzeugen.
  3. Richten Sie Reaktionen auf Eis wie folgt in Duplikaten ein:
    2x qPCR Master Mix 10 μL
    Primermischung 2 μL
    Probe oder Standard-DNA 2 μL
    NukleasefreiH2 O6 μL
  4. Führen Sie die qPCR unter Verwendung der im Handbuch des Kits genannten Zyklusbedingungen für insgesamt 35 Zyklen durch.
  5. Zeichnen Sie Zyklusschwellenwerte (Ct) auf der Y-Achse im Vergleich zum Virustiter auf der X-Achse auf.
  6. Generieren Sie eine logarithmische Regression unter Verwendung von vier Standard-Kontroll-DNA-Verdünnungen (1:100 bis 1:100.000), um den unbekannten Virusprobentiter mithilfe einer Trendliniengleichung zu bestimmen.

4. LVS-Titermessung für pll3.7-basierte Vektoren

  1. Samen Sie 1 x 105 HEK293T-Zellen in jeder Vertiefung einer P12-Well-Platte in 1 ml vollständiger Wachstumsmedien 24 h vor Infektionen.
  2. Ergänzen Sie das Medium mit 8 μg/ml Polybren und geben Sie 1 ml in jedes sterile 1,5 ml Röhrchen.
  3. Verdünnen Sie die viralen Partikel mit 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL und 0,1 μL konzentrierten lentiviralen Partikeln in jedem der 1 ml polybrenenhaltigen Medien.
  4. Ersetzen Sie die Medien aus HEK293T-Zellen durch die Medien, die die angegebenen Mengen an lentiviralenPartikeln zusammen mit 8 μg/ml Polybren enthalten, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.
  5. Am nächsten Tag wechseln Sie zu frischen Medien und setzen die Kultur für 72 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O2 fort.
  6. Nach 72 h die Zellen mit PBS waschen, bei 37 °C gemäß dem Protokoll des Herstellers trypsinisieren und in 1 ml PBS resuspendieren.
  7. Führen Sie die FACS-Zellsortierung mit einem Zellsortierer gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Setzen Sie das Gate auf 0% GFP-positive Zellen mit nicht infizierten HEK293T-Zellen und zählen Sie 50.000 Ereignisse für jede Probe, um den Prozentsatz der positiven Zellen für jede virale Verdünnung zu bestimmen.
  8. Verwenden Sie nur die Volumina lentiviraler Partikel, die %GFP-positive Zellen im Bereich von 2% -20% ergeben, um den Titer der lentiviralen Partikel zu berechnen.

5. Infektion von hES-Zellen und stabile Selektion

  1. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS, die in jeder Vertiefung einer 6-Well-Zellkultur-Multiwell-Platte wachsen.
  2. Lösen Sie die Zellen von der Zellkulturplatte mit 1 ml 1x Zelldissoziationsreagenz durch Inkubation bei 37 °C für 5 min.
  3. Sammeln Sie die Zellen in DMEM/F12-Medien und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um das Zellpellet zu sammeln.
  4. Aspirieren, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml und zählen Sie mit einem Hämozytometer.
  5. Machen Sie eine Zellsuspension mit 2 x 105 Zellen / ml vollständiger Wachstumsmedien, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI).
  6. Samen Sie 1 x 10 5 Zellen auf 50x verdünnten kompletten Basalmembran-matrixbeschichteten P24-Well-Platten in 500 μL kompletten Wachstumsmedien und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von5% CO 2 und 21%O2.
  7. Am folgenden Tag hES-Zellen bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 10 mit 8 μg/ml Polybren infizieren und bei 37 °C für 8 h inkubieren.
  8. Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische Wachstumsmedien (-RI) und setzen Sie die Kultur fort, bis die Zellen zu 90% konfluent sind.
  9. Beginnen Sie mit der Puromycin-Selektion (0,8 μg / ml), wenn die Zellen eine Konfluenz von 90% erreichen, was normalerweise 48-72 h nach der Infektion entspricht.
  10. Nachdem die Selektion abgeschlossen ist (normalerweise 4-6 Tage), teilen Sie die stabilen Zellen (1: 4) auf und erweitern Sie die Zellen für die Kryokonservierung und weitere Analyse.

6. Transduktion von H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs)

HINWEIS: NPCs wurden von H9-Zellen unter Verwendung eines Dual-Smad-Hemmungsprotokolls abgeleitet, wie zuvorbeschrieben 19.

  1. Kurz gesagt, behandeln Sie H9-Zellen mit Zelldissoziationsreagenz bei 37 ° C für 5 Minuten, um einzelne Zellen zu erzeugen und in vollständigen Wachstumsmedien zu resuspendieren, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI). Samen auf 1:50 verdünnten Matrigel-beschichteten 6-Well-Zellkulturschalen bei einer Dichte von 60.000 Zellen/cm2 (Tag 0).
  2. Initiieren Sie die Differenzierung, wenn die Zellen eine Konfluenz von 95% -100% erreichen, indem Sie zu 100% KSR-Medien wechseln, die LDN193189 (200 nM) und SB431542 (10 μM) (Tag 1) enthalten.
  3. Wechseln Sie am Tag 2 erneut das Medium mit 100% KSR, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).
  4. Wechseln Sie am Tag 4 der Differenzierung zu einer Mischung aus KSR-Medium (75%) und N2-Medium (25%) mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).
  5. Wechseln Sie von Tag 6 bis Tag 12 schrittweise auf 100% N2, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM), indem Sie das N2-Medium täglich um 25% erhöhen und das Medium alle 2 Tage wechseln.
  6. Kulturtag 12 NPCs in N2:B27 Medien ergänzt um 20 ng/ml bFGF.
  7. Samen Sie 2 x 10 5 Zellen in jeder Vertiefung einer 1:50 verdünnten vollständigen Basalmembranmatrix-beschichteten P6-Platte in 2 ml NPCs-Kulturmedien und inkubieren Sie, damit sich die Zellenanheften können.
  8. Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI 6 in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren.
  9. Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische NPC-Wachstumsmedien.
  10. Wiederholen Sie am nächsten Tag die Infektionen und wechseln Sie das Medium um 8 Uhr.
  11. Bewahren Sie die Zellen vor der Ernte zur weiteren Analyse 72 Stunden lang in Kultur auf.

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Ergebnisse

Nach dem Gentransfer ist unweigerlich eine hohe Lebensfähigkeit von hES-Zellen erforderlich. Trotz der Bemühungen und der Optimierung von Protokollen zur Reduzierung des Zelltods nach der Elektroporation von hES-Zellen wird nach der Elektroporation dieser Zellen immer noch ein Zelltod von mehr als 50% beobachtet, zusammen mit einer niedrigen Transfektionseffizienz20. Der lentiviral vermittelte Gentransfer führt nicht nur zu einer hohen Effizienz des Gentransfers, sondern zeigt auch eine hohe Zelll...

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Diskussion

Die Fähigkeit, Stammzellen für Studien- oder klinische Zwecke genetisch zu verändern, ist sowohl durch die Technologie als auch durch das grundlegende Verständnis der Biologie von hES-Zellen begrenzt. Techniken, die ein signifikantes Potenzial in Maus-ES-Zellen gezeigt haben, wie Liofektion und Elektroporation, sind für hES-Zellen nicht sehr effizient, die für die Genlieferung mit herkömmlichen Methoden notorisch schwierig sind20. Dieser Gedanke hat nicht nur zur Optimierung bestehender Techniken ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der United Arab Emirates University (UAEU), Grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) und # 12R010 (UAEU-AUA Grant) unterstützt. Wir danken Prof. Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts für Stil und Grammatik.

Alle Daten sind auf Anfrage erhältlich.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolInvitrogen31350010
38,5 ml, steril + zertifiziert frei offene dünnwandige ultraklare RöhrchenBeckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGF Rekombinanteshumanes InvitrogenPHG0261
Rinderserumalbumin FRAC VInvitrogen15260037
Corning Matrigel Basalmembranmatrix, LDEV-freiesCorning354234
CyclopamineStem Cell Technologies72074
DMEM-MedienInvitrogen11995073
DMEM Nährstoffmischung F12 Invitrogen11320033
DPBS w/o: Ca und MgPAN BiotechP04-36500
Fötales RinderserumInvitrogen10270106
GAPDH (14C10) Kaninchen mAb AntikörperCST2118S
Reagenz für sanfte ZelldissoziationStammzelltechnologien7174
HyClone nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) 100X LösungGE HealthcareSH30238,01
L Glutamin, 100X Invitrogen2924190090
L2HGDH Polyklonaler AntikörperProteintech15707-1-AP
L2HGDH shRNAMacrogenSeq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kitThermo FisherL3000001
mTesR1 komplettes MediumStammzelltechnologien85850
Neurobasales Medium 1X CTSInvitrogenA1371201
Neuropan 2 Supplement 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 Supplement 50xPAN BiotechP07-07200
Penicillin Streptomycin SOLInvitrogen15140122
pLKO.1 TRC VektorAddgene10878
pLL3.7 Vektor Addgene11795
pMD2.GAddgene12259
Reagenz für Polybrene-InfektionenSigmaTR1003-G
Polyethylenimin, verzweigtSigma408727
psPAX2.0Addgene12260
PurmorphaminTocris4551/10
PuromycinInvitrogen
ROCK-Inhibitor Y-27632
Dihydrochlorid 		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
Trypsin 0,05% EDTA Invitrogen25300062
XAV 939Tocris3748/10
A1113802

Referenzen

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